Summary
I denne studien ble det utviklet en metode for å lette overføringen av eksperimentelle innstillinger og analysemaler mellom to strømningscytometre i to laboratorier for påvisning av lymfocytter hos japanske encefalittvaksinerte barn. Standardiseringsmetoden for flowcytometereksperimenter vil tillate forskningsprosjekter å bli effektivt utført i flere sentre.
Abstract
Et økende antall laboratorier trenger å samle inn data fra flere strømningscytometre, spesielt for forskningsprosjekter utført på tvers av flere sentre. Utfordringene ved bruk av to flowcytometre i forskjellige laboratorier inkluderer mangel på standardiserte materialer, programvarekompatibilitetsproblemer, inkonsekvenser i instrumentoppsett og bruk av forskjellige konfigurasjoner for forskjellige flowcytometre. For å etablere et standardisert flowcytometrieksperiment for å oppnå konsistens og sammenlignbarhet av eksperimentelle resultater på tvers av flere sentre, ble det etablert en rask og gjennomførbar standardiseringsmetode for å overføre parametere på tvers av forskjellige flowcytometre.
Metodene utviklet i denne studien tillot overføring av eksperimentelle innstillinger og analysemaler mellom to flowcytometre i forskjellige laboratorier for påvisning av lymfocytter hos japanske encefalitt (JE) -vaksinerte barn. En konsistent fluorescensintensitet ble oppnådd mellom de to cytometrene ved bruk av fluorescensstandardperler for å etablere cytometerinnstillingene. Sammenlignbare resultater ble oppnådd i to laboratorier med forskjellige typer instrumenter. Ved hjelp av denne metoden kan vi standardisere analyse for evaluering av immunfunksjonen til JE-vaksinerte barn i forskjellige laboratorier med forskjellige instrumenter, redusere forskjellene i data og resultater mellom flowcytometre i flere sentre, og gi en gjennomførbar tilnærming for gjensidig akkreditering av laboratorieresultater. Standardiseringsmetoden for flowcytometereksperimenter vil sikre effektiv ytelse av forskningsprosjekter på tvers av flere sentre.
Introduction
Standardiseringen av flowcytometri er nyttig for sammenlignbarheten av resultater oppnådd fra forskjellige cytometre på tvers av forskjellige laboratorier og studiesentre, og bidrar til gjensidig anerkjennelse av resultater for å forbedre arbeidseffektiviteten. Stadig flere scenarier krever standardisering. Under legemiddelutviklingsprosessen er standardisering av flowcytometri viktig, da en utviklet og validert analyse vil støtte hele legemiddelutviklingsprosessen fra preklinisk til klinisk analyse. Flowcytometriske metoder overføres ofte mellom farmasøytisk industri og samarbeidende laboratorier1. Videre er det viktig å innhente sammenlignbare data fra multisentriske kliniske studier. For eksempel ble det utviklet en standardiseringsarbeidsflyt i Systemic Autoimmune Diseases Multicenter Clinical Research Project for å oppnå sammenlignbare data fra multisentrisk flowcytometri2.
Standardisering av flowcytometrimetoder er utfordrende. Utfordringene som oppleves på tvers av laboratorier tilskrives mangelen på standardiserte materialer, programvarekompatibilitetsproblemer, inkonsekvenser i instrumentoppsett og bruk av forskjellige konfigurasjoner mellom forskjellige strømningscytometre og divergerende gatingstrategier mellom sentrene 3,4. Derfor er det viktig å gjennomføre en gapanalyse mellom laboratorier. Prøvetilgang, kvalitetssystemer, personellkvalifikasjoner og instrumentkonfigurasjon må gjennomgås for å sikre at kravene oppfylles.
