Summary
במחקר זה פותחה שיטה המאפשרת העברה של הגדרות ניסוי ותבניות ניתוח בין שני ציטומטרים של זרימה בשתי מעבדות לאיתור לימפוציטים בילדים מחוסנים לדלקת המוח היפנית. שיטת התקינה לניסויי ציטומטר הזרימה תאפשר לבצע פרויקטים מחקריים ביעילות במספר מרכזים.
Abstract
מספר גדל והולך של מעבדות צריכות לאסוף נתונים מציטומטרים מרובים של זרימה, במיוחד עבור פרויקטי מחקר המבוצעים על פני מרכזים מרובים. האתגרים בשימוש בשני ציטומטרים של זרימה במעבדות שונות כוללים היעדר חומרים סטנדרטיים, בעיות תאימות תוכנה, חוסר עקביות בהגדרת המכשירים ושימוש בתצורות שונות עבור ציטומטרים שונים של זרימה. כדי לבסס ניסוי ציטומטריית זרימה מתוקננת להשגת עקביות ויכולת השוואה של תוצאות ניסוי על פני מרכזים מרובים, הוקמה שיטת סטנדרטיזציה מהירה וישימה להעברת פרמטרים על פני ציטומטרים שונים של זרימה.
השיטות שפותחו במחקר זה אפשרו העברה של הגדרות ניסוי ותבניות ניתוח בין שני ציטומטרים של זרימה במעבדות שונות לאיתור לימפוציטים בילדים מחוסנים בדלקת המוח היפנית (JE). עוצמת פלואורסצנטיות עקבית התקבלה בין שני הציטומטרים באמצעות חרוזים סטנדרטיים פלואורסצנטיים כדי לקבוע את הגדרות הציטומטר. תוצאות דומות התקבלו בשתי מעבדות עם סוגים שונים של מכשירים. באמצעות שיטה זו, אנו יכולים לתקנן ניתוח להערכת תפקוד החיסון של ילדים שחוסנו ב- JE במעבדות שונות עם מכשירים שונים, להפחית את ההבדלים בנתונים ובתוצאות בין ציטוטמדי זרימה במספר מרכזים, ולספק גישה ישימה להסמכה הדדית של תוצאות מעבדה. שיטת הסטנדרטיזציה של ניסויי ציטומטר זרימה תבטיח ביצוע יעיל של פרויקטי מחקר על פני מרכזים מרובים.
Introduction
הסטנדרטיזציה של ציטומטריית זרימה שימושית להשוואת תוצאות המתקבלות מציטומטרים שונים במעבדות ומרכזי מחקר שונים, ותורמת להכרה הדדית בתוצאות לשיפור יעילות העבודה. מספר גדל והולך של תרחישים דורשים סטנדרטיזציה. במהלך תהליך פיתוח התרופה, סטנדרטיזציה של ציטומטריית זרימה חשובה, שכן בדיקה מפותחת ומתוקפת תתמוך בכל תהליך פיתוח התרופה מניתוח פרה-קליני ועד לניתוח קליני. שיטות ציטומטריות זרימה מועברות לעתים קרובות בין תעשיית התרופות לבין מעבדות משתפות פעולה1. יתר על כן, חיוני לקבל נתונים דומים ממחקרים קליניים רב-מרכזיים. לדוגמה, זרימת עבודה של סטנדרטיזציה פותחה בפרויקט המחקר הקליני הרב-מרכזי למחלות אוטואימוניות מערכתיות כדי לקבל נתונים דומים מציטומטריית זרימה רב-צנטרית2.
הסטנדרטיזציה של שיטות ציטומטריית זרימה היא מאתגרת. האתגרים שנחווים במעבדות שונות מיוחסים למחסור בחומרים סטנדרטיים, בעיות תאימות תוכנה, חוסר עקביות בהתקנת מכשירים, ושימוש בתצורות שונות בין ציטומטרים שונים של זרימה ואסטרטגיות gating שונות בין המרכזים 3,4. לכן, חשוב לבצע ניתוח פער בין מעבדות. יש לבדוק גישה לדוגמה, מערכות איכות, כישורי כוח אדם ותצורת מכשירים כדי להבטיח עמידה בדרישות.
