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Immunology and Infection

जापानी एन्सेफलाइटिस टीकाकरण वाले बच्चों में लिम्फोसाइटों का पता लगाने के लिए फ्लो साइटोमीटर के बीच प्रयोगशालाओं में स्थानांतरण का मानकीकरण

Published: February 10, 2023 doi: 10.3791/64949
Automatic Translation
*1, *2,3, *2,3, 1, 1, 2,3, 2,3
1Center of Excellence (Beijing), Becton Dickinson Medical Devices (Shanghai) Co Ltd, 2Beijing Key Laboratory of Pediatric Respiratory Infectious Diseases, Key Laboratory of Major Diseases in Children, Ministry of Education, National Clinical Research Center for Respiratory Diseases, Laboratory of Infection and Virology, Beijing Pediatric Research Institute, Beijing Children's Hospital, Capital Medical University, National Center for Children's Health, 3Research Unit of Critical Infection in Children, 2019RU016, Chinese Academy of Medical Sciences
* These authors contributed equally

Summary

इस अध्ययन में, जापानी एन्सेफलाइटिस-टीकाकरण वाले बच्चों में लिम्फोसाइटों का पता लगाने के लिए दो प्रयोगशालाओं में दो प्रवाह साइटोमीटर के बीच प्रयोगात्मक सेटिंग्स और विश्लेषण टेम्पलेट्स के हस्तांतरण की सुविधा के लिए एक विधि विकसित की गई थी। प्रवाह साइटोमीटर प्रयोगों के लिए मानकीकरण विधि अनुसंधान परियोजनाओं को कई केंद्रों में प्रभावी ढंग से आयोजित करने की अनुमति देगी।

Abstract

प्रयोगशालाओं की बढ़ती संख्या को कई प्रवाह साइटोमीटर से डेटा एकत्र करने की आवश्यकता होती है, विशेष रूप से कई केंद्रों में किए गए अनुसंधान परियोजनाओं के लिए। विभिन्न प्रयोगशालाओं में दो प्रवाह साइटोमीटर का उपयोग करने की चुनौतियों में मानकीकृत सामग्री की कमी, सॉफ्टवेयर संगतता के मुद्दे, उपकरण सेटअप में विसंगतियां और विभिन्न प्रवाह साइटोमीटर के लिए विभिन्न कॉन्फ़िगरेशन का उपयोग शामिल है। कई केंद्रों में प्रयोगात्मक परिणामों की स्थिरता और तुलनात्मकता प्राप्त करने के लिए एक मानकीकृत प्रवाह साइटोमेट्री प्रयोग स्थापित करने के लिए, विभिन्न प्रवाह साइटोमीटर में मापदंडों को स्थानांतरित करने के लिए एक तेजी से और व्यवहार्य मानकीकरण विधि स्थापित की गई थी।

इस अध्ययन में विकसित तरीकों ने जापानी एन्सेफलाइटिस (जेई) -टीकाकरण वाले बच्चों में लिम्फोसाइटों का पता लगाने के लिए विभिन्न प्रयोगशालाओं में दो प्रवाह साइटोमीटर के बीच प्रयोगात्मक सेटिंग्स और विश्लेषण टेम्पलेट्स के हस्तांतरण की अनुमति दी। साइटोमीटर सेटिंग्स स्थापित करने के लिए प्रतिदीप्ति मानक मोतियों का उपयोग करके दो साइटोमीटर के बीच एक सुसंगत प्रतिदीप्ति तीव्रता प्राप्त की गई थी। विभिन्न प्रकार के उपकरणों के साथ दो प्रयोगशालाओं में तुलनीय परिणाम प्राप्त किए गए थे। इस पद्धति का उपयोग करके, हम विभिन्न उपकरणों के साथ विभिन्न प्रयोगशालाओं में जेई-टीकाकरण वाले बच्चों के प्रतिरक्षा समारोह का मूल्यांकन करने के लिए विश्लेषण को मानकीकृत कर सकते हैं, कई केंद्रों में प्रवाह साइटोमीटर के बीच डेटा और परिणामों में अंतर को कम कर सकते हैं, और प्रयोगशाला परिणामों की पारस्परिक मान्यता के लिए एक व्यवहार्य दृष्टिकोण प्रदान कर सकते हैं। प्रवाह साइटोमीटर प्रयोगों की मानकीकरण विधि कई केंद्रों में अनुसंधान परियोजनाओं के प्रभावी प्रदर्शन को सुनिश्चित करेगी।