For tiden har barn vaksinert med den japanske encefalittvaksinen (JE) en signifikant redusert forekomst av JE5. Overvåking av perifere blodimmunceller kan bidra til å forstå endringene i cellemediert adaptiv immunitet etter vaksinasjon, og sammenhengen mellom endringene i undergrupper av perifere lymfocytter i blodet og effekten av vaksinasjon. På grunn av den begrensede stabiliteten til fullblodprøver, blir evalueringer av vaksineeffekt ofte utført i flere sentre. For denne analysen definerte vi naive CD8+- eller CD4+ T-celler som CD27+ CD45RA+, sentrale minne-T-celler (TCM) som CD27+ CD45RA-, effektorminne-T-celler (TEM) som CD27-CD45RA-, og terminalt differensierte effektorminne-T-celler (TEMRA) som CD27- CD45RA+. CD19+ B-celler kan deles inn i populasjoner som uttrykker CD27 versus IgD 6,7, naive B-celler uttrykker CD27n-minne B-celler (mBC) kan identifiseres basert på ekspresjonen av IgD6, og regulatoriske T-celler (Tregs) kan identifiseres som CD4+CD25++CD127lav 8. For å etablere et standardisert flowcytometrieksperiment for å oppnå konsistens og sammenlignbarhet av eksperimentelle resultater i flere sentre, ble det etablert en rask og gjennomførbar standardiseringsmetode for å lette overføringen av protokoller over forskjellige flowcytometre for påvisning av lymfocytter i fullblod hos JE-vaksinerte barn. Seks friske barn (2 år) ble rekruttert fra Beijing Children's Hospital, Capital Medical University. Etter å ha mottatt en prime og boost-vaksinasjon med en levende-svekket JE SA14-14-2-vaksine mindre enn 6 måneder før, ble perifere blodprøver samlet inn fra frivillige. Svært sammenlignbare data ble innhentet fra forskjellige instrumenter etter standardiserte prosedyrer, noe som er nyttig for multisentervurderinger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Studien ble godkjent av etikkomiteen ved Beijing Children's Hospital, Capital Medical University (godkjenningsnummer: 2020-k-85). Informert samtykke fra forsøkspersoner ble frafalt da kun restprøver etter klinisk testing ble brukt i denne studien. To laboratorier er involvert i denne studien. Overføringslaboratoriet er der den standardiserte metoden ble utviklet ved hjelp av ett flowcytometer. Cytometeret i dette laboratoriet blir heretter referert til som cytometer A. Testmetodelaboratoriet er laboratoriet som mottar metoder ved hjelp av et annet flowcytometer, og cytometeret i dette laboratoriet blir heretter kalt cytometer B.
1. Perifer blodprøvetaking og celleforberedelse
- Samle perifere blodprøver (2 ml) fra JE-vaksinerte barn og uvaccinerte barn i EDTA-K 2-antikoagulerte rør ved standard venepunktur.
- Bland hele blodprøven ved å snu rørene opp ned 10x. Tilsett 100 μL fullblod til et 12 mm x 75 mm rør. Gjør hver prøve i duplikat.
- Tilsett 10 μL strålende flekkbuffer (BV-buffer) til et 12 mm x 75 mm rør. Tilsett 5 μL av hvert antistoff (CD45, CD3, CD4, CD8, CD127, CD27, CD19, IgD; fortynningsfaktor: 1:20) og 20 μL antistoff (CD25, CD45RA; fortynningsfaktor: 1:5) til BV-bufferen. Vortex forsiktig.
MERK: Volum og informasjon om antistoffreagensene er vist i tabell 1. - Tilsett antistoffcocktailen i røret med hele blodprøven. Vortex forsiktig og inkuber ved romtemperatur i 15 min i mørket.
- Fortynn 10x lyseringsoppløsningen 1:10 med destillert vann for å fremstille 1x lyseringsløsning. Lyse blodprøvene ved å tilsette 2 ml 1x lyseringsløsning. Vortex forsiktig og inkuber i 10 minutter i mørket ved romtemperatur.
- Sentrifuge ved 300 × g i 5 min og dekanter supernatanten.
- Oppløs pelleten på nytt i 2 ml 1x PBS, sentrifuge ved 300 × g i 5 minutter, og dekanter supernatanten.
- Oppløs pelleten i 0,5 ml 1x PBS og bland godt. Oppbevares ved 2 °C til 8 °C. Send prøvene til de to laboratoriene for flowcytometrisk analyse.
MERK: Den negative kontrollprøven og celle-enkeltfargede kontrollen må behandles samtidig.