כיום, לילדים שחוסנו בחיסון נגד דלקת המוח היפנית (JE) יש שכיחות מופחתת משמעותית של JE5. ניטור תאי מערכת החיסון ההיקפיים בדם יכול לסייע בהבנת השינויים בחסינות הנרכשת בתיווך התא לאחר החיסון, ובקורלציה בין השינויים בתת-קבוצות לימפוציטים היקפיים בדם לבין השפעות החיסון. בשל היציבות המוגבלת של דגימות דם שלמות, הערכות של יעילות החיסון מבוצעות לעתים קרובות במספר מרכזים. לצורך ניתוח זה, הגדרנו תאי T נאיביים CD8+ או CD4+ כ- CD27+ CD45RA+, תאי T של זיכרון מרכזי (TCM) כ- CD27+ CD45RA-, תאי T של זיכרון אפקט (TEM) כ- CD27- CD45RA-, ותאי T של זיכרון אפקטור ממוין סופי (TEMRA) כ- CD27- CD45RA+. ניתן להפריד תאי CD19+ B לאוכלוסיות המבטאות CD27 לעומת IgD 6,7, תאי B נאיביים מבטאים CD27n תאי זיכרון B (mBCs) ניתנים לזיהוי על סמך ביטוי IgD6, ותאי T רגולטוריים (Tregs) ניתנים לזיהוי כ- CD4+CD25++CD127 נמוך 8. כדי לבסס ניסוי ציטומטריית זרימה מתוקננת להשגת עקביות ויכולת השוואה של תוצאות ניסוי במספר מרכזים, הוקמה שיטת סטנדרטיזציה מהירה וישימה כדי להקל על העברת פרוטוקולים על פני ציטומטרים שונים של זרימה לאיתור לימפוציטים בכל הדם של ילדים שחוסנו ב- JE. שישה ילדים בריאים (בני שנתיים) גויסו מבית החולים לילדים בבייג'ינג, האוניברסיטה הרפואית קפיטל. לאחר קבלת חיסון ראשוני וזריקת דחף בחיסון חי מוחלש JE SA14-14-2 פחות מ-6 חודשים קודם לכן, נאספו דגימות דם היקפיות מהמתנדבים. נתונים דומים מאוד התקבלו ממכשירים שונים בעקבות נהלים סטנדרטיים, אשר מועילים להערכות רב-מרכזיות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
המחקר אושר על ידי ועדת האתיקה של בית החולים לילדים בבייג'ינג, האוניברסיטה הרפואית קפיטל (מספר אישור: 2020-k-85). הסכמה מדעת של נבדקים אנושיים בוטלה כדגימות שיוריות בלבד לאחר שנעשה שימוש בבדיקות קליניות במחקר זה. במחקר זה מעורבות שתי מעבדות. המעבדה המעבירה היא המקום שבו פותחה השיטה הסטנדרטית באמצעות ציטומטר זרימה אחד. הציטומטר במעבדה זו מכונה להלן ציטומטר A. מעבדת שיטות הבדיקה היא המעבדה המקבלת שיטות באמצעות ציטומטר זרימה אחר, והציטומטר במעבדה זו מכונה להלן ציטומטר ב'.
1. איסוף דגימות דם היקפיות והכנת תאים
- איסוף דגימות דם היקפיות (2 מ"ל) מילדים מחוסנים ב- JE וילדים לא מחוסנים בצינורות נוגדי קרישה EDTA-K2 על ידי ניקור סטנדרטי.
- מערבבים את כל דגימת הדם על ידי הפיכת הצינורות פי 10. הוסף 100 μL של דם שלם לצינור 12 מ"מ x 75 מ"מ. הפוך כל מדגם לכפול.
- הוסף 10 μL של חיץ כתמים מבריק (BV buffer) לצינור בגודל 12 מ"מ x 75 מ"מ. הוסף 5 μL של כל נוגדן (CD45, CD3, CD4, CD8, CD127, CD27, CD19, IgD; גורם דילול: 1:20) ו 20 μL של נוגדן (CD25, CD45RA; גורם דילול: 1: 5) למאגר BV. מערבלים בעדינות.
הערה: הנפחים והמידע של ריאגנטים נוגדנים מוצגים בטבלה 1. - מוסיפים את קוקטייל הנוגדנים לצינור עם דגימת הדם המלאה. מערבבים בעדינות ודגרים בטמפרטורת החדר במשך 15 דקות בחושך.
- לדלל את תמיסת השכיבה 10x 1:10 במים מזוקקים כדי להכין תמיסת שכיבה 1x. Lyse דגימות הדם על ידי הוספת 2 מ"ל של 1x פתרון lysing. מערבבים בעדינות ודגרים במשך 10 דקות בחושך בטמפרטורת החדר.
- צנטריפוגה ב 300 × גרם במשך 5 דקות ו decant supernatant.
- השהה מחדש את הגלולה ב 2 מ"ל של 1x PBS, צנטריפוגה ב 300 × גרם במשך 5 דקות, ו decant את supernatant.
- להשעות את הגלולה ב 0.5 מ"ל של 1x PBS ולערבב היטב. יש לאחסן ב-2°C עד 8°C. שלחו את הדגימות לשתי המעבדות לניתוח ציטומטרי זרימה.
