Summary
Bu çalışmada, Japon ensefalit aşılı çocuklarda lenfositlerin tespiti için iki laboratuvarda iki akış sitometresi arasında deneysel ortamların ve analiz şablonlarının transferini kolaylaştırmak için bir yöntem geliştirilmiştir. Akış sitometresi deneyleri için standardizasyon yöntemi, araştırma projelerinin birden fazla merkezde etkili bir şekilde yürütülmesini sağlayacaktır.
Abstract
Giderek artan sayıda laboratuvarın, özellikle birden fazla merkezde gerçekleştirilen araştırma projeleri için çoklu akış sitometrelerinden veri toplaması gerekmektedir. Farklı laboratuvarlarda iki akış sitometresi kullanmanın zorlukları, standartlaştırılmış malzemelerin eksikliğini, yazılım uyumluluk sorunlarını, cihaz kurulumundaki tutarsızlıkları ve farklı akış sitometreleri için farklı konfigürasyonların kullanılmasını içerir. Birden fazla merkezde deneysel sonuçların tutarlılığını ve karşılaştırılabilirliğini sağlamak için standartlaştırılmış bir akış sitometrisi deneyi oluşturmak için, parametreleri farklı akış sitometreleri arasında aktarmak için hızlı ve uygulanabilir bir standardizasyon yöntemi oluşturulmuştur.
Bu çalışmada geliştirilen yöntemler, Japon ensefaliti (JE) aşılı çocuklarda lenfositlerin tespiti için farklı laboratuvarlardaki iki akış sitometresi arasında deneysel ortamların ve analiz şablonlarının aktarılmasına olanak sağlamıştır. Sitometre ayarlarını oluşturmak için floresan standart boncuklar kullanılarak iki sitometre arasında tutarlı bir floresan yoğunluğu elde edildi. Farklı cihaz tiplerine sahip iki laboratuvarda karşılaştırılabilir sonuçlar elde edilmiştir. Bu yöntemi kullanarak, Je aşılı çocukların bağışıklık fonksiyonlarını farklı laboratuvarlarda farklı aletlerle değerlendirmek için analizleri standartlaştırabilir, birden fazla merkezdeki akış sitometreleri arasındaki veri ve sonuç farklılıklarını azaltabilir ve laboratuvar sonuçlarının karşılıklı akreditasyonu için uygulanabilir bir yaklaşım sağlayabiliriz. Akış sitometresi deneylerinin standardizasyon yöntemi, araştırma projelerinin birden fazla merkezde etkili bir şekilde gerçekleştirilmesini sağlayacaktır.
Introduction
Akış sitometrisinin standardizasyonu, farklı laboratuvarlar ve çalışma merkezleri arasında farklı sitometrelerden elde edilen sonuçların karşılaştırılabilirliği için yararlıdır ve iş verimliliğini artırmak için sonuçların karşılıklı olarak tanınmasına elverişlidir. Giderek artan sayıda senaryo standardizasyon gerektirmektedir. İlaç geliştirme sürecinde, akış sitometrisi standardizasyonu önemlidir, çünkü geliştirilmiş ve doğrulanmış bir tahlil, klinik öncesi analizden klinik analize kadar tüm ilaç geliştirme sürecini destekleyecektir. Akış sitometrik yöntemleri sıklıkla ilaç endüstrisi ile işbirliği yapan laboratuvarlar arasında aktarılır1. Ayrıca, çok merkezli klinik çalışmalardan karşılaştırılabilir veriler elde etmek esastır. Örneğin, çok merkezli akış sitometrisi2'den karşılaştırılabilir veriler elde etmek için Sistemik Otoimmün Hastalıklar Çok Merkezli Klinik Araştırma Projesi'nde bir standardizasyon iş akışı geliştirilmiştir.
Akım sitometri yöntemlerinin standardizasyonu zordur. Laboratuvarlarda yaşanan zorluklar, standartlaştırılmış malzemelerin eksikliğine, yazılım uyumluluğu sorunlarına, cihaz kurulumundaki tutarsızlıklara ve farklı akış sitometreleri arasında farklı konfigürasyonların kullanılmasına ve merkezler arasındaki farklı geçiş stratejilerine bağlanmaktadır 3,4. Bu nedenle, laboratuvarlar arasında bir boşluk analizi yapmak önemlidir. Numune erişimi, kalite sistemleri, personel nitelikleri ve cihaz konfigürasyonu, gereksinimlerin karşılandığından emin olmak için gözden geçirilmelidir.