2. Klargjøring av kompensasjonsperler og enkeltfarget kontroll
- Etikett V500-anti-CD45 enkeltfarget, APC-H7-anti-CD3 enkeltfarget, FITC-anti-CD4 enkeltfarget, R718-anti-CD8 enkeltfarget, BV605-anti-CD27 enkeltfarget, APC-anti-CD45RA enkeltfarget, PE-anti-CD25 enkeltfarget, BV421-anti-CD127 enkeltfarget, BB700-anti-CD19 enkeltfarget og PE-CY7-anti-IgD enkeltfargede rør.
- Tilsett 100 μL 1x Dulbeccos fosfatbufrede saltvannsbuffer (DPBS) som inneholder 1% fosterbovint serum (FBS) til et 5 ml rundbunns polystyren reagensrør.
- Tilsett 50 μL av de negative perlene og 50 μL av anti-mus Ig, κ perler til hvert rør og hvirvel.
- Tilsett 2 μL av hvert merket antistoff (CD45, CD3, CD4, CD8, CD25, CD127, CD45RA, CD27, CD19, IgD) til et enkeltfarget rør. Virv blandingen forsiktig og bland i 15 minutter i mørket ved romtemperatur (20 °C til 25 °C).
- Resuspender perlene i 2 ml 1x PBS, sentrifuge ved 300 × g i 5 minutter, og dekanter supernatanten.
- Oppløs perlene i 0,5 ml 1x PBS og bland godt. Oppbevares ved 2 °C til 8 °C.
3. Bruk av identiske konfigurasjonsnavn på de forskjellige cytometrene i to laboratorier
- Opprett en ny konfigurasjon i programvaren til cytometer A. Klikk på Cytometer-knappen og velg vis konfigurasjoner for å vise konfigurasjonsvinduet.
- I konfigurasjonslisten høyreklikker du den grunnleggende konfigurasjonsmappen, velger Ny mappe og gir den nytt navn.
- Høyreklikk basiskonfigurasjonen , og velg kopier.
- Høyreklikk den nye mappen , og lim inn basiskonfigurasjonen for å opprette en ny konfigurasjon. Gi nytt navn til den nye konfigurasjonen "Standardisert metodeoverføring".
- Dra parameternavnet, for eksempel FITC, fra Parametere-listen til riktig detektor (530/30).
- Rediger flere parametere (PE, BB700, PE-CY7, APC, R718, APC-H7, BV421, V500 og BV605) til den nye konfigurasjonen.
- Følg denne metoden for å opprette en ny konfigurasjon på en annen flowcytometermodell med samme navn "Standardized Method Transfer". Kontroller at konfigurasjonen inneholder de samme parameterne for hver detektor.
MERK: For å kunne identifisere eksperimentmalen på de to forskjellige flowcytometermodellene, må du kontrollere at navnet er konsistent. - Under cytometerkonfigurasjonene, bruk cytometeroppsett og sporingsperler (CST) for å definere cytometerets grunnlinje og spore cytometerytelse. Klikk på Cytometer-knappen og velg CST for å vise cytometeroppsettet og sporingsområdet.
- Tilsett tre dråper (150 μL) oppsettperler til 0,5 ml 1x PBS i et 5 ml rundbunns polystyrenreagensrør. Plasser perlerøret på cytometeret.
- I vinduet Oppsettkontroll velger du Definer opprinnelig plan og klikker Kjør.
4. Standardiserende eksperiment ved bruk av cytometer A i overføringslaboratoriet
- Kjør en ytelseskontroll ved hjelp av cytometeroppsettet og sporingsperlene for å bekrefte at cytometeret fungerer bra.
- I programvarenettleservinduet høyreklikker du cytometerinnstillingene og velger Programinnstillinger for å opprette et regneark.
- Bruk en ufarget prøve, juster fotomultiplikatorrøret (PMT) spenningene til FSC, SSC og alle fluorescensparametere. FSC: 260; SSC: 460; FITC: 490; PE: 575; BB700: 620; PE-CY7: 640; APC: 600; R718: 620; APC-H7: 620; BV421: 466; V500: 420; og BV605: 505.
- Høyreklikk på eksperimentets cytometerinnstillinger og velg programinnstillinger for å lagre den.