הערה: יש לעבד את דגימת הבקרה השלילית ואת הבקרה המוכתמת היחידה בתא בו-זמנית.
2. הכנת חרוזי פיצוי והדברה מוכתמת אחת
- תווית V500-anti-CD45 מוכתם יחיד, APC-H7-anti-CD3 מוכתם יחיד, FITC-anti-CD4 מוכתם יחיד, R718-anti-CD8 מוכתם יחיד, BV605-anti-CD27 מוכתם יחיד, APC-anti-CD45RA מוכתם יחיד, PE-anti-CD25 מוכתם יחיד, BV421-anti-CD127 מוכתם יחיד, BB700-anti-CD19 מוכתם יחיד, PE-CY7-anti-IgD מוכתם יחיד.
- הוסף 100 μL של חיץ מלח חוצץ פוספט (DPBS) של 1x Dulbecco המכיל 1% סרום בקר עוברי (FBS) למבחנה 5 מ"ל פוליסטירן בתחתית עגולה.
- הוסף 50 μL של החרוזים השליליים ו 50 μL של Ig, κ חרוזים נגד עכבר לכל צינור ומערבולת.
- הוסף 2 μL של כל נוגדן מסומן (CD45, CD3, CD4, CD8, CD25, CD127, CD45RA, CD27, CD19, IgD) לצינור מוכתם יחיד. מערבבים את התערובת בעדינות ודגרים במשך 15 דקות בחושך בטמפרטורת החדר (20°C עד 25°C).
- מרחפים מחדש את החרוזים ב 2 מ"ל של 1x PBS, צנטריפוגה ב 300 × גרם במשך 5 דקות, ו decant את supernatant.
- משעה מחדש את החרוזים ב 0.5 מ"ל של 1x PBS ומערבבים היטב. יש לאחסן ב-2°C עד 8°C.
3. שימוש בשמות תצורה זהים על הציטומטרים השונים בשתי מעבדות
- צור תצורה חדשה בתוכנה של ציטומטר A. לחץ על הלחצן Cytometer ובחר View Configurations כדי להציג את חלון התצורה.
- ברשימת התצורה, לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על תיקיית תצורות הבסיס, בחר תיקיה חדשה ושנה את שמה.
- לחץ לחיצה ימנית על תצורת הבסיס ובחר העתק.
- לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על התיקיה החדשה והדבק את תצורת הבסיס כדי ליצור תצורה חדשה. שנה את שם התצורה החדשה ל"העברת שיטה מתוקננת".
- גרור את שם הפרמטר, כגון FITC, מהרשימה פרמטרים אל הגלאי המתאים (530/30).
- ערוך פרמטרים נוספים (PE, BB700, PE-CY7, APC, R718, APC-H7, BV421, V500 ו- BV605) לתצורה החדשה.
- בצע שיטה זו כדי ליצור תצורה חדשה במודל ציטומטר זרימה אחר באותו שם "העברת שיטה מתוקננת". ודא שהתצורה כוללת את אותם פרמטרים עבור כל גלאי.
הערה: כדי לזהות בהצלחה את תבנית הניסוי בשני מודלים שונים של ציטומטר זרימה, ודא שהשם עקבי. - תחת תצורות הציטומטר, השתמש בחרוזי הגדרה ומעקב אחר ציטומטר (CST) כדי להגדיר את קו הבסיס של הציטומטר ולעקוב אחר ביצועי הציטומטר. לחץ על כפתור Cytometer ובחר CST כדי להציג את סביבת העבודה של הגדרת הציטומטר והמעקב.
- הוסף שלוש טיפות (150 μL) של חרוזי התקנה ל 0.5 מ"ל של 1x PBS במבחנה 5 מ"ל פוליסטירן עגול תחתית. מניחים את צינור החרוזים על הציטומטר.
- בחלון Setup Control , בחר Define Baseline, ולחץ על Run.
4. ניסוי סטנדרטיזציה באמצעות ציטומטר A במעבדה המעבירה
- הפעל בדיקת ביצועים באמצעות הגדרת הציטומטר וחרוזי מעקב כדי לוודא שהציטומטר מתפקד היטב.
- בחלון דפדפן התוכנה, לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על הגדרות הציטומטר ובחר הגדרות יישום כדי ליצור גליון עבודה.
- באמצעות דגימה לא מוכתמת, התאם את מתחי צינור מכפיל האור (PMT) של FSC, SSC וכל הפרמטרים הפלואורסצנטיים. FSC: 260; SSC: 460; FITC: 490; PE: 575; BB700: 620; PE-CY7: 640; נגמ"ש: 600; R718: 620; נגמ"ש-H7: 620; כ"ד 421: 466; V500: 420; וכ"ד 605: 505.
- לחץ לחיצה ימנית על הגדרות ציטומטר הניסוי ובחר הגדרות יישום כדי לשמור אותו.