Şu anda, Japon ensefaliti (JE) aşısı ile aşılanan çocuklar, JE5 insidansında önemli ölçüde azalmaya sahiptir. Periferik kan immün hücrelerinin izlenmesi, aşılama sonrası hücre aracılı adaptif bağışıklıktaki değişiklikleri ve periferik kan lenfosit alt kümelerindeki değişiklikler ile aşılamanın etkileri arasındaki korelasyonu anlamaya yardımcı olabilir. Tam kan örneklerinin sınırlı stabilitesi nedeniyle, aşı etkinliğinin değerlendirilmesi genellikle birden fazla merkezde yapılmaktadır. Bu analiz için naif CD8+ veya CD4+ T hücrelerini CD27+ CD45RA+, merkezi bellek T hücrelerini (T CM) CD27+ CD45RA-, efektör bellek T hücrelerini (TEM) CD27- CD45RA-, terminal olarak farklılaşmış efektör bellek T hücrelerini (T EMRA) CD27- CD45RA+ olarak tanımladık. CD19+ B hücreleri, CD27'yi IgD 6,7'ye karşı eksprese eden popülasyonlara ayrılabilir, naif B hücreleri CD27n bellek B hücrelerini (mBC'ler) eksprese eder, IgD6'nın ekspresyonuna dayanarak tanımlanabilir ve düzenleyici T hücreleri (Tregs) CD4 + CD25 + + CD127düşük 8 olarak tanımlanabilir. Birden fazla merkezde deneysel sonuçların tutarlılığını ve karşılaştırılabilirliğini sağlamak için standartlaştırılmış bir akış sitometrisi deneyi oluşturmak için, Je aşılı çocukların tam kanındaki lenfositlerin tespiti için protokollerin farklı akış sitometreleri arasında transferini kolaylaştırmak için hızlı ve uygulanabilir bir standardizasyon yöntemi oluşturulmuştur. Altı sağlıklı çocuk (2 yaşında) Başkent Tıp Üniversitesi Pekin Çocuk Hastanesi'nden işe alındı. 6 aydan daha kısa bir süre önce canlı zayıflatılmış bir JE SA14-14-2 aşısı ile bir prime ve boost aşılaması aldıktan sonra, gönüllülerden periferik kan örnekleri toplandı. Çok merkezli değerlendirmeler için yararlı olan standartlaştırılmış prosedürleri takip eden farklı araçlardan son derece karşılaştırılabilir veriler elde edilmiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Çalışma, Başkent Tıp Üniversitesi Pekin Çocuk Hastanesi Etik Kurulu tarafından onaylanmıştır (Onay Numarası: 2020-k-85). Bu çalışmada sadece klinik testlerden sonra kalıntı örnekler kullanıldığı için insan deneklerin bilgilendirilmiş onamından feragat edilmiştir. Bu çalışmada iki laboratuvar yer almaktadır. Transfer laboratuvarı , standartlaştırılmış yöntemin bir akış sitometresi kullanılarak geliştirildiği yerdir. Bu laboratuvardaki sitometre bundan böyle sitometre A olarak anılacaktır. Test yöntemi laboratuvarı , başka bir akış sitometresi kullanarak yöntemleri alan laboratuvardır ve bu laboratuvardaki sitometre bundan böyle sitometre B olarak anılacaktır.
1. Periferik kan örneği toplama ve hücre hazırlama
- Standart venipunktur ile EDTA-K 2-antikoagüle tüplerde JE aşılı çocuklardan ve aşılanmamış çocuklardan periferik kan örnekleri (2 mL) toplayın.
- Tüpleri 10x baş aşağı çevirerek tam kan örneğini karıştırın. 12 mm x 75 mm'lik bir tüpe 100 μL tam kan ekleyin. Her örneği kopya halinde yapın.
- 12 mm x 75 mm'lik bir tüpe 10 μL parlak leke tamponu (BV tamponu) ekleyin. BV tamponuna her bir antikorun 5 μL'sini (CD45, CD3, CD4, CD8, CD127, CD27, CD19, IgD; seyreltme faktörü: 1:20) ve 20 μL antikor (CD25, CD45RA; seyreltme faktörü: 1:5) ekleyin. Vorteks nazikçe girdap.
NOT: Antikor reaktiflerinin hacimleri ve bilgileri Tablo 1'de gösterilmiştir. - Antikor kokteylini tam kan örneği ile tüpe ekleyin. Vorteksi nazikçe yapın ve karanlıkta 15 dakika oda sıcaklığında inkübe edin.
- 1x lizing çözeltisi hazırlamak için 10x lizing çözeltisini 1:10 damıtılmış suyla seyreltin. 2 mL 1x lizing çözeltisi ekleyerek kan örneklerini lize edin. Vorteksi nazikçe yapın ve oda sıcaklığında karanlıkta 10 dakika kuluçkaya yatırın.
- 5 dakika boyunca 300 × g'da santrifüj yapın ve süpernatanı boşaltın.
- Peleti 2 mL 1x PBS'de yeniden askıya alın, 5 dakika boyunca 300 × g'da santrifüj yapın ve süpernatanı boşaltın.