- Klikk på eksperimentknappen og velg menyen for kompensasjonsoppsett . Velg deretter Opprett kompensasjonskontroller for å legge til kompensasjonskontroller automatisk.
- Registrer data for alle kompensasjonskontrollperler.
- Klikk på eksperimentet , og velg kompensasjonsoppsett. Deretter beregner du kompensasjonen automatisk.
- Registrere data for enkeltfargede cellekontroller.
- Bruk CD45RA APC til å endre kompensasjonsverdien for R718 til 15 % APC. Bruk CD19 BB700 til å endre kompensasjonsverdien til APC-H7 til 14 % BB700. Bruk CD8 R718 til å endre kompensasjonsverdien for APC-H7 til 60 % R718.
- Registrer data for CST-perlene.
- Opprett et globalt regneark med målverdimalen for de lyse CST-perlene.
- Bruk et FSC/SSC-plott til å tegne polygonporten for CSTs lyse perler. Få histogramplott på 10 fluorescenskanaler for CST-lyse perler: FITC, PE, BB700, PE-Cy7, APC, R718, APC-H7, BV421, V500 og BV605. Opprett intervallporter i histogramplottene. Opprett statistikkvisningen ved å vise medianen til intervallportene.
- Kjør prøvene på flowcytometeret; samle totalt 25.000 lymfocytter.
- Opprett et globalt regneark med analysemalen for eksemplene.
- Bruk følgende eksempel på gating-strategi:
- Bruk et CD45/side scatter-area (SSC-A) punktplott, tegn polygonporten for å identifisere den intakte lymfocyttpopulasjonen mens du ekskluderer rusk.
- Bruk et CD3/CD19-punktplott til å tegne en rektangulær port for å velge CD3+ T-celler og CD19+ B-celler.
- Bruk et CD4/CD8-punktplott til å tegne en fireport for å velge CD4+ eller CD8+ T-celler (celler med høy fluorescens for disse markørene).
- Bruk et CD45RA/CD27-punktplott til å tegne en fireports for å dele CD8+- eller CD4+ T-celler inn i naive (CD27+CD45RA+), TCM (CD27+ CD45RA-), TEM (CD27-CD45RA-) og TEMRA-celler (CD27-CD45RA+).
- Bruk et CD25/CD127-punktplott til å tegne en quad-port for å dele CD4+ T-celler inn i Treg-celler (CD4+CD25++CD127lav).
- Bruk et CD27/IgD-punktplott til å tegne en quad-port for å dele CD19+ B-celler inn i naive B-celler (CD27-IgD+) og minne B-celler (CD27+IgD-).
- Lagre den eksperimentelle malen på cytometer A.
- Bruk CD-ROMen til å eksportere den eksperimentelle malen.
5. Overføring av eksperimentell mal til cytometer B i testmetodelaboratoriet
MERK: Den eksperimentelle malen inneholder instrumentinnstillinger, analysemalen og målverdimalen for median fluorescensintensitet (MFI).
- Utfør en ytelseskontroll ved hjelp av CST-perler for å bekrefte at cytometeret fungerer bra.
- Importer den eksperimentelle malen og opprett et eksperiment for cytometer B ved hjelp av malen.
- Bruk samme masse CST-perler for å justere fluorescerende parameterspenninger for hver fluorescenskanal for å matche det forrige MFI-instrumentet.
MERK: MFI-verdiene varierer innen ±5% (MFI av lyse perler før og etter overføring er vist i tabell 2). - Juster spenningen for FSC ved hjelp av den ufargede prøven, om nødvendig.
- Høyreklikk på de eksperimentelle cytometerinnstillingene og velg applikasjonsinnstillinger for å lagre applikasjonsinnstillingene .
- Bruk CD45RA APC til å endre kompensasjonsverdien for R718 til 15 % APC. Bruk CD19 BB700 til å endre kompensasjonsverdien til APC-H7 til 24 % BB700. Bruk CD8 R718 til å endre kompensasjonsverdien for APC-H7 til 60 % R718.
- Kjør prøvene på flowcytometeret; samle totalt 25.000 lymfocytter.