- לחץ על כפתור הניסוי ובחר בתפריט הגדרת פיצוי . לאחר מכן, בחר צור בקרות פיצוי כדי להוסיף בקרות פיצוי באופן אוטומטי.
- רשום נתונים עבור כל חרוזי בקרת הפיצוי.
- לחץ על הניסוי ובחר הגדרת פיצוי. לאחר מכן, חשב את הפיצוי באופן אוטומטי.
- רשום נתונים עבור פקדים המוכתמים בתא יחיד.
- השתמש ב-CD45RA APC כדי לשנות את ערך הפיצוי של R718 ל-15% APC. השתמש ב- CD19 BB700 כדי לשנות את ערך הפיצוי של APC-H7 ל- 14% BB700. השתמש ב- CD8 R718 כדי לשנות את ערך הפיצוי של APC-H7 ל- 60% R718.
- רשום נתונים עבור חרוזי CST.
- צור גליון עבודה כללי של תבנית ערך היעד עבור החרוזים הבהירים של CST.
- באמצעות תרשים FSC/SSC, צייר את שער המצולע עבור החרוזים הבהירים של CST. השג תרשימי היסטוגרמה של 10 תעלות פלואורסצנטיות עבור החרוזים הבהירים של CST: FITC, PE, BB700, PE-Cy7, APC, R718, APC-H7, BV421, V500 ו- BV605. צור שערי מרווחים בתרשימי ההיסטוגרמה. צור את תצוגת הסטטיסטיקה על-ידי הצגת החציון של שערי מרווחי הזמן.
- הפעל את הדגימות על ציטומטר הזרימה; לאסוף סך של 25,000 לימפוציטים.
- צור גליון עבודה כללי של תבנית הניתוח עבור הדגימות.
- השתמש באסטרטגיית gating לדוגמה הבאה:
- באמצעות תרשים נקודות CD45/אזור פיזור צדדי (SSC-A), צייר את שער המצולע כדי לזהות את אוכלוסיית הלימפוציטים השלמה תוך הרחקת פסולת.
- באמצעות התוויית נקודות CD3/CD19, צייר שער מלבני כדי לבחור תאי T מסוג CD3+ ותאי CD19+ B.
- באמצעות תרשים נקודות CD4/CD8, צייר שער מרובע כדי לבחור תאי T מסוג CD4+ או CD8+ (תאים עם פלואורסצנטיות גבוהה עבור סמנים אלה, בהתאמה).
- באמצעות תרשים נקודות CD45RA/CD27, צייר שער מרובע כדי לחלק תאי T CD8+ או CD4+ לתאי T נאיביים (CD27+CD45RA+), TCM (CD27+ CD45RA-), T EM (CD27-CD45RA-) ותאי TEMRA (CD27-CD45RA+).
- באמצעות תרשים נקודות CD25/CD127, צייר שער מרובע כדי לחלק תאי CD4+ T לתאי Treg (CD4+CD25++CD127 נמוך).
- באמצעות תרשים נקודות CD27/IgD, צייר שער מרובע כדי לחלק תאי CD19+ B לתאי B נאיביים (CD27-IgD+) ותאי זיכרון B (CD27+IgD-).
- שמור את תבנית הניסוי בציטומטר A.
- השתמש בתקליטור כדי לייצא את התבנית הניסיונית.
5. העברת תבנית הניסוי לציטומטר B במעבדת שיטת הבדיקה
הערה: תבנית הניסוי כוללת הגדרות מכשיר, תבנית ניתוח ותבנית ערך היעד של עוצמת פלואורסצנטיות חציונית (MFI).
- בצע בדיקת ביצועים באמצעות חרוזי CST כדי לוודא שהציטומטר מתפקד היטב.
- ייבא את תבנית הניסוי וצור ניסוי עבור ציטומטר B באמצעות התבנית.
- השתמש באותה כמות של חרוזי CST כדי להתאים את מתחי הפרמטרים הפלואורסצנטיים עבור כל ערוץ פלואורסצנטי כך שיתאים למכשיר MFI הקודם.
הערה: ערכי ה- MFI משתנים בתוך ±5% (ה- MFI של חרוזים בהירים לפני ואחרי העברה מוצג בטבלה 2). - כוונן את המתח עבור FSC באמצעות הדגימה הלא מוכתמת, במידת הצורך.
- לחץ לחיצה ימנית על הגדרות הציטומטר הניסיוני ובחר הגדרות יישום כדי לשמור את הגדרות היישום.
- השתמש ב-CD45RA APC כדי לשנות את ערך הפיצוי של R718 ל-15% APC. השתמש ב- CD19 BB700 כדי לשנות את ערך הפיצוי של APC-H7 ל- 24% BB700. השתמש ב- CD8 R718 כדי לשנות את ערך הפיצוי של APC-H7 ל- 60% R718.