- Peleti 0,5 mL 1x PBS içinde yeniden askıya alın ve iyice karıştırın. 2 °C ila 8 °C'de saklayın. Numuneleri akış sitometrik analizi için iki laboratuvara gönderin.
NOT: Negatif kontrol numunesi ve hücre tek lekeli kontrol aynı anda işlenmelidir.
2. Kompanzasyon boncuklarının hazırlanması ve tek lekeli kontrol
- Label V500-anti-CD45 tek lekeli, APC-H7-anti-CD3 tek lekeli, FITC-anti-CD4 tek lekeli, R718-anti-CD8 tek boyalı, BV605-anti-CD27 tek boyalı, APC-anti-CD45RA tek boyalı, PE-anti-CD25 tek lekeli, BV421-anti-CD127 tek lekeli, BB700-anti-CD19 tek lekeli ve PE-CY7-anti-IgD tek lekeli tüpler.
- 5 mL'lik yuvarlak tabanlı polistiren test tüpüne% 1 fetal sığır serumu (FBS) içeren 1x Dulbecco'nun fosfat tamponlu salin (DPBS) tamponundan 100 μL ekleyin.
- Her tüpe ve girdaba 50 μL negatif boncuk ve 50 μL fare karşıtı Ig, κ boncuk ekleyin.
- Tek boyalı bir tüpe her etiketli antikorun (CD45, CD3, CD4, CD8, CD25, CD127, CD45RA, CD27, CD19, IgD) 2 μL'sini ekleyin. Karışımı nazikçe vorteksleyin ve oda sıcaklığında (20 ° C ila 25 ° C) karanlıkta 15 dakika kuluçkaya yatırın.
- Boncukları 2 mL 1x PBS'de yeniden askıya alın, 5 dakika boyunca 300 × g'de santrifüj yapın ve süpernatanı boşaltın.
- Boncukları 0,5 mL 1x PBS ile yeniden askıya alın ve iyice karıştırın. 2 °C ila 8 °C'de saklayın.
3. İki laboratuvarda farklı sitometrelerde aynı konfigürasyon adlarını kullanma
- Sitometre yazılımında yeni bir konfigürasyon oluşturun A. Sitometre düğmesine tıklayın ve konfigürasyon penceresini görüntülemek için Konfigürasyonları görüntüle'yi seçin.
- Yapılandırma listesinde, temel yapılandırmalar klasörünü sağ tıklatın, Yeni Klasör'ü seçin ve yeniden adlandırın.
- Temel yapılandırmayı sağ tıklatın ve kopyala'yı seçin.
- Yeni klasörü sağ tıklatın ve yeni bir yapılandırma oluşturmak için temel yapılandırmayı yapıştırın. Yeni yapılandırmayı "Standartlaştırılmış Yöntem Aktarımı" olarak yeniden adlandırın.
- FITC gibi parametre adını Parametreler listesinden uygun algılayıcıya (530/30) sürükleyin.
- Ek parametreleri (PE, BB700, PE-CY7, APC, R718, APC-H7, BV421, V500 ve BV605) yeni yapılandırmada düzenleyin.
- Aynı adı "Standartlaştırılmış Yöntem Aktarımı" kullanan farklı bir akış sitometresi modelinde yeni bir yapılandırma oluşturmak için bu yöntemi izleyin. Yapılandırmanın her dedektör için aynı parametreleri içerdiğinden emin olun.
NOT: İki farklı akış sitometresi modelinde deney şablonunu başarıyla tanımlamak için, adın tutarlı olduğundan emin olun. - Sitometre yapılandırmaları altında, sitometre taban çizgisini tanımlamak ve sitometre performansını izlemek için sitometre kurulum ve izleme (CST) boncuklarını kullanın. Sitometre düğmesine tıklayın ve sitometre kurulum ve izleme çalışma alanını görüntülemek için CST'yi seçin.
- 5 mL'lik yuvarlak tabanlı polistiren test tüpünde 0,5 mL 1x PBS'ye üç damla (150 μL) kurulum boncuğu ekleyin. Boncuk tüpünü sitometreye yerleştirin.
- Kurulum Denetimi penceresinde, Temeli Tanımla'yı seçin ve Çalıştır'ı tıklatın.
4. Transfer laboratuvarında sitometre A kullanarak deneyi standartlaştırma
- Sitometre kurulumunu kullanarak bir performans kontrolü yapın ve sitometrenin iyi performans gösterdiğini doğrulamak için boncukları izleyin.
- Yazılım tarayıcı penceresinde, sitometre ayarlarına sağ tıklayın ve bir çalışma sayfası oluşturmak için Uygulama Ayarları'nı seçin.
