Summary
Neste estudo, foi desenvolvido um método para facilitar a transferência de cenários experimentais e modelos de análise entre dois citômetros de fluxo em dois laboratórios para a detecção de linfócitos em crianças vacinadas com encefalite japonesa. O método de padronização para os experimentos de citômetro de fluxo permitirá que os projetos de pesquisa sejam efetivamente conduzidos em vários centros.
Abstract
Um número crescente de laboratórios precisa coletar dados de vários citômetros de fluxo, especialmente para projetos de pesquisa realizados em vários centros. Os desafios do uso de dois citômetros de fluxo em laboratórios diferentes incluem a falta de materiais padronizados, problemas de compatibilidade de software, inconsistências na configuração do instrumento e o uso de diferentes configurações para diferentes citômetros de fluxo. Para estabelecer um experimento padronizado de citometria de fluxo para alcançar a consistência e a comparabilidade dos resultados experimentais em vários centros, um método de padronização rápido e viável foi estabelecido para transferir parâmetros entre diferentes citômetros de fluxo.
Os métodos desenvolvidos neste estudo permitiram a transferência de cenários experimentais e modelos de análise entre dois citômetros de fluxo em diferentes laboratórios para a detecção de linfócitos em crianças vacinadas com encefalite japonesa (JE). Uma intensidade de fluorescência consistente foi obtida entre os dois citômetros usando esferas padrão de fluorescência para estabelecer as configurações do citômetro. Resultados comparáveis foram obtidos em dois laboratórios com diferentes tipos de instrumentos. Usando este método, podemos padronizar a análise para avaliar a função imunológica de crianças vacinadas com JE em diferentes laboratórios com diferentes instrumentos, diminuir as diferenças de dados e resultados entre citômetros de fluxo em múltiplos centros e fornecer uma abordagem viável para a acreditação mútua de resultados laboratoriais. O método de padronização de experimentos de citômetros de fluxo garantirá o desempenho efetivo de projetos de pesquisa em vários centros.
Introduction
A padronização da citometria de fluxo é útil para a comparabilidade dos resultados obtidos de diferentes citômetros em diferentes laboratórios e centros de estudo, e conducente ao reconhecimento mútuo dos resultados para melhorar a eficiência do trabalho. Um número crescente de cenários requer padronização. Durante o processo de desenvolvimento do medicamento, a padronização da citometria de fluxo é importante, pois um ensaio desenvolvido e validado apoiará todo o processo de desenvolvimento do medicamento, desde a análise pré-clínica até a clínica. Os métodos citométricos de fluxo são frequentemente transferidos entre a indústria farmacêutica e os laboratórios colaboradores1. Além disso, é essencial obter dados comparáveis de estudos clínicos multicêntricos. Por exemplo, um fluxo de trabalho de padronização foi desenvolvido no Systemic Autoimmune Diseases Multicenter Clinical Research Project para obter dados comparáveis da citometria de fluxo multicêntrica2.
A padronização dos métodos de citometria de fluxo é um desafio. Os desafios vivenciados entre os laboratórios são atribuídos à falta de materiais padronizados, problemas de compatibilidade de software, inconsistências na configuração do instrumento e ao uso de diferentes configurações entre diferentes citômetros de fluxo e estratégias de gating divergentes entre os centros 3,4. Portanto, é importante realizar uma análise de lacunas entre os laboratórios. O acesso a amostras, os sistemas de qualidade, as qualificações de pessoal e a configuração do instrumento devem ser revisados para garantir que os requisitos sejam atendidos.