6. Konsistens mellom de eksperimentelle resultatene oppnådd på de to cytometrene
- Vurdere forskjellene i lymfocyttundergrupper mellom instrumenter med enveis ANOVA (p < 0,05).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 viser et globalt regneark for målverdimalen for CST-lyse perler. Ved hjelp av et FSC/SSC-plott tegnes en polygonport for å velge CSTs lyse perler. Histogramplott av 10 fluorescenskanaler ble oppnådd for CST-lyse perler: FITC, PE, BB700, PE-Cy7, APC, R718, APC-H7, BV421, V500 og BV605. Målverdien for hver parameter vises ved å vise medianen innenfor histogramportene i tabell 2. Skjermbilder av maler og parameterinnstillinger i programvaren til cytometer A og cytometer B er vist i tilleggsfigur S1.
Figur 2 viser punktplottene til ett utvalg mellom de to instrumentene etter instrumentstandardisering. Dataene viser konsistens mellom ulike instrumenter ved hjelp av en automatisk analysemal. Resultatene fra seks utvalg ble sammenlignet på tvers av to ulike instrumentmodeller i tabell 3. Det ble ikke målt signifikante forskjeller i prosentandelene av 15 lymfoide undergrupper i de to laboratoriene. Disse resultatene viser at svært sammenlignbare data ble oppnådd etter den standardiserte metoden. Prosentandelene av 15 lymfoide undergrupper fra ulike instrumenter er vist i tilleggstabell S1.
Figur 1: Global regnearkmal for de lyse CST-perlene. CST lyse perler er gated i FSC versus SSC-tomten. Histogramplott med 10 fluorescenskanaler presenteres for CST-lyse perler. Intervallporter er laget for å inkludere den lyse perlepopulasjonen av CST-perler for hver fluorescensdetektor. Forkortelser: FSC-A = fremoverspredningsområde; SSC-A = sidespredningsområde. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Sammenligning av punktplott fra ett utvalg mellom de to instrumentene. (A) CD45/SSC-A punktplott brukes til å gate lymfocytter. (B) CD3/CD19-punktplott brukes til å gate CD3+ T-celler og CD19+ B-celler. (C) CD4/CD8-punktplott brukes til å identifisere CD3+ CD8+ T- og CD3+ CD4+ T-celler. (D) CD25/CD127 punktplott brukes til å gate Treg celler (CD4 + CD25 + + CD127lav). (E) CD45RA/CD27-punktplott for CD4+ T-celler brukes til å skjule naive (CD27+CD45RA+), TCM (CD27+ CD45RA-), TEM (CD27- CD45RA-) og TEMRA (CD27-CD45RA+). (F) CD45RA/CD27-punktplott for CD8+ T-celler brukes til å portere naive (CD27+CD45RA+), TCM (CD27+ CD45RA-), TEM (CD27- CD45RA-) og TEMRA (CD27-CD45RA+). (G) CD27/IgD-punktplott brukes til å portere naive B-celler (CD27-, IgD+) og minne-B-celler (CD27+, IgD-). Gating-strategien er fra Zhang et al.7. Forkortelser: SSC-A = sidespredningsområde; TCM = sentralt minne T-celler; TEM = effektorminne T-celler; TEMRA = terminalt differensiell effektor minne T-celler. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Antistoff mål | Fluorokrom | Klon | Katalog nr | Volum per test (μL) |
| CD4 | FITC | SK3 | 566320 | 5 |
| CD25 | PE | M-A251 | 555432 | 20 |
| CD19 | BB700 | HIB19 | 745907 | 5 |
| IgD | PE-CY7 | IA6-2 | 561314 | 5 |
| CD45RA | APC | HI100 | 550855 | 20 |
| CD8 | R718 | G42-8 | 751953 | 5 |
| CD3 | APC-H7 | SK7 | 560176 | 5 |
| CD127 | BV421 | HIL-7R-M21 | 562436 | 5 |
| CD45 | V500 | HI30 | 560777 | 5 |
| CD27 | BV605 | L128 | 562656 | 5 |
Tabell 1: Antistoffvolum og konjugert fluoroforinformasjon for flowcytometriske analyser. Forkortelser: BV = strålende fiolett; BB = strålende blå; FITC = fluoresceinisotiocyanat; PE = phycoerythrin; APC = allophycocyanin.