- הפעל את הדגימות על ציטומטר הזרימה; לאסוף סך של 25,000 לימפוציטים.
6. עקביות בין תוצאות הניסוי שהתקבלו על שני הציטומטרים
- הערך את ההבדלים בתת-קבוצות לימפוציטים בין מכשירים באמצעות ANOVA חד-כיווני (p < 0.05).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
איור 1 מציג גליון עבודה כללי של תבנית ערך היעד עבור החרוזים הבהירים של CST. באמצעות התוויית FSC/SSC, משורטט שער מצולע לבחירת החרוזים הבהירים של CST. חלקות היסטוגרמה של 10 תעלות פלואורסצנטיות התקבלו עבור חרוזים בהירים CST: FITC, PE, BB700, PE-Cy7, APC, R718, APC-H7, BV421, V500 ו- BV605. ערך היעד עבור כל פרמטר מוצג על-ידי הצגת החציון בתוך שערי ההיסטוגרמה בטבלה 2. צילומי המסך של תבניות והגדרות פרמטרים בתוכנה של ציטומטר A וציטומטר B מוצגים באיור משלים S1.
איור 2 מראה את חלקות הנקודות של דגימה אחת בין שני המכשירים לאחר סטנדרטיזציה של מכשירים. הנתונים מראים עקביות בין מכשירים שונים באמצעות תבנית ניתוח אוטומטית. התוצאות משש דגימות הושוו בין שני דגמי מכשירים שונים בטבלה 3. בשתי המעבדות לא נמדדו הבדלים משמעותיים באחוזים של 15 תת-קבוצות לימפה. תוצאות אלה מראות כי נתונים דומים מאוד התקבלו בעקבות השיטה הסטנדרטית. האחוזים של 15 תת-קבוצות לימפה ממכשירים שונים מוצגים בטבלה משלימה S1.
איור 1: תבנית גליון עבודה גלובלית עבור חרוזים בהירים של CST. חרוזים בהירים של CST מגודרים בתרשים FSC לעומת SSC. חלקות היסטוגרמה של 10 תעלות פלואורסצנטיות מוצגות עבור חרוזים בהירים CST. שערי מרווח נוצרים כדי לכלול את אוכלוסיית החרוזים הבהירים של חרוזי CST עבור כל גלאי פלואורסצנטי. קיצורים: FSC-A = אזור פיזור קדמי; SSC-A = אזור פיזור צד. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: השוואה של חלקות נקודות מדגימה אחת בין שני המכשירים. (A) תרשים נקודות CD45/SSC-A משמש לשער לימפוציטים. (B) תרשים נקודות CD3/CD19 משמש לשער תאי T CD3+ ותאי CD19+ B. (C) תרשים נקודות CD4/CD8 משמש לזיהוי תאי CD3+ CD8+ T ו- CD3+ CD4+ T. (D) תרשים נקודות CD25/CD127 משמש לשער תאי Treg (CD4+CD25++CD127נמוך). (E) תרשים נקודות CD45RA / CD27 עבור תאי T CD4+ משמש לשער נאיבי (CD27 + CD45RA+), TCM (CD27+ CD45RA-), TEM (CD27- CD45RA-), ו- TEMRA (CD27-CD45RA+). (F) תרשים נקודות CD45RA/CD27 עבור תאי T CD8+ משמש לשער נאיבי (CD27+CD45RA+), TCM (CD27+ CD45RA-), TEM (CD27- CD45RA-), ו- TEMRA (CD27-CD45RA+). (G) תרשים נקודות CD27/IgD משמש לשער תאי B נאיביים (CD27- IgD+) ותאי זיכרון B (CD27+ IgD-). אסטרטגיית הגאטינג לקוחה מ-Zhang et al.7. קיצורים: SSC-A = אזור פיזור צד; TCM = תאי T זיכרון מרכזיים; TEM = תאי T של זיכרון משפיע; TEMRA = תאי T בעלי השפעה דיפרנציאלית סופנית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
| יעד נוגדנים | פלואורוכרום | שיבוט | מס' קטלוגי | נפח לבדיקה (μL) |
| CD4 | FITC | SK3 | 566320 | 5 |
| CD25 | PE | M-A251 | 555432 | 20 |
| CD19 | BB700 | היב19 | 745907 | 5 |
| יגד | PE-CY7 | IA6-2 | 561314 | 5 |
| CD45RA | נגמ"ש | HI100 | 550855 | 20 |
| CD8 | ₪178 | G42-8 | 751953 | 5 |
| CD3 | APC-H7 | SK7 | 560176 | 5 |
| CD127 | BV421 | HIL-7R-M21 | 562436 | 5 |
| CD45 | V500 | HI30 | 560777 | 5 |
| CD27 | BV605 | L128 | 562656 | 5 |
טבלה 1: נפחי נוגדנים ומידע פלואורופור מצומד לניתוחים ציטומטריים של זרימה. קיצורים: BV = סגול מבריק; BB = כחול מבריק; FITC = isothiocyanate fluorescein; PE = phycoerythrin; APC = allophycocyanin.