- Lekesiz bir numune kullanarak FSC, SSC ve tüm floresan parametrelerinin fotoçarpan tüpü (PMT) voltajlarını ayarlayın. FSC: 260; SSC: 460; FITC: 490; PE: 575; BB700: 620; PE-CY7: 640; APC: 600; R718: 620; APC-H7: 620; BV421: 466; V500: 420; ve BV605: 505.
- Deneme sitometresi ayarlarına sağ tıklayın ve kaydetmek için uygulama ayarlarını seçin.
- Deneme düğmesine tıklayın ve telafi ayarları menüsünü seçin. Ardından, ücret denetimlerini otomatik olarak eklemek için Ücret denetimleri oluştur'u seçin.
- Tüm kompanzasyon kontrol boncukları için verileri kaydedin.
- Denemeye tıklayın ve telafi kurulumunu seçin. Ardından, ücreti otomatik olarak hesaplayın.
- Hücre tek lekeli kontroller için verileri kaydedin.
- R718'in telafi değerini %15 APC olarak değiştirmek için CD45RA APC kullanın. APC-H7'nin telafi değerini %14 BB700 olarak değiştirmek için CD19 BB700 kullanın. APC-H7'nin telafi değerini %60 R718 olarak değiştirmek için CD8 R718'i kullanın.
- CST boncukları için verileri kaydedin.
- CST parlak boncuklar için hedef değer şablonunun genel bir çalışma sayfasını oluşturun.
- FSC/SSC grafiği kullanarak, CST parlak boncukları için çokgen kapısını çizin. CST parlak boncukları için 10 floresan kanalının histogram grafiklerini elde edin: FITC, PE, BB700, PE-Cy7, APC, R718, APC-H7, BV421, V500 ve BV605. Histogram grafiklerinde aralık geçitleri oluşturun. Aralık geçitlerinin medyanını göstererek istatistik görünümünü oluşturun.
- Örnekleri akış sitometresinde çalıştırın; toplam 25.000 lenfosit toplamak.
- Örnekler için çözümleme şablonunun genel bir çalışma sayfasını oluşturun.
- Aşağıdaki örnek geçit stratejisini kullanın:
- CD45/yan dağılım alanı (SSC-A) nokta grafiği kullanarak, enkazı hariç tutarken sağlam lenfosit popülasyonunu tanımlamak için çokgen kapısını çizin.
- CD3/CD19 nokta grafiği kullanarak, CD3+ T hücrelerini ve CD19+ B hücrelerini seçmek için dikdörtgen bir kapı çizin.
- CD4/CD8 nokta grafiği kullanarak, CD4+ veya CD8+ T hücrelerini (sırasıyla bu belirteçler için yüksek floresansa sahip hücreler) seçmek için dörtlü bir kapı çizin.
- CD45RA/CD27 nokta grafiği kullanarak, CD8+ veya CD4+ T hücrelerini naif (CD27+CD45RA+), TCM (CD27+ CD45RA-), TEM (CD27-CD45RA-) ve TEPRA (CD27-CD45RA+) hücrelerine bölmek için dörtlü bir kapı çizin.
- CD25/CD127 nokta grafiği kullanarak, CD4+ T hücrelerini Treg hücrelerine (CD4+CD25++CD127düşük) bölmek için dörtlü bir kapı çizin.
- CD27/IgD nokta grafiği kullanarak, CD19+ B hücrelerini naif B hücrelerine (CD27-IgD+) ve bellek B hücrelerine (CD27+IgD-) bölmek için dörtlü bir kapı çizin.
- Deneysel şablonu sitometre A'ya kaydedin.
- Deneysel şablonu dışa aktarmak için CD-ROM'u kullanın.
5. Deney şablonunun test yöntemi laboratuvarında sitometre B'ye aktarılması
NOT: Deneysel şablon, cihaz ayarlarını, analiz şablonunu ve medyan floresan yoğunluğunun (MFI) hedef değer şablonunu içerir.
- Sitometrenin iyi performans gösterdiğini doğrulamak için CST boncuklarını kullanarak bir performans kontrolü yapın.
- Deneysel şablonu içe aktarın ve şablonu kullanarak B sitometresi için bir deneme oluşturun.
- Her floresan kanalı için floresan parametre voltajlarını önceki MFI cihazıyla eşleşecek şekilde ayarlamak için aynı sayıda CST boncuğu kullanın.
NOT: MFI değerleri %±5 arasında değişmektedir (aktarımdan önce ve sonra parlak boncukların MFI'sı Tablo 2'de gösterilmiştir). - Gerekirse lekesiz numuneyi kullanarak FSC voltajını ayarlayın.
- Deneysel sitometre ayarlarına sağ tıklayın ve uygulama ayarlarını kaydetmek için uygulama ayarlarını seçin.
- R718'in telafi değerini %15 APC olarak değiştirmek için CD45RA APC kullanın. APC-H7'nin telafi değerini %24 BB700 olarak değiştirmek için CD19 BB700 kullanın. APC-H7'nin telafi değerini %60 R718 olarak değiştirmek için CD8 R718'i kullanın.