| MFI av lyse perler | |||
| Kanal | Cytometer A | Cytometer B | %Diff i MFI |
| FSC | 22,133 | 22,689 | 2.51% |
| SSC | 1,51,361 | 1,51,261 | -0.07% |
| FITC | 9,956 | 9,964 | 0.08% |
| PE | 30,877 | 31,264 | 1.25% |
| BB700 | 19,265 | 19,440 | 0.91% |
| PE-CY7 | 14,406 | 14,375 | -0.22% |
| APC | 64,494 | 64,340 | -0.24% |
| R718 | 41,271 | 41,456 | 0.45% |
| APC-H7 | 90,666 | 90,837 | 0.19% |
| BV421 | 9,882 | 9,776 | -1.07% |
| V500 | 19,680 | 19,425 | -1.30% |
| BV605 | 10,794 | 10,356 | -4.06% |
Tabell 2: MFI av lyse perler før og etter overføring. Forkortelser: MFI = gjennomsnittlig fluorescensintensitet; BV = strålende fiolett; BB = strålende blå; FITC = fluoresceinisotiocyanat; PE = phycoerythrin; APC = allophycocyanin.
| Gjennomsnitt av prosenter | Gjennomsnitt av prosenter | ||
| Cytometer A (n=6) | Cytometer B (n=6) | P-verdi | |
| T-celler | 71.30 | 74.73 | 0.19 |
| CD4+ T-celler | 48.63 | 47.75 | 0.82 |
| CD4+ TCM | 30.68 | 28.20 | 0.06 |
| CD4+ naiv | 57.60 | 58.25 | 0.90 |
| CD4+ TEM | 8.98 | 10.52 | 0.51 |
| CD4+ TEMRA | 2.73 | 3.07 | 0.81 |
| Treg | 9.07 | 8.57 | 0.74 |
| CD8+ T-celler | 40.63 | 40.45 | 0.98 |
| CD8+ TCM | 16.83 | 14.78 | 0.75 |
| CD8+ naiv | 49.08 | 47.70 | 0.80 |
| CD8+ TEM | 6.35 | 8.20 | 0.51 |
| D4+ TEMRA | 27.75 | 29.30 | 0.77 |
| B-celler | 13.88 | 13.20 | 0.84 |
| naiv B | 67.88 | 70.38 | 0.84 |
| Minne B | 11.88 | 11.80 | 0.95 |
Tabell 3: Vurdering av forskjeller i lymfocyttundergrupper mellom instrumenter. p > 0,05 indikerer ingen signifikant forskjell. Forkortelser: TCM = sentralt minne T-celler; TEM = effektorminne T-celler; TEMRA = terminalt differensiert effektorminne T-celler.
Tilleggstabell S1: Prosentandeler av oflymphocyttundergrupper i seks prøver fra forskjellige instrumenter. Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfigur S1: Skjermbilder av maler og parameterinnstillinger i programvaren til cytometer A og cytometer B. (A) XML-filen med maler. (B) Skjermbilder av maler. (C) Parameterinnstillingene i cytometer A. (D) Parameterinnstillingene i cytometer B. Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Immunfenotyping av undergrupper av perifere lymfocytter i blodet kan bidra til å forstå endringene i cellemediert adaptiv immunitet etter vaksinasjon hos barn. I kliniske applikasjoner oppstår uventede situasjoner, for eksempel manglende oppdagelse av prøver i tide eller erstatning av et flowcytometer; Derfor er det nødvendig med raske standardiserte metoder som letter overføringer mellom flowcytometre i forskjellige laboratorier 9,10,11. Her beskriver vi en rask standardisert metode for å sikre konsistente resultater mellom ulike instrumenter. Den standardiserte metoden ble brukt til å overvåke immunceller i perifert blod hos barn etter vaksinasjon, og konsistente resultater ble oppnådd i to laboratorier. Den standardiserte metoden ble etablert mellom BD Canto og LSRFortessa. Protokollen er også egnet for FACSCelesta, FACSymphony A5 og FACSAria II. Sammenlignet med andre standardiseringsmetoder2,3, krever denne standardmetoden ikke bruk av tredjeparts programvare for å oppnå konsistens av data. Den bruker bare egenskapene til Diva-programvaren for å lage en malmodul som inneholder målverdiposisjon og automatisk analyse for å realisere overføringsmetoden mellom forskjellige instrumenter, og reduserer kravet til dataanalyse. Metoden sparer tid, er enkel å betjene og krever ikke utvikling av et automatisert gatingverktøy.