| MFI של חרוזים בהירים | |||
| ערוץ | ציטומטר A | ציטומטר B | %Diff ב- MFI |
| FSC | 22,133 | 22,689 | 2.51% |
| SSC | 1,51,361 | 1,51,261 | -0.07% |
| FITC | 9,956 | 9,964 | 0.08% |
| PE | 30,877 | 31,264 | 1.25% |
| BB700 | 19,265 | 19,440 | 0.91% |
| PE-CY7 | 14,406 | 14,375 | -0.22% |
| נגמ"ש | 64,494 | 64,340 | -0.24% |
| ₪178 | 41,271 | 41,456 | 0.45% |
| APC-H7 | 90,666 | 90,837 | 0.19% |
| BV421 | 9,882 | 9,776 | -1.07% |
| V500 | 19,680 | 19,425 | -1.30% |
| BV605 | 10,794 | 10,356 | -4.06% |
טבלה 2: MFI של חרוזים בהירים לפני ואחרי ההעברה. קיצורים: MFI = עוצמת פלואורסצנטיות ממוצעת; BV = סגול מבריק; BB = כחול מבריק; FITC = isothiocyanate fluorescein; PE = phycoerythrin; APC = allophycocyanin.
| ממוצע האחוזים | ממוצע האחוזים | ||
| ציטומטר A (n=6) | ציטומטר B (n=6) | ערך P | |
| תאי T | 71.30 | 74.73 | 0.19 |
| תאי T CD4+ | 48.63 | 47.75 | 0.82 |
| CD4+ Tס"מ | 30.68 | 28.20 | 0.06 |
| CD4+ נאיבי | 57.60 | 58.25 | 0.90 |
| CD4+ TEM | 8.98 | 10.52 | 0.51 |
| CD4+ TEMRA | 2.73 | 3.07 | 0.81 |
| טרג | 9.07 | 8.57 | 0.74 |
| תאי T CD8+ | 40.63 | 40.45 | 0.98 |
| CD8+ Tס"מ | 16.83 | 14.78 | 0.75 |
| CD8+ נאיבי | 49.08 | 47.70 | 0.80 |
| CD8+ TEM | 6.35 | 8.20 | 0.51 |
| D4+ TEMRA | 27.75 | 29.30 | 0.77 |
| תאי B | 13.88 | 13.20 | 0.84 |
| נאיבי ב | 67.88 | 70.38 | 0.84 |
| זיכרון ב' | 11.88 | 11.80 | 0.95 |
טבלה 3: הערכת הבדלים בתת-קבוצות לימפוציטים בין מכשירים. P > 0.05 מצביע על כך שאין הבדל משמעותי. קיצורים: TCM = תאי T זיכרון מרכזיים; TEM = תאי T של זיכרון משפיע; TEMRA = תאי T של זיכרון אפקט ממוין סופני.
טבלה משלימה S1: אחוזים של תת-קבוצות לימפוציטים בשש דגימותממכשירים שונים. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
איור משלים S1: צילומי המסך של תבניות והגדרות פרמטרים בתוכנה של ציטומטר A וציטומטר B. (A) קובץ XML של תבניות. (B) צילומי מסך של תבניות. (C) הגדרות הפרמטרים בציטומטר A. (D) הגדרות הפרמטרים בציטומטר B. אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
אימונופנוטיפ של תת-קבוצות לימפוציטים היקפיים בדם יכול לעזור להבין את השינויים בחסינות הנרכשת התאית-תיווכת לאחר החיסון בילדים. ביישומים קליניים, מתרחשים מצבים בלתי צפויים, כגון כשל בזיהוי דגימות בזמן או החלפת ציטומטר זרימה; לכן, יש צורך בשיטות סטנדרטיות מהירות המאפשרות מעבר בין ציטומטרים של זרימה במעבדות שונות 9,10,11. כאן, אנו מתארים שיטה סטנדרטית מהירה כדי להבטיח תוצאות עקביות בין מכשירים שונים. השיטה המתוקננת שימשה לניטור תאי מערכת החיסון בדם ההיקפי של ילדים לאחר החיסון, ותוצאות עקביות התקבלו בשתי מעבדות. השיטה הסטנדרטית נקבעה בין BD Canto ו- LSRFortessa. הפרוטוקול מתאים גם ל- FACSCelesta, FACSymphony A5 ו- FACSAria II. בהשוואה לשיטות תקינה אחרות2,3, שיטה סטנדרטית זו אינה דורשת שימוש בתוכנת צד שלישי כדי להשיג את עקביות הנתונים. היא משתמשת רק במאפיינים של תוכנת Diva כדי ליצור מודול תבנית המכיל מיקום ערך יעד וניתוח אוטומטי כדי לממש את שיטת ההעברה בין מכשירים שונים, ומפחיתה את הדרישה לניתוח נתונים. השיטה חוסכת זמן, קלה לתפעול ואינה דורשת פיתוח של כלי גטינג אוטומטי.