Atualmente, as crianças vacinadas com a vacina contra encefalite japonesa (JE) têm uma incidência significativamente reduzida de JE5. O monitoramento das células imunes do sangue periférico pode ajudar a entender as mudanças na imunidade adaptativa mediada por células após a vacinação e a correlação entre as mudanças nos subconjuntos de linfócitos do sangue periférico e os efeitos da vacinação. Devido à estabilidade limitada das amostras de sangue total, as avaliações da eficácia da vacina são frequentemente realizadas em vários centros. Para esta análise, definimos células T CD8+ ou CD4+ ingênuas como CD27+ CD45RA+, células T de memória central (TCM) como CD27+ CD45RA-, células T de memória efetora (TEM) como CD27- CD45RA-, e células T de memória efetora terminalmente diferenciadas (TEMRA) como CD27- CD45RA+. As células B CD19+ podem ser separadas em populações que expressam CD27 versus IgD 6,7, as células B ingênuas expressam células B de memória CD27n (mBCs) podem ser identificadas com base na expressão de IgD6 e as células T reguladoras (Tregs) podem ser identificadas como CD4+CD25++CD127baixa 8. Para estabelecer um experimento padronizado de citometria de fluxo para alcançar a consistência e comparabilidade dos resultados experimentais em múltiplos centros, um método de padronização rápido e viável foi estabelecido para facilitar a transferência de protocolos entre diferentes citômetros de fluxo para a detecção de linfócitos no sangue total de crianças vacinadas com JE. Seis crianças saudáveis (2 anos de idade) foram recrutadas do Hospital Infantil de Pequim, Capital Medical University. Depois de receber uma vacinação prime e boost com uma vacina JE SA14-14-2 atenuada ao vivo menos de 6 meses antes, amostras de sangue periférico foram coletadas dos voluntários. Dados altamente comparáveis foram obtidos de diferentes instrumentos seguindo procedimentos padronizados, o que é útil para avaliações multicêntricas.
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Protocol
O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética do Hospital Infantil de Pequim, Capital Medical University (Número de Aprovação: 2020-k-85). O consentimento informado de seres humanos foi dispensado, pois apenas amostras residuais após testes clínicos foram utilizadas neste estudo. Dois laboratórios estão envolvidos neste estudo. O laboratório de transferência é onde o método padronizado foi desenvolvido usando um citômetro de fluxo. O citômetro neste laboratório é doravante referido como citômetro A. O laboratório de método de teste é o laboratório que recebe métodos usando outro citômetro de fluxo, e o citômetro neste laboratório é doravante referido como citômetro B.
1. Coleta de amostras de sangue periférico e preparação celular
- Coletar amostras de sangue periférico (2 mL) de crianças vacinadas com JE e crianças não vacinadas em tubos anticoagulados EDTA-K2 por punção venosa padrão.
- Misture a amostra de sangue total virando os tubos de cabeça para baixo 10x. Adicione 100 μL de sangue total a um tubo de 12 mm x 75 mm. Faça cada amostra em duplicata.
- Adicione 10 μL de tampão de mancha brilhante (tampão BV) a um tubo de 12 mm x 75 mm. Adicionar 5 μL de cada anticorpo (CD45, CD3, CD4, CD8, CD127, CD27, CD19, IgD; fator de diluição: 1:20) e 20 μL de anticorpo (CD25, CD45RA; fator de diluição: 1:5) ao tampão BV. Vórtice suavemente.
NOTA: Os volumes e as informações dos reagentes de anticorpos são apresentados no quadro 1. - Adicione o coquetel de anticorpos no tubo com a amostra de sangue total. Vórtice suavemente e incubar à temperatura ambiente por 15 min no escuro.
- Diluir a solução de lise 10x 1:10 com água destilada para preparar 1x solução de lise. Lise as amostras de sangue adicionando 2 mL de solução de lise 1x. Vórtice suavemente e incubar por 10 minutos no escuro à temperatura ambiente.
- Centrifugar a 300 × g durante 5 min e decantar o sobrenadante.
- Ressuscite o pellet em 2 mL de PBS 1x, centrifugar a 300 × g por 5 min e decantar o sobrenadante.
- Ressuscite o pellet em 0,5 mL de 1x PBS e misture bem. Conservar a 2 °C a 8 °C. Envie as amostras para os dois laboratórios para análise citométrica de fluxo.