Standardisering av en flowcytometriprotokoll i denne studien oppnås ved å lage en eksperimentell mal på ett instrument som inkluderer cytometriinnstillinger, automatisk dataanalyse og regneark for målposisjon. Deretter bruker de andre instrumentene CST-perler for å justere parameterspenningene for å nå målverdien. Flere viktige funksjoner bør vurderes for å fullføre vellykket standardisering på tvers av forskjellige flowcytometerinstrumenter. For det første krever den standardiserte metoden at instrumentene bruker det samme programvaresystemet, slik at XML-filen til eksperimentmalen kan deles mellom programvaren til instrumentene. For det andre bør de to instrumentene ha samme navn for konfigurasjonen, og parametrene skal også navngis identisk. For det tredje skal CST-perlene samles under de angitte spenningsforholdene uten kompensasjon som målverdier. Gitt de forskjellige laserkreftene og PMT-følsomhetene til forskjellige instrumenter, er det nødvendig å bruke CST-perler fra samme partinummer for å justere spenningsparametrene, i henhold til målverdiene på andre instrumenter, og sikre at MFI-verdien er innenfor ±5%. For det fjerde er også daglige kvalitetskontrollvurderinger av instrumenter svært viktige. Hvis ett instrument ikke består vurderingen, må flytcellen rengjøres for bobler eller utsettes for laserkalibrering. Til slutt, for å redusere forskjeller forårsaket av prepareringsprosedyrer, bør prøvene fremstilles på en identisk måte når slike store multisenterstudier utføres, i tillegg til å overføre innstillinger for å kunne analysere prøvene i forskjellige laboratorier. Imidlertid er det fortsatt rom for paneloptimalisering for bedre identifisering av minne B-celler i denne protokollen. Frekvensen av minne B-celler er relativt lav hos 2 år gamle barn, og CD27-uttrykk på overflaten av disse cellene er diffust. Dette kan bedre identifisere minne B-celler hvis markøren erstattes med et lysere fluorescein enn BV605.
Noen begrensninger bør imidlertid noteres. Først ble to strømningscytometre brukt til standardisering i dette eksperimentet; Ytterligere instrumentmodeller bør inkluderes i senere eksperimenter. For det andre ble celleoverflatefargingsmetoden brukt til å skille og bestemme lymfocyttundergrupper og involverte ikke påvisning av flere intracellulære cytokiner. For det tredje sammenlignet vi ikke eksperimentelle resultater med og uten standardiseringsprosessen av to strømningscytometre.
Fordelen med denne standardiserte metoden er at forskjellige instrumenter kan dele XML-filen til eksperimentmalen hvis programvaren er den samme. Den eksperimentelle malen inneholder malen for faste målverdier, og data kan bare oppnås etter justering av PMT-spenninger til målverdiene mellom instrumenter. I tillegg inneholder den eksperimentelle malen også automatisk gatestrategianalyse. Når dataene er innhentet, genereres den automatiske analyserapporten. Denne prosedyren er enkel å betjene og reduserer forskjellene i resultater forårsaket av manuell analyse. Denne standardiserte metoden kan brukes til å vurdere endringer i lymfocyttundergrupper i fullblod av JE-vaksinerte barn ved hjelp av forskjellige instrumenter på tvers av laboratorier, og oppnå målet om å sikre at studieprosjektet utføres konsekvent på tvers av flere sentre. I denne studien tar vi sikte på å teste konvertibiliteten til den standardiserte metoden ved overflatefarging, og suksessen vil legge grunnlaget for praksisen med senere intracellulær farging.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne oppgir ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
RW ble støttet av Beijing Natural Science Foundation, Kina (nr. 7222059), National Natural Science Foundation of China (nr. 82002130), XZ ble støttet av CAMS Innovation Fund for Medical Sciences (nr. 2019-I2M-5-026).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD CompBeads Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control Compensation Particles Set | BD | 552843 | compensation |