- Örnekleri akış sitometresinde çalıştırın; toplam 25.000 lenfosit toplamak.
6. İki sitometrede elde edilen deneysel sonuçlar arasındaki tutarlılık
- Tek yönlü ANOVA kullanarak aletler arasındaki lenfosit alt gruplarındaki farklılıkları değerlendirin (p < 0.05).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Şekil 1'de, CST parlak boncukları için hedef değer şablonunun genel bir çalışma sayfası gösterilmektedir. Bir FSC/SSC grafiği kullanılarak, CST parlak boncuklarını seçmek için bir çokgen kapısı çizilir. CST parlak boncuklar için 10 floresan kanalının histogram grafikleri elde edildi: FITC, PE, BB700, PE-Cy7, APC, R718, APC-H7, BV421, V500 ve BV605. Her parametre için hedef değer, Tablo 2'deki histogram kapıları içindeki medyan gösterilerek görüntülenir. Sitometre A ve sitometre B yazılımındaki şablonların ve parametre ayarlarının ekran görüntüleri Ek Şekil S1'de gösterilmiştir.
Şekil 2, cihaz standardizasyonundan sonra iki cihaz arasındaki bir numunenin nokta grafiklerini göstermektedir. Veriler, otomatik analiz şablonu kullanarak farklı araçlar arasındaki tutarlılığı gösterir. Altı örneklemden elde edilen sonuçlar, Tablo 3'teki iki farklı enstrüman modelinde karşılaştırılmıştır. İki laboratuvarda 15 lenfoid alt kümesinin yüzdelerinde anlamlı bir fark ölçülmedi. Bu sonuçlar, standartlaştırılmış yöntemi takiben oldukça karşılaştırılabilir verilerin elde edildiğini göstermektedir. Farklı aletlerden 15 lenfoid alt kümesinin yüzdeleri Ek Tablo S1'de gösterilmiştir.
Şekil 1: CST parlak boncuklar için genel çalışma sayfası şablonu. CST parlak boncuklar, FSC'ye karşı SSC grafiğinde kapılıdır. CST parlak boncuklar için 10 floresan kanalının histogram grafikleri sunulmuştur. Aralık kapıları, her floresan dedektörü için CST boncuklarının parlak boncuk popülasyonunu içerecek şekilde oluşturulur. Kısaltmalar: FSC-A = ileri saçılma alanı; SSC-A = yan saçılma alanı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: İki alet arasındaki bir örneklemden alınan nokta grafiklerinin karşılaştırılması. (A) CD45 / SSC-A nokta grafiği lenfositleri geçmek için kullanılır. (B) CD3 + T hücrelerini ve CD19 + B hücrelerini geçmek için CD3 / CD19 nokta grafiği kullanılır. (C) CD4/CD8 nokta grafiği, CD3+ CD8+ T ve CD3+ CD4+ T hücrelerini tanımlamak için kullanılır. (D) Treg hücrelerini (CD4+CD25++CD127düşük) geçmek için CD25/CD127 nokta grafiği kullanılır. (E) CD4+ T hücreleri için CD45RA/CD27 nokta grafiği, naif (CD27+CD45RA+), TCM (CD27+ CD45RA-), TEM (CD27- CD45RA-) ve TEPDK'yı (CD27-CD45RA+) geçmek için kullanılır. (F) CD8+ T hücreleri için CD45RA/CD27 nokta grafiği, naif (CD27+CD45RA+), TCM (CD27+ CD45RA-), TEM (CD27- CD45RA-) ve TEPDK'yı (CD27-CD45RA+) geçmek için kullanılır. (G) CD27/IgD nokta grafiği, naif B hücrelerini (CD27- IgD+) ve bellek B hücrelerini (CD27+ IgD-) geçmek için kullanılır. Geçit stratejisi Zhang ve ark.7'dendir. Kısaltmalar: SSC-A = yan saçılma alanı; TCM = merkezi bellek T hücreleri; TEM = efektör hafıza T hücreleri; TEPDK = terminal diferansiyel efektör hafıza T hücreleri. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Antikor Hedefi | Florokrom | Klon | Katalog No | Test Başına Ses Seviyesi (μL) |
| CD4 | FITC | SK3 Serisi | 566320 | 5 |
| CD25 | PE | M-A251 Serisi | 555432 | 20 |
| CD19 | BB700 Serisi | HIB19 Serisi | 745907 | 5 |
| IgD (İngilizce) | PE-CY7 | IA6-2 | 561314 | 5 |
| CD45RA | APC | MERHABA100 Serisi | 550855 | 20 |
| CD8 | R718 Serisi | G42-8 Serisi | 751953 | 5 |
| CD3 | APC-H7 Serisi | SK7 Serisi | 560176 | 5 |
| CD127 | BV421 Serisi | HIL-7R-M21 Serisi | 562436 | 5 |
| CD45 | V500 sürümü | MERHABA30 | 560777 | 5 |
| CD27 | BV605 Serisi | L128 Serisi | 562656 | 5 |
Tablo 1: Akış sitometrik analizleri için antikor hacimleri ve konjuge florofor bilgileri. Kısaltmalar: BV = parlak menekşe; BB = parlak mavi; FITC = floresein izotiyosiyanat; PE = fikoeritrin; APC = allophycocyanin.