NOTA: A amostra de controlo negativo e o controlo de célula de coloração única devem ser processados simultaneamente.
2. Preparação de contas de compensação e controle de coloração única
- Tubo de coloração única de APC-H7-anti-CD3 V500-anti-CD45, coloração única de APC-H7-anti-CD3, coloração única de FITC-anti-CD44, coloração única de R718-anti-CD8, coloração única de BV605-anti-CD27, coloração única de APC-anti-CD45RA, coloração única de PE-anti-CD25, coloração única de BV421-anti-CD127, coloração única de BB700-anti-CD19 e PE-CY7-anti-IgD de coloração única.
- Adicione 100 μL de 1x tampão salino tamponada com fosfato (DPBS) da Dulbecco contendo 1% de soro fetal bovino (FBS) a um tubo de ensaio de poliestireno de fundo redondo de 5 mL.
- Adicionar 50 μL das contas negativas e 50 μL da Ig anti-rato, contas κ a cada tubo e vórtice.
- Adicione 2 μL de cada anticorpo marcado (CD45, CD3, CD4, CD8, CD25, CD127, CD45RA, CD27, CD19, IgD) a um tubo de coloração única. Vórtice suavemente a mistura e incubar durante 15 min no escuro à temperatura ambiente (20 °C a 25 °C).
- Ressuspeite as esferas em 2 mL de 1x PBS, centrifugar a 300 × g por 5 min e decantar o sobrenadante.
- Ressuscite as contas em 0,5 mL de 1x PBS e misture bem. Conservar a 2 °C a 8 °C.
3. Usando nomes de configuração idênticos nos diferentes citômetros em dois laboratórios
- Crie uma nova configuração no software do citômetro A. Clique no botão Citômetro e escolha Exibir configurações para exibir a janela de configuração.
- Na lista de configurações, clique com o botão direito do mouse na pasta de configurações base, escolha Nova Pasta e renomeie-a.
- Clique com o botão direito do mouse na configuração base e escolha copiar.
- Clique com o botão direito do mouse na nova pasta e cole a configuração base para criar uma nova configuração. Renomeie a nova configuração como "Transferência de Método Padronizado".
- Arraste o nome do parâmetro, como FITC, da lista Parâmetros para o detector apropriado (530/30).
- Edite parâmetros adicionais (PE, BB700, PE-CY7, APC, R718, APC-H7, BV421, V500 e BV605) para a nova configuração.
- Siga este método para criar uma nova configuração em um modelo de citômetro de fluxo diferente usando o mesmo nome "Transferência de Método Padronizado". Certifique-se de que a configuração inclua os mesmos parâmetros para cada detector.
Observação : para identificar com êxito o modelo de experimento nos dois modelos de citômetro de fluxo diferentes, certifique-se de que o nome é consistente. - Sob as configurações do citômetro, use as esferas de configuração e rastreamento do citômetro (CST) para definir a linha de base do citômetro e rastrear o desempenho do citômetro. Clique no botão Citômetro e escolha CST para exibir o espaço de trabalho de configuração e rastreamento do citômetro.
- Adicione três gotas (150 μL) de esferas de configuração a 0,5 mL de 1x PBS em um tubo de ensaio de poliestireno de fundo redondo de 5 mL. Coloque o tubo de contas no citômetro.
- Na janela Controle de Instalação , escolha Definir Linha de Base e clique em Executar.
4. Padronização do experimento usando citômetro A no laboratório de transferência
- Execute uma verificação de desempenho usando a configuração do citômetro e os grânulos de rastreamento para verificar se o citômetro está funcionando bem.
- Na janela do navegador de software, clique com o botão direito do mouse nas configurações do citômetro e escolha Configurações do aplicativo para criar uma planilha.