סטנדרטיזציה של פרוטוקול ציטומטריית זרימה במחקר זה מושגת על ידי יצירת תבנית ניסוי במכשיר אחד הכוללת הגדרות ציטומטריה, ניתוח נתונים אוטומטי וגליון עבודה של מיקום יעד. לאחר מכן, המכשירים האחרים משתמשים בחרוזי CST כדי להתאים את מתחי הפרמטרים כדי להגיע לערך היעד. יש לשקול מספר תכונות חשובות כדי להשלים סטנדרטיזציה מוצלחת בין מכשירי ציטומטר זרימה שונים. ראשית, השיטה הסטנדרטית דורשת מהמכשירים להשתמש באותה מערכת תוכנה, כך שניתן יהיה לשתף את קובץ ה-XML של תבנית הניסוי בין תוכנות המכשירים. שנית, לשני המכשירים צריך להיות שם זהה לתצורה, וגם הפרמטרים צריכים להיות בעלי שם זהה. שלישית, יש לאסוף את חרוזי CST בתנאי המתח שצוינו ללא פיצוי כערכי יעד. בהתחשב בעוצמות הלייזר השונות וברגישויות PMT של מכשירים שונים, יש צורך להשתמש בחרוזי CST מאותו מספר לוט כדי להתאים את פרמטרי המתח, בהתאם לערכי היעד במכשירים אחרים, ולהבטיח שערך ה- MFI נמצא בטווח של ±5%. רביעית, הערכות בקרת איכות יומיות של מכשירים הן גם חשובות מאוד. אם מכשיר אחד נכשל בהערכה, יש לנקות את תא הזרימה לבועות או לעבור כיול לייזר. לבסוף, כדי לצמצם את ההבדלים הנגרמים על ידי הליכי הכנה, הדגימות צריכות להיות מוכנות באופן זהה כאשר נערכים מחקרים רב-מרכזיים גדולים כאלה, בנוסף להעברת הגדרות כדי שיוכלו לנתח את הדגימות במעבדות שונות. עם זאת, עדיין יש מקום לאופטימיזציה של פאנלים לזיהוי טוב יותר של תאי זיכרון B בפרוטוקול זה. התדירות של תאי זיכרון B נמוכה יחסית אצל ילדים בני שנתיים, וביטוי CD27 על פני השטח של תאים אלה מפוזר. פעולה זו עשויה לזהות טוב יותר תאי זיכרון B אם הסמן מוחלף בפלואורסצאין בהיר יותר מאשר BV605.
עם זאת, יש לציין כמה מגבלות. ראשית, שני ציטומטרים של זרימה שימשו לסטנדרטיזציה בניסוי זה; מודלים נוספים של מכשירים צריכים להיכלל בניסויים הבאים. שנית, שיטת צביעת פני התא שימשה להבחנה וקביעת תת-קבוצות לימפוציטים ולא כללה זיהוי של ציטוקינים תוך-תאיים נוספים. שלישית, לא השווינו את תוצאות הניסוי עם ובלי תהליך סטנדרטיזציה של שני ציטומטרים של זרימה.
היתרון של שיטה סטנדרטית זו הוא שמכשירים שונים יכולים לשתף את קובץ ה- XML של תבנית הניסוי אם התוכנה זהה. תבנית הניסוי מכילה את תבנית ערכי המטרה הקבועים, וניתן לקבל נתונים רק לאחר התאמת מתחי PMT לערכי היעד בין מכשירים. בנוסף, תבנית הניסוי מכילה גם ניתוח אסטרטגיית שערים אוטומטית. לאחר קבלת הנתונים, מופק דוח הניתוח האוטומטי. הליך זה קל לתפעול ומקטין את ההבדלים בתוצאות הנגרמות על ידי ניתוח ידני. ניתן להשתמש בשיטה סטנדרטית זו כדי להעריך שינויים בתת-קבוצות לימפוציטים בכל הדם של ילדים מחוסנים ב- JE באמצעות מכשירים שונים במעבדות, ולהשיג את המטרה להבטיח שפרויקט המחקר מבוצע באופן עקבי במספר מרכזים. במחקר זה, אנו שואפים לבחון את ההמרה של השיטה הסטנדרטית על ידי צביעת פני השטח, והצלחתה תניח בסיס לפרקטיקה של צביעה תוך תאית מאוחרת יותר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים כי אין ניגודי עניינים.