Introduction

प्रवाह साइटोमेट्री का मानकीकरण विभिन्न प्रयोगशालाओं और अध्ययन केंद्रों में विभिन्न साइटोमीटर से प्राप्त परिणामों की तुलनात्मकता के लिए उपयोगी है, और कार्य कुशलता में सुधार के लिए परिणामों की पारस्परिक मान्यता के लिए अनुकूल है। परिदृश्यों की बढ़ती संख्या के लिए मानकीकरण की आवश्यकता होती है। दवा विकास प्रक्रिया के दौरान, फ्लो साइटोमेट्री मानकीकरण महत्वपूर्ण है, क्योंकि एक विकसित और मान्य परख प्रीक्लिनिकल से नैदानिक विश्लेषण तक पूरी दवा विकास प्रक्रिया का समर्थन करेगी। फ्लो साइटोमेट्रिक विधियों को अक्सर दवा उद्योग और सहयोगी प्रयोगशालाओं के बीच स्थानांतरित किया जाताहै। इसके अलावा, मल्टीसेंट्रिक नैदानिक अध्ययनों से तुलनीय डेटा प्राप्त करना आवश्यक है। उदाहरण के लिए, मल्टीसेंट्रिक फ्लो साइटोमेट्री2 से तुलनीय डेटा प्राप्त करने के लिए सिस्टमिक ऑटोइम्यून डिजीज मल्टीमल्टी क्लिनिकल रिसर्च प्रोजेक्ट में एक मानकीकरण वर्कफ़्लो विकसित किया गया था।

प्रवाह साइटोमेट्री विधियों का मानकीकरण चुनौतीपूर्ण है। प्रयोगशालाओं में अनुभव की जाने वाली चुनौतियों को मानकीकृत सामग्रियों की कमी, सॉफ्टवेयर संगतता के मुद्दों, उपकरण सेटअप में विसंगतियों, और विभिन्न प्रवाह साइटोमीटर के बीच विभिन्न कॉन्फ़िगरेशन के उपयोग और केंद्रों के बीच अलग-अलग गेटिंग रणनीतियोंके लिए जिम्मेदार ठहराया जाता है। इसलिए, प्रयोगशालाओं के बीच एक अंतर विश्लेषण करना महत्वपूर्ण है। नमूना पहुंच, गुणवत्ता प्रणाली, कर्मियों की योग्यता और उपकरण विन्यास की समीक्षा की जानी चाहिए ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि आवश्यकताओं को पूरा किया गया है।

वर्तमान में, जापानी एन्सेफलाइटिस (जेई) वैक्सीन के साथ टीकाकरण किए गए बच्चों में जेई 5 की घटनाओं में काफी कमी आईहै। परिधीय रक्त प्रतिरक्षा कोशिकाओं की निगरानी टीकाकरण के बाद सेल-मध्यस्थता अनुकूली प्रतिरक्षा में परिवर्तन और परिधीय रक्त लिम्फोसाइट उपसमुच्चय में परिवर्तन और टीकाकरण के प्रभावों के बीच सहसंबंध को समझने में मदद कर सकती है। पूरे रक्त के नमूनों की सीमित स्थिरता के कारण, वैक्सीन प्रभावकारिता का मूल्यांकन अक्सर कई केंद्रों में किया जाता है। इस विश्लेषण के लिए, हमने भोले सीडी 8 + या सीडी 4 + टी कोशिकाओं को सीडी 27 + सीडी 45 आरए + के रूप में, केंद्रीय मेमोरी टी कोशिकाओं (टीसीएम) को सीडी 27 + सीडी 45 आरए - के रूप में, प्रभावक मेमोरी टी कोशिकाओं (टीईएम) को सीडी 27 - सीडी 45 आरए - और टर्मिनल रूप से विभेदित प्रभावक मेमोरी टी कोशिकाओं (टीईएमआरए) को सीडी 27 - सीडी 45 आरए + के रूप में परिभाषित किया। सीडी 19 + बी कोशिकाओं को आबादी में विभाजित किया जा सकता है जो सीडी 27 बनाम आईजीडी 6,7 को व्यक्त करते हैं, भोले बी कोशिकाएं सीडी 27 एन मेमोरी बी कोशिकाओं (एमबीसी) को आईजीडी6 की अभिव्यक्ति के आधार पर पहचाना जा सकता है, और नियामक टी कोशिकाओं (ट्रेग्स) को सीडी 4 + सीडी 25 + + सीडी 127कम 8 के रूप में पहचाना जा सकता है। कई केंद्रों में प्रयोगात्मक परिणामों की स्थिरता और तुलनात्मकता प्राप्त करने के लिए एक मानकीकृत फ्लो साइटोमेट्री प्रयोग स्थापित करने के लिए, जेई-टीकाकरण वाले बच्चों के पूरे रक्त में लिम्फोसाइटों का पता लगाने के लिए विभिन्न प्रवाह साइटोमीटर में प्रोटोकॉल के हस्तांतरण की सुविधा के लिए एक तेजी से और व्यवहार्य मानकीकरण विधि स्थापित की गई थी। बीजिंग चिल्ड्रन हॉस्पिटल, कैपिटल मेडिकल यूनिवर्सिटी से छह स्वस्थ बच्चों (2 साल) की भर्ती की गई थी। 6 महीने से भी कम समय पहले लाइव-एटेन्यूएटेड जेई एसए 14-14-2 वैक्सीन के साथ प्राइम और बूस्ट टीकाकरण प्राप्त करने के बाद, स्वयंसेवकों से परिधीय रक्त के नमूने एकत्र किए गए थे। मानकीकृत प्रक्रियाओं के बाद विभिन्न उपकरणों से अत्यधिक तुलनीय डेटा प्राप्त किया गया था, जो बहुआयामी आकलन के लिए सहायक है।