- Usando uma amostra não corada, ajuste as tensões do tubo fotomultiplicador (PMT) do FSC, SSC e todos os parâmetros de fluorescência. FSC: 260; CCS: 460; FITC: 490; PE: 575; BB700: 620; PE-CY7: 640; APC: 600; R718: 620; APC-H7: 620; BV421: 466; V500: 420; e BV605: 505.
- Clique com o botão direito do mouse nas configurações do citômetro do experimento e escolha as configurações do aplicativo para salvá-lo.
- Clique no botão experimento e escolha o menu de configuração de compensação . Em seguida, escolha Criar controles de compensação para adicionar automaticamente controles de compensação.
- Registre os dados de todas as contas de controle de compensação.
- Clique no experimento e escolha a configuração de compensação. Em seguida, calcule a compensação automaticamente.
- Registre dados para controles de célula de coloração única.
- Use CD45RA APC para modificar o valor de compensação de R718 para 15% APC. Use CD19 BB700 para modificar o valor de compensação de APC-H7 para 14% BB700. Use CD8 R718 para modificar o valor de compensação de APC-H7 para 60% R718.
- Registre os dados para as contas CST.
- Crie uma planilha global do modelo de valor de destino para as contas brilhantes CST.
- Usando um gráfico FSC/SSC, desenhe a porta do polígono para as contas brilhantes CST. Obtenha gráficos de histograma de 10 canais de fluorescência para as esferas brilhantes CST: FITC, PE, BB700, PE-Cy7, APC, R718, APC-H7, BV421, V500 e BV605. Crie portas de intervalo nos gráficos de histograma. Crie o modo de exibição de estatísticas mostrando a mediana das portas de intervalo.
- Execute as amostras no citômetro de fluxo; coletar um total de 25.000 linfócitos.
- Crie uma planilha global do modelo de análise para os exemplos.
- Use a seguinte estratégia de bloqueio de exemplo:
- Usando um gráfico de pontos CD45/área de dispersão lateral (SSC-A), desenhe a porta do polígono para identificar a população de linfócitos intacta, excluindo os detritos.
- Usando um gráfico de pontos CD3/CD19, desenhe uma porta retangular para selecionar células T CD3+ e células B CD19+.
- Usando um gráfico de pontos CD4/CD8, desenhe uma porta quádrupla para selecionar células T CD4+ ou CD8+ (células com alta fluorescência para esses marcadores, respectivamente).
- Usando um gráfico de pontos CD45RA/CD27, desenhe uma porta quádrupla para subdividir as células T CD8+ ou CD4+ em células ingênuas (CD27+CD45RA+), TCM (CD27+ CD45RA-), TEM (CD27-CD45RA-) e TEMRA (CD27-CD45RA+).
- Usando um gráfico de pontos CD25/CD127, desenhe uma porta quádrupla para subdividir as células T CD4+ em células Treg (CD4+CD25++CD127baixo).
- Usando um gráfico de pontos CD27/IgD, desenhe uma porta quádrupla para subdividir as células B CD19+ em células B ingênuas (CD27-IgD+) e células B de memória (CD27+IgD-).
- Salve o modelo experimental no citômetro A.
- Use o CD-ROM para exportar o modelo experimental.
5. Transferência do molde experimental para o citômetro B no laboratório do método de teste
NOTA: O modelo experimental inclui configurações de instrumento, o modelo de análise e o modelo de valor alvo da intensidade de fluorescência mediana (MFI).
- Realize uma verificação de desempenho usando esferas CST para verificar se o citômetro está funcionando bem.
- Importe o modelo experimental e crie um experimento para o citômetro B usando o modelo.
- Use o mesmo lote de grânulos CST para ajustar as tensões de parâmetro fluorescente para cada canal de fluorescência para corresponder ao instrumento MFI anterior.
NOTA: Os valores de IFM variam dentro de ±5% (as IFM de grânulos brilhantes antes e depois da transferência são apresentadas no Quadro 2). - Ajuste a tensão para FSC usando a amostra não corada, se necessário.