| BD FACSCanto | BD | FACSCanto | flow Cytometry A in the transferring lab |
| BD FACSDiva CS&T Research Beads | BD | 655051 | define flow cytometer baseline and track cytometer performance |
| BD Horizon BV421 Mouse Anti-Human CD127 | BD | 562436 | Fluorescent antibody |
| BD Horizon BV605 Mouse Anti-Human CD27 | BD | 562656 | Fluorescent antibody |
| BD Horizon V500 Mouse Anti-Human CD45 | BD | 560777 | Fluorescent antibody |
| BD LSRFortessa | BD | LSRFortessa | flow Cytometry B in the test method lab |
| BD OptiBuild BB700 Mouse Anti-Human CD19 | BD | 745907 | Fluorescent antibody |
| BD OptiBuild R718 Mouse Anti-Human CD8 | BD | 751953 | Fluorescent antibody |
| BD Pharmingen APC Mouse Anti-Human CD45RA | BD | 550855 | Fluorescent antibody |
| BD Pharmingen APC-H7 Mouse Anti-Human CD3 | BD | 560176 | Fluorescent antibody |
| BD Pharmingen FITC Mouse Anti-Human CD4 | BD | 566320 | Fluorescent antibody |
| BD Pharmingen PE Mouse Anti-Human CD25 | BD | 555432 | Fluorescent antibody |
| BD Pharmingen PE-Cy7 Mouse Anti-Human IgD | BD | 561314 | Fluorescent antibody |
| Brilliant Staining Buffer Plus | BD | 566385 | Staining Buffer |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810 | Cell centrifugation |
| Centrifuge Tube | BD Falcon | BD-35209715 | 15 mL centrifuge tube |
| CS&T IVD Beads | BD | 662414 | standard beads to setup cytometer settings in different flow cytometer |
| Lysing Solution 10x Concentrate | BD | 349202 | lysing red blood cells |
| Phosphate-buffered Saline (PBS) | Gibco | 10010-023 | PBS |
| Round-bottom test tube | BD Falcon | 352235 | 5 mL test tube |
References
- Cabanski, M., et al. Flow cytometric method transfer: Recommendations for best practice. Cytometry Part B. Clinical Cytometry. 100 (1), 52-62 (2021).
- Le Lann, L., et al. Standardization procedure for flow cytometry data harmonization in prospective multicenter studies. Scientific Reports. 10 (1), 11567 (2020).
- Linskens, E., et al. Improved standardization of flow cytometry diagnostic screening of primary immunodeficiency by software-based automated gating. Frontiers in Immunology. 11, 584646 (2020).
- Glier, H., et al. Standardization of 8-color flow cytometry across different flow cytometer instruments: A feasibility study in clinical laboratories in Switzerland. Journal of Immunological Methods. 475, 112348 (2019).
- Wang, R., et al. The epidemiology and disease burden of children hospitalized for viral infections within the family Flaviviridae in China: A national cross-sectional study. PLOS Neglected Tropical Diseases. 16 (7), e0010562 (2022).
- Ding, Y., et al. Reference values for peripheral blood lymphocyte subsets of healthy children in China. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 142 (3), 970-973 (2018).
- Zhang, L., et al. Detection of polyfunctional T cells in children vaccinated with Japanese encephalitis vaccine via the flow cytometry technique. Journal of Visualized Experiments. (187), e64671 (2022).
- Yu, N., et al. CD4(+) CD25 (+) CD127 (low/-) T cells: a more specific Treg population in human peripheral blood. Inflammation. 35 (6), 1773-1180 (2012).
- Kalina, T. Reproducibility of flow cytometry through standardization: opportunities and challenges. Cytometry Part A. 97 (2), 137-147 (2020).
- Sommer, U., et al. Implementation of highly sophisticated flow cytometry assays in multicenter clinical studies: considerations and guidance. Bioanalysis. 7 (10), 1299-1311 (2015).
- Glier, H., et al. Comments on EuroFlow standard operating procedures for instrument setup and compensation for BD FACS Canto II, Navios and BD FACS Lyric instruments. Journal of Immunological Methods. 475, 112680 (2019).