| Parlak boncukların MFI'sı | |||
| Kanal | Sitometre A | Sitometre B | MFI'da %Diff |
| cesaret | 22,133 | 22,689 | 2.51% |
| SSC | 1,51,361 | 1,51,261 | -0.07% |
| FITC | 9,956 | 9,964 | 0.08% |
| PE | 30,877 | 31,264 | 1.25% |
| BB700 Serisi | 19,265 | 19,440 | 0.91% |
| PE-CY7 | 14,406 | 14,375 | -0.22% |
| APC | 64,494 | 64,340 | -0.24% |
| R718 Serisi | 41,271 | 41,456 | 0.45% |
| APC-H7 Serisi | 90,666 | 90,837 | 0.19% |
| BV421 Serisi | 9,882 | 9,776 | -1.07% |
| V500 sürümü | 19,680 | 19,425 | -1.30% |
| BV605 Serisi | 10,794 | 10,356 | -4.06% |
Tablo 2: Transfer öncesi ve sonrası parlak boncukların MFI'sı. Kısaltmalar: MFI = ortalama floresan yoğunluğu; BV = parlak menekşe; BB = parlak mavi; FITC = floresein izotiyosiyanat; PE = fikoeritrin; APC = allophycocyanin.
| Yüzdelerin Ortalaması | Yüzdelerin Ortalaması | ||
| Sitometre A (n=6) | Sitometre B (n=6) | P değeri | |
| T hücreleri | 71.30 | 74.73 | 0.19 |
| CD4+ T hücreleri | 48.63 | 47.75 | 0.82 |
| CD4 + TCM | 30.68 | 28.20 | 0.06 |
| CD4+ naif | 57.60 | 58.25 | 0.90 |
| CD4+ TEM | 8.98 | 10.52 | 0.51 |
| CD4+ TEPDK | 2.73 | 3.07 | 0.81 |
| Treg (Cesaret) | 9.07 | 8.57 | 0.74 |
| CD8+ T hücreleri | 40.63 | 40.45 | 0.98 |
| CD8 + TCM | 16.83 | 14.78 | 0.75 |
| CD8+ naif | 49.08 | 47.70 | 0.80 |
| CD8+ TEM | 6.35 | 8.20 | 0.51 |
| D4+ TEPDK | 27.75 | 29.30 | 0.77 |
| B hücreleri | 13.88 | 13.20 | 0.84 |
| naif B | 67.88 | 70.38 | 0.84 |
| Hafıza B | 11.88 | 11.80 | 0.95 |
Tablo 3: Aletler arasındaki lenfosit alt kümelerindeki farklılıkların değerlendirilmesi. p > 0.05 anlamlı bir fark göstermez. Kısaltmalar: TCM = merkezi bellek T hücreleri; TEM = efektör hafıza T hücreleri; TEPDK = terminal olarak farklılaşmış efektör hafıza T hücreleri.
Ek Tablo S1: Farklı aletlerden altı örnekte lenfosit alt kümelerinin yüzdeleri. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek Şekil S1: Sitometre A ve Sitometre B yazılımındaki şablonların ve parametre ayarlarının ekran görüntüleri. (A) Şablonların XML dosyası. (B) Şablonların ekran görüntüleri. (C) Sitometre A'daki parametre ayarları. (D) Sitometre B'deki parametre ayarları.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Periferik kan lenfosit alt gruplarının immünofenotiplenmesi, çocuklarda aşılama sonrası hücre aracılı adaptif bağışıklıktaki değişikliklerin anlaşılmasına yardımcı olabilir. Klinik uygulamalarda, numunelerin zamanında tespit edilememesi veya bir akış sitometresinin değiştirilmesi gibi beklenmeyen durumlar ortaya çıkar; bu nedenle, farklı laboratuvarlardaki akış sitometreleri arasında transferleri kolaylaştıran hızlı standartlaştırılmış yöntemlere ihtiyaç vardır 9,10,11. Burada, farklı cihazlar arasında tutarlı sonuçlar sağlamak için hızlı bir şekilde standartlaştırılmış bir yöntem açıklıyoruz. Aşılama sonrası çocukların periferik kanındaki bağışıklık hücrelerini izlemek için standartlaştırılmış yöntem kullanıldı ve iki laboratuvarda tutarlı sonuçlar elde edildi. Standartlaştırılmış yöntem BD Canto ve LSRFortessa arasında kurulmuştur. Protokol ayrıca FACSCelesta, FACSymphony A5 ve FACSAria II için de uygundur. Diğer standardizasyon yöntemleri2,3 ile karşılaştırıldığında, bu standart yöntem, verilerin tutarlılığını elde etmek için üçüncü taraf yazılımların kullanılmasını gerektirmez. Farklı enstrümanlar arasında aktarım yöntemini gerçekleştirmek için hedef değer konumu ve otomatik analiz içeren bir şablon modülü oluşturmak için yalnızca Diva yazılımının özelliklerini kullanır ve veri analizi gereksinimini azaltır. Yöntem zaman kazandırır, kullanımı kolaydır ve otomatik bir geçit aletinin geliştirilmesini gerektirmez.