- Clique com o botão direito do mouse nas configurações do citômetro experimental e escolha as configurações do aplicativo para salvar as configurações do aplicativo .
- Use CD45RA APC para modificar o valor de compensação de R718 para 15% APC. Use CD19 BB700 para modificar o valor de compensação de APC-H7 para 24% BB700. Use CD8 R718 para modificar o valor de compensação de APC-H7 para 60% R718.
- Execute as amostras no citômetro de fluxo; coletar um total de 25.000 linfócitos.
6. Consistência entre os resultados experimentais obtidos nos dois citômetros
- Avaliar as diferenças nos subconjuntos de linfócitos entre os instrumentos usando ANOVA one-way (p < 0,05).
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Representative Results
A Figura 1 mostra uma planilha global do modelo de valor de destino para as contas brilhantes CST. Usando um gráfico FSC/SSC, uma porta de polígono é desenhada para selecionar as contas brilhantes CST. Gráficos de histograma de 10 canais de fluorescência foram obtidos para as esferas brilhantes de STC: FITC, PE, BB700, PE-Cy7, APC, R718, APC-H7, BV421, V500 e BV605. O valor de destino para cada parâmetro é exibido mostrando a mediana dentro das portas do histograma na Tabela 2. As capturas de tela dos modelos e configurações de parâmetros no software do citômetro A e do citômetro B são mostradas na Figura Suplementar S1.
A Figura 2 mostra os gráficos de pontos de uma amostra entre os dois instrumentos após a padronização do instrumento. Os dados demonstram consistência entre diferentes instrumentos usando um modelo de análise automática. Os resultados de seis amostras foram comparados em dois modelos de instrumentos diferentes na Tabela 3. Não foram medidas diferenças significativas nas porcentagens de 15 subgrupos linfoides nos dois laboratórios. Esses resultados mostram que dados altamente comparáveis foram obtidos seguindo o método padronizado. As porcentagens de 15 subconjuntos linfoides de diferentes instrumentos são mostradas na Tabela Suplementar S1.
Figura 1: Modelo de planilha global para as contas brilhantes CST. As contas brilhantes CST são fechadas no gráfico FSC versus SSC. Gráficos de histograma de 10 canais de fluorescência são apresentados para as esferas brilhantes CST. As portas de intervalo são criadas para incluir a população de contas brilhantes de esferas CST para cada detector de fluorescência. Abreviaturas: FSC-A = área de dispersão para a frente; SSC-A = área de dispersão lateral. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Comparação de gráficos de pontos de uma amostra entre os dois instrumentos. (A) O gráfico de pontos CD45/SSC-A é usado para tratar linfócitos. (B) O gráfico de pontos CD3/CD19 é usado para portar células T CD3+ e células B CD19+. (C) O gráfico de pontos CD4/CD8 é usado para identificar células T CD3+ CD8+ e CD3+ CD4+ T. (D) O gráfico de pontos CD25/CD127 é usado para bloquear células Treg (CD4+CD25++CD127baixo). (E) O gráfico de pontos CD45RA/CD27 para células T CD4+ é usado para portar ingênuos (CD27+CD45RA+), TCM (CD27+ CD45RA-), TEM (CD27- CD45RA-) e TEMRA (CD27-CD45RA+). (F) O gráfico de pontos CD45RA/CD27 para células T CD8+ é usado para eliminar ingênuos (CD27+CD45RA+), TCM (CD27+ CD45RA-), TEM (CD27- CD45RA-) e TEMRA (CD27-CD45RA+). (G) O gráfico de pontos CD27/IgD é usado para capturar células B ingênuas (CD27- IgD+) e células B de memória (CD27+ IgD-). A estratégia de gating é de Zhang et al.7. Abreviaturas: SSC-A = área de dispersão lateral; TCM = células T da memória central; TEM = células T da memória efetora; TEMRA = células T de memória efetoras diferenciais terminais. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Alvo de anticorpos | Fluorochrome | Clone | Nº de catálogo | Volume por teste (μL) |
| CD4 | FITC | SK3 | 566320 | 5 |
| CD25 | PE | M-A251 | 555432 | 20 |
| CD19 | BB700 | HIB19 | 745907 | 5 |
| IgD | PE-CY7 | IA6-2 | 561314 | 5 |
| CD45RA | APC | HI100 | 550855 | 20 |
| CD8 | R 718 | G42-8 | 751953 | 5 |
| CD3 | APC-H7 | SK7 | 560176 | 5 |
| CD127 | BV421 | HIL-7R-M21 | 562436 | 5 |
| CD45 | V500 | HI30 | 560777 | 5 |
| CD27 | BV605 | L128 | 562656 | 5 |
Tabela 1: Volumes de anticorpos e informações de fluoróforos conjugados para análises citométricas de fluxo. Abreviaturas: BV = violeta brilhante; BB = azul brilhante; FITC = isotiocianato de fluoresceína; EP = ficoeritrina; APC = aloficocianina.