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Protocol

अध्ययन को बीजिंग चिल्ड्रन हॉस्पिटल, कैपिटल मेडिकल यूनिवर्सिटी (अनुमोदन संख्या: 2020-के -85) की आचार समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था। मानव विषयों की सूचित सहमति को माफ कर दिया गया था क्योंकि इस अध्ययन में नैदानिक परीक्षण के बाद केवल अवशिष्ट नमूनों का उपयोग किया गया था। इस अध्ययन में दो प्रयोगशालाएं शामिल हैं। स्थानांतरण प्रयोगशाला वह जगह है जहां एक प्रवाह साइटोमीटर का उपयोग करके मानकीकृत विधि विकसित की गई थी। इस प्रयोगशाला में साइटोमीटर को इसके बाद साइटोमीटर ए के रूप में जाना जाता है। परीक्षण विधि प्रयोगशाला वह प्रयोगशाला है जो एक अन्य प्रवाह साइटोमीटर का उपयोग करके विधियों को प्राप्त करती है, और इस प्रयोगशाला में साइटोमीटर को बाद में साइटोमीटर बी के रूप में जाना जाता है।

1. परिधीय रक्त नमूना संग्रह और सेल तैयारी

  1. मानक वेनिपंक्चर द्वारा ईडीटीए-के 2-एंटीकोगुलेटेड ट्यूबों में जेई-टीकाकरण वाले बच्चों और टीकाकरण से वंचित बच्चों से परिधीय रक्त के नमूने (2 एमएल) एकत्र करें।
  2. ट्यूबों को 10 गुना उल्टा करके पूरे रक्त के नमूने को मिलाएं। 12 मिमी x 75 मिमी ट्यूब में पूरे रक्त का 100 μL जोड़ें। प्रत्येक नमूना डुप्लिकेट में बनाएं।
  3. 12 मिमी x 75 मिमी ट्यूब में शानदार दाग बफर (बीवी बफर) का 10 μL जोड़ें। बीवी बफर में प्रत्येक एंटीबॉडी (सीडी 45, सीडी 3, सीडी 4, सीडी 8, सीडी 127, सीडी 27, सीडी 19, आईजीडी; कमजोर पड़ने वाला कारक: 1: 20) और एंटीबॉडी के 20 μL (CD25, CD45RA; कमजोर पड़ने कारक: 1: 5) जोड़ें। भंवर धीरे से।
    नोट: एंटीबॉडी अभिकर्मकों की मात्रा और जानकारी तालिका 1 में दिखाई गई है।
  4. पूरे रक्त के नमूने के साथ ट्यूब में एंटीबॉडी कॉकटेल जोड़ें। भंवर धीरे से और अंधेरे में 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेने।
  5. 1x lysing समाधान तैयार करने के लिए आसुत जल के साथ 10x लाइसिंग घोल 1:10 को पतला करें। 1x लाइसिंग समाधान के 2 एमएल जोड़कर रक्त के नमूनों को लाइस करें। भंवर धीरे से और कमरे के तापमान पर अंधेरे में 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  6. सेंट्रीफ्यूज 5 मिनट के लिए 300 × ग्राम पर और सतह पर तैरने वाले को अलग करता है।
  7. 1x PBS के 2 mL में गोली को फिर से निलंबित करें, सेंट्रीफ्यूज को 5 मिनट के लिए 300 × ग्राम पर रखें, और सुपरनैटेंट को डिकैंटिंग करें।
  8. गोली को 1x PBS के 0.5 mL में पुन: निलंबित करें और अच्छी तरह मिलाएं। 