Bu çalışmada bir akış sitometri protokolünün standardizasyonu, sitometri ayarları, otomatik veri analizi ve hedef konum çalışma sayfasını içeren bir cihaz üzerinde deneysel bir şablon oluşturularak elde edilmiştir. Daha sonra, diğer cihazlar parametre voltajlarını hedef değere ulaşacak şekilde ayarlamak için CST boncuklarını kullanır. Farklı akış sitometresi cihazlarında başarılı bir standardizasyonu tamamlamak için birkaç önemli özellik göz önünde bulundurulmalıdır. İlk olarak, standartlaştırılmış yöntem, cihazların aynı yazılım sistemini kullanmasını gerektirir, böylece deney şablonunun XML dosyası cihazların yazılımı arasında paylaşılabilir. İkincisi, iki enstrüman konfigürasyon için aynı ada sahip olmalı ve parametreler de aynı şekilde adlandırılmalıdır. Üçüncü olarak, CST boncukları belirtilen voltaj koşulları altında hedef değerler olarak telafisi olmadan toplanmalıdır. Farklı aletlerin farklı lazer güçleri ve PMT hassasiyetleri göz önüne alındığında, voltaj parametrelerini diğer cihazlardaki hedef değerlere göre ayarlamak ve MFI değerinin% ±5 içinde olmasını sağlamak için aynı lot numarasından CST boncukları kullanmak gerekir. Dördüncüsü, cihazların günlük kalite kontrol değerlendirmeleri de çok önemlidir. Bir cihaz değerlendirmede başarısız olursa, akış hücresi kabarcıklar için temizlenmeli veya lazer kalibrasyonuna tabi tutulmalıdır. Son olarak, hazırlama prosedürlerinin neden olduğu farklılıkları azaltmak için, numuneleri farklı laboratuvarlarda analiz edebilmek için transfer ayarlarına ek olarak, bu kadar büyük çok merkezli çalışmalar yapıldığında numuneler aynı şekilde hazırlanmalıdır. Bununla birlikte, bu protokolde bellek B hücrelerinin daha iyi tanımlanması için panel optimizasyonu için hala yer vardır. Bellek B hücrelerinin sıklığı 2 yaşındaki çocuklarda nispeten düşüktür ve bu hücrelerin yüzeyindeki CD27 ekspresyonu yaygındır. Bu, işaretleyici BV605'ten daha parlak bir floresein ile değiştirilirse, bellek B hücrelerini daha iyi tanımlayabilir.
Bununla birlikte, bazı sınırlamalara dikkat edilmelidir. İlk olarak, bu deneyde standardizasyon için iki akış sitometresi kullanılmıştır; sonraki deneylere ek enstrüman modelleri dahil edilmelidir. İkincisi, lenfosit alt kümelerini ayırt etmek ve belirlemek için hücre yüzeyi boyama yöntemi kullanıldı ve daha fazla hücre içi sitokinin saptanmasını içermedi. Üçüncüsü, deneysel sonuçları iki akış sitometresinin standardizasyon süreci ile ve standardizasyon süreci olmadan karşılaştırmadık.
Bu standartlaştırılmış yöntemin avantajı, yazılım aynıysa farklı cihazların deney şablonunun XML dosyasını paylaşabilmesidir. Deneysel şablon sabit hedef değerler şablonunu içerir ve veriler yalnızca PMT voltajlarını cihazlar arasındaki hedef değerlere ayarladıktan sonra elde edilebilir. Ek olarak, deneysel şablon ayrıca otomatik kapı stratejisi analizi de içerir. Veriler elde edildikten sonra otomatik analiz raporu oluşturulur. Bu prosedürün kullanımı kolaydır ve manuel analizin neden olduğu sonuçlardaki farklılıkları azaltır. Bu standartlaştırılmış yöntem, Je aşılı çocukların tam kanındaki lenfosit alt kümelerindeki değişiklikleri, laboratuvarlar arasında farklı aletler kullanarak değerlendirmek için kullanılabilir ve çalışma projesinin birden fazla merkezde tutarlı bir şekilde gerçekleştirilmesini sağlama hedefine ulaşabilir. Bu çalışmada, standardize yöntemin yüzey boyama ile konvertibilitesini test etmeyi amaçladık ve başarısı daha sonra hücre içi boyama uygulaması için bir temel oluşturacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.