| MFI de contas brilhantes | |||
| Canal | Citômetro A | Citômetro B | %Diff na IFM |
| FSC | 22,133 | 22,689 | 2.51% |
| CCD | 1,51,361 | 1,51,261 | -0.07% |
| FITC | 9,956 | 9,964 | 0.08% |
| PE | 30,877 | 31,264 | 1.25% |
| BB700 | 19,265 | 19,440 | 0.91% |
| PE-CY7 | 14,406 | 14,375 | -0.22% |
| APC | 64,494 | 64,340 | -0.24% |
| R 718 | 41,271 | 41,456 | 0.45% |
| APC-H7 | 90,666 | 90,837 | 0.19% |
| BV421 | 9,882 | 9,776 | -1.07% |
| V500 | 19,680 | 19,425 | -1.30% |
| BV605 | 10,794 | 10,356 | -4.06% |
Tabela 2: IFM de contas brilhantes antes e depois da transferência. Abreviaturas: IFM = intensidade média de fluorescência; BV = violeta brilhante; BB = azul brilhante; FITC = isotiocianato de fluoresceína; EP = ficoeritrina; APC = aloficocianina.
| Média das porcentagens | Média das porcentagens | ||
| Citômetro A (n=6) | Citômetro B (n=6) | Valor de p | |
| Células T | 71.30 | 74.73 | 0.19 |
| Células T CD4+ | 48.63 | 47.75 | 0.82 |
| CD4+ TCM | 30.68 | 28.20 | 0.06 |
| CD4+ ingênuo | 57.60 | 58.25 | 0.90 |
| CD4+ TEM | 8.98 | 10.52 | 0.51 |
| CD4+ TEMRA | 2.73 | 3.07 | 0.81 |
| Treg | 9.07 | 8.57 | 0.74 |
| Células T CD8+ | 40.63 | 40.45 | 0.98 |
| CD8+ TCM | 16.83 | 14.78 | 0.75 |
| CD8+ ingênuo | 49.08 | 47.70 | 0.80 |
| CD8+ TEM | 6.35 | 8.20 | 0.51 |
| D4+ TEMRA | 27.75 | 29.30 | 0.77 |
| Células B | 13.88 | 13.20 | 0.84 |
| ingênuo B | 67.88 | 70.38 | 0.84 |
| Memória B | 11.88 | 11.80 | 0.95 |
Tabela 3: Avaliação das diferenças nos subconjuntos de linfócitos entre os instrumentos. p > 0,05 indica que não há diferença significativa. Abreviaturas: TCM = células T de memória central; TEM = células T da memória efetora; TEMRA = células T de memória efetoras terminalmente diferenciadas.
Tabela Suplementar S1: Porcentagens de subconjuntos de linfócitos em seis amostras de diferentes instrumentos. Clique aqui para baixar este arquivo.