Acknowledgments
RW נתמך על ידי קרן מדעי הטבע של בייג'ינג, סין (מס '7222059), הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (מס '82002130), XZ נתמך על ידי קרן החדשנות CAMS למדעי הרפואה (מס '2019-I2M-5-026).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD CompBeads Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control Compensation Particles Set | BD | 552843 | compensation |
| BD FACSCanto | BD | FACSCanto | flow Cytometry A in the transferring lab |
| BD FACSDiva CS&T Research Beads | BD | 655051 | define flow cytometer baseline and track cytometer performance |
| BD Horizon BV421 Mouse Anti-Human CD127 | BD | 562436 | Fluorescent antibody |
| BD Horizon BV605 Mouse Anti-Human CD27 | BD | 562656 | Fluorescent antibody |
| BD Horizon V500 Mouse Anti-Human CD45 | BD | 560777 | Fluorescent antibody |
| BD LSRFortessa | BD | LSRFortessa | flow Cytometry B in the test method lab |
| BD OptiBuild BB700 Mouse Anti-Human CD19 | BD | 745907 | Fluorescent antibody |
| BD OptiBuild R718 Mouse Anti-Human CD8 | BD | 751953 | Fluorescent antibody |
| BD Pharmingen APC Mouse Anti-Human CD45RA | BD | 550855 | Fluorescent antibody |
| BD Pharmingen APC-H7 Mouse Anti-Human CD3 | BD | 560176 | Fluorescent antibody |
| BD Pharmingen FITC Mouse Anti-Human CD4 | BD | 566320 | Fluorescent antibody |
| BD Pharmingen PE Mouse Anti-Human CD25 | BD | 555432 | Fluorescent antibody |
| BD Pharmingen PE-Cy7 Mouse Anti-Human IgD | BD | 561314 | Fluorescent antibody |
| Brilliant Staining Buffer Plus | BD | 566385 | Staining Buffer |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810 | Cell centrifugation |
| Centrifuge Tube | BD Falcon | BD-35209715 | 15 mL centrifuge tube |
| CS&T IVD Beads | BD | 662414 | standard beads to setup cytometer settings in different flow cytometer |
| Lysing Solution 10x Concentrate | BD | 349202 | lysing red blood cells |
| Phosphate-buffered Saline (PBS) | Gibco | 10010-023 | PBS |
| Round-bottom test tube | BD Falcon | 352235 | 5 mL test tube |
References
- Cabanski, M., et al. Flow cytometric method transfer: Recommendations for best practice. Cytometry Part B. Clinical Cytometry. 100 (1), 52-62 (2021).
- Le Lann, L., et al. Standardization procedure for flow cytometry data harmonization in prospective multicenter studies. Scientific Reports. 10 (1), 11567 (2020).
- Linskens, E., et al. Improved standardization of flow cytometry diagnostic screening of primary immunodeficiency by software-based automated gating. Frontiers in Immunology. 11, 584646 (2020).
- Glier, H., et al. Standardization of 8-color flow cytometry across different flow cytometer instruments: A feasibility study in clinical laboratories in Switzerland. Journal of Immunological Methods. 475, 112348 (2019).
- Wang, R., et al. The epidemiology and disease burden of children hospitalized for viral infections within the family Flaviviridae in China: A national cross-sectional study. PLOS Neglected Tropical Diseases. 16 (7), e0010562 (2022).
- Ding, Y., et al. Reference values for peripheral blood lymphocyte subsets of healthy children in China. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 142 (3), 970-973 (2018).
- Zhang, L., et al. Detection of polyfunctional T cells in children vaccinated with Japanese encephalitis vaccine via the flow cytometry technique. Journal of Visualized Experiments. (187), e64671 (2022).
- Yu, N., et al. CD4(+) CD25 (+) CD127 (low/-) T cells: a more specific Treg population in human peripheral blood. Inflammation. 35 (6), 1773-1180 (2012).
- Kalina, T. Reproducibility of flow cytometry through standardization: opportunities and challenges. Cytometry Part A. 97 (2), 137-147 (2020).
- Sommer, U., et al. Implementation of highly sophisticated flow cytometry assays in multicenter clinical studies: considerations and guidance. Bioanalysis. 7 (10), 1299-1311 (2015).
- Glier, H., et al. Comments on EuroFlow standard operating procedures for instrument setup and compensation for BD FACS Canto II, Navios and BD FACS Lyric instruments. Journal of Immunological Methods. 475, 112680 (2019).