Acknowledgments
RW, Pekin Doğa Bilimleri Vakfı, Çin (No. 7222059), Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (No. 82002130), XZ, Tıp Bilimleri için CAMS İnovasyon Fonu (No. 2019-I2M-5-026) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD CompBeads Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control Compensation Particles Set | BD | 552843 | compensation |
| BD FACSCanto | BD | FACSCanto | flow Cytometry A in the transferring lab |
| BD FACSDiva CS&T Research Beads | BD | 655051 | define flow cytometer baseline and track cytometer performance |
| BD Horizon BV421 Mouse Anti-Human CD127 | BD | 562436 | Fluorescent antibody |
| BD Horizon BV605 Mouse Anti-Human CD27 | BD | 562656 | Fluorescent antibody |
| BD Horizon V500 Mouse Anti-Human CD45 | BD | 560777 | Fluorescent antibody |
| BD LSRFortessa | BD | LSRFortessa | flow Cytometry B in the test method lab |
| BD OptiBuild BB700 Mouse Anti-Human CD19 | BD | 745907 | Fluorescent antibody |
| BD OptiBuild R718 Mouse Anti-Human CD8 | BD | 751953 | Fluorescent antibody |
| BD Pharmingen APC Mouse Anti-Human CD45RA | BD | 550855 | Fluorescent antibody |
| BD Pharmingen APC-H7 Mouse Anti-Human CD3 | BD | 560176 | Fluorescent antibody |
| BD Pharmingen FITC Mouse Anti-Human CD4 | BD | 566320 | Fluorescent antibody |
| BD Pharmingen PE Mouse Anti-Human CD25 | BD | 555432 | Fluorescent antibody |
| BD Pharmingen PE-Cy7 Mouse Anti-Human IgD | BD | 561314 | Fluorescent antibody |
| Brilliant Staining Buffer Plus | BD | 566385 | Staining Buffer |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810 | Cell centrifugation |
| Centrifuge Tube | BD Falcon | BD-35209715 | 15 mL centrifuge tube |
| CS&T IVD Beads | BD | 662414 | standard beads to setup cytometer settings in different flow cytometer |
| Lysing Solution 10x Concentrate | BD | 349202 | lysing red blood cells |
| Phosphate-buffered Saline (PBS) | Gibco | 10010-023 | PBS |
| Round-bottom test tube | BD Falcon | 352235 | 5 mL test tube |
References
- Cabanski, M., et al. Flow cytometric method transfer: Recommendations for best practice. Cytometry Part B. Clinical Cytometry. 100 (1), 52-62 (2021).
- Le Lann, L., et al. Standardization procedure for flow cytometry data harmonization in prospective multicenter studies. Scientific Reports. 10 (1), 11567 (2020).
- Linskens, E., et al. Improved standardization of flow cytometry diagnostic screening of primary immunodeficiency by software-based automated gating. Frontiers in Immunology. 11, 584646 (2020).
- Glier, H., et al. Standardization of 8-color flow cytometry across different flow cytometer instruments: A feasibility study in clinical laboratories in Switzerland. Journal of Immunological Methods. 475, 112348 (2019).
- Wang, R., et al. The epidemiology and disease burden of children hospitalized for viral infections within the family Flaviviridae in China: A national cross-sectional study. PLOS Neglected Tropical Diseases. 16 (7), e0010562 (2022).
- Ding, Y., et al. Reference values for peripheral blood lymphocyte subsets of healthy children in China. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 142 (3), 970-973 (2018).
- Zhang, L., et al. Detection of polyfunctional T cells in children vaccinated with Japanese encephalitis vaccine via the flow cytometry technique. Journal of Visualized Experiments. (187), e64671 (2022).
- Yu, N., et al. CD4(+) CD25 (+) CD127 (low/-) T cells: a more specific Treg population in human peripheral blood. Inflammation. 35 (6), 1773-1180 (2012).
- Kalina, T. Reproducibility of flow cytometry through standardization: opportunities and challenges. Cytometry Part A. 97 (2), 137-147 (2020).
- Sommer, U., et al. Implementation of highly sophisticated flow cytometry assays in multicenter clinical studies: considerations and guidance. Bioanalysis. 7 (10), 1299-1311 (2015).
- Glier, H., et al. Comments on EuroFlow standard operating procedures for instrument setup and compensation for BD FACS Canto II, Navios and BD FACS Lyric instruments. Journal of Immunological Methods. 475, 112680 (2019).