Figura Suplementar S1: As capturas de tela de modelos e configurações de parâmetros no software do citômetro A e citômetro B. (A) O arquivo XML de modelos. (B) As capturas de tela dos modelos. (C) As configurações de parâmetros no citômetro A. (D) As configurações de parâmetros no citômetro B. Clique aqui para baixar este arquivo.
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Discussion
A imunofenotipagem de subconjuntos de linfócitos do sangue periférico pode ajudar a entender as mudanças na imunidade adaptativa mediada por células após a vacinação em crianças. Em aplicações clínicas, ocorrem situações inesperadas, como a falha em detectar amostras em tempo hábil ou a substituição de um citômetro de fluxo; portanto, são necessários métodos padronizados rápidos que facilitem as transferências entre citômetros de fluxo em diferentes laboratórios9,10,11. Aqui, descrevemos um método padronizado rápido para garantir resultados consistentes entre diferentes instrumentos. O método padronizado foi utilizado para monitorar células imunes no sangue periférico de crianças após a vacinação, e resultados consistentes foram obtidos em dois laboratórios. O método padronizado foi estabelecido entre BD Canto e LSRFortessa. O protocolo também é adequado para FACSCelesta, FACSymphony A5 e FACSAria II. Em comparação com outros métodos de padronização2,3, esse método padrão não requer o uso de software de terceiros para obter a consistência dos dados. Ele usa apenas as características do software Diva para criar um módulo de modelo contendo posição de valor alvo e análise automática para realizar o método de transferência entre diferentes instrumentos, e reduz a exigência de análise de dados. O método economiza tempo, é fácil de operar e não requer o desenvolvimento de uma ferramenta de bloqueio automatizado.
A padronização de um protocolo de citometria de fluxo neste estudo é alcançada através da criação de um modelo experimental em um instrumento que inclui configurações de citometria, análise automática de dados e planilha de posição de destino. Em seguida, os outros instrumentos usam contas CST para ajustar as tensões dos parâmetros para atingir o valor alvo. Várias características importantes devem ser consideradas para completar a padronização bem-sucedida em diferentes instrumentos de citômetro de fluxo. Primeiramente, o método padronizado requer que os instrumentos utilizem o mesmo sistema de software, para que o arquivo XML do modelo de experimento possa ser compartilhado entre o software dos instrumentos. Em segundo lugar, os dois instrumentos devem ter o mesmo nome para a configuração, e os parâmetros também devem ser nomeados de forma idêntica. Em terceiro lugar, as esferas CST devem ser recolhidas sob as condições de tensão especificadas sem compensação como valores-alvo. Dadas as diferentes potências do laser e sensibilidades PMT de diferentes instrumentos, é necessário usar contas CST do mesmo número de lote para ajustar os parâmetros de tensão, de acordo com os valores-alvo em outros instrumentos, e garantir que o valor da IFM esteja dentro de ±5%. Em quarto lugar, as avaliações diárias de controle de qualidade dos instrumentos também são muito importantes. Se um instrumento falhar na avaliação, a célula de fluxo deve ser limpa para bolhas ou submetida à calibração a laser. Por fim, para reduzir as diferenças causadas pelos procedimentos de preparo, as amostras devem ser preparadas de forma idêntica quando esses grandes estudos multicêntricos são realizados, além de transferir configurações para poder analisar as amostras em diferentes laboratórios. No entanto, ainda há espaço para otimização de painel para melhor identificação de células B de memória neste protocolo. A frequência de células B de memória é relativamente baixa em crianças de 2 anos de idade, e a expressão de CD27 na superfície dessas células é difusa. Isso pode identificar melhor as células B de memória se o marcador for substituído por uma fluoresceína mais brilhante do que a BV605.
No entanto, algumas limitações devem ser observadas. Primeiramente, dois citômetros de fluxo foram utilizados para padronização neste experimento; modelos de instrumentos adicionais devem ser incluídos em experimentos subsequentes. Em segundo lugar, o método de coloração da superfície celular foi usado para distinguir e determinar subconjuntos de linfócitos e não envolveu a detecção de mais citocinas intracelulares. Em terceiro lugar, não comparamos os resultados experimentais com e sem o processo de padronização de dois citômetros de fluxo.
A vantagem desse método padronizado é que diferentes instrumentos podem compartilhar o arquivo XML do modelo de experimento se o software for o mesmo. O modelo experimental contém o modelo de valores-alvo fixos, e os dados só podem ser obtidos após o ajuste das tensões PMT aos valores-alvo entre os instrumentos. Além disso, o modelo experimental também contém análise automática de estratégia de portão. Uma vez que os dados são obtidos, o relatório de análise automática é gerado. Este procedimento é fácil de operar e reduz as diferenças nos resultados causadas pela análise manual. Este método padronizado pode ser usado para avaliar as mudanças nos subconjuntos de linfócitos no sangue total de crianças vacinadas com JE usando diferentes instrumentos em todos os laboratórios, atingindo o objetivo de garantir que o projeto de estudo seja realizado de forma consistente em vários centros. Neste estudo, objetivamos testar a conversibilidade do método padronizado por coloração superficial, e seu sucesso estabelecerá uma base para a prática de coloração intracelular posterior.
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Disclosures
Os autores declaram não haver conflitos de interesse.
Acknowledgments
A RW foi apoiada pela Beijing Natural Science Foundation, China (No. 7222059), National Natural Science Foundation of China (No. 82002130), a XZ foi apoiada pelo CAMS Innovation Fund for Medical Sciences (No. 2019-I2M-5-026).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD CompBeads Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control Compensation Particles Set | BD | 552843 | compensation |
| BD FACSCanto | BD | FACSCanto | flow Cytometry A in the transferring lab |
| BD FACSDiva CS&T Research Beads | BD | 655051 | define flow cytometer baseline and track cytometer performance |
| BD Horizon BV421 Mouse Anti-Human CD127 | BD | 562436 | Fluorescent antibody |
| BD Horizon BV605 Mouse Anti-Human CD27 | BD | 562656 | Fluorescent antibody |
| BD Horizon V500 Mouse Anti-Human CD45 | BD | 560777 | Fluorescent antibody |
| BD LSRFortessa | BD | LSRFortessa | flow Cytometry B in the test method lab |
| BD OptiBuild BB700 Mouse Anti-Human CD19 | BD | 745907 | Fluorescent antibody |
| BD OptiBuild R718 Mouse Anti-Human CD8 | BD | 751953 | Fluorescent antibody |
| BD Pharmingen APC Mouse Anti-Human CD45RA | BD | 550855 | Fluorescent antibody |
| BD Pharmingen APC-H7 Mouse Anti-Human CD3 | BD | 560176 | Fluorescent antibody |
| BD Pharmingen FITC Mouse Anti-Human CD4 | BD | 566320 | Fluorescent antibody |
| BD Pharmingen PE Mouse Anti-Human CD25 | BD | 555432 | Fluorescent antibody |
| BD Pharmingen PE-Cy7 Mouse Anti-Human IgD | BD | 561314 | Fluorescent antibody |
| Brilliant Staining Buffer Plus | BD | 566385 | Staining Buffer |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810 | Cell centrifugation |
| Centrifuge Tube | BD Falcon | BD-35209715 | 15 mL centrifuge tube |
| CS&T IVD Beads | BD | 662414 | standard beads to setup cytometer settings in different flow cytometer |
| Lysing Solution 10x Concentrate | BD | 349202 | lysing red blood cells |
| Phosphate-buffered Saline (PBS) | Gibco | 10010-023 | PBS |
| Round-bottom test tube | BD Falcon | 352235 | 5 mL test tube |
References
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- Le Lann, L., et al. Standardization procedure for flow cytometry data harmonization in prospective multicenter studies. Scientific Reports. 10 (1), 11567 (2020).
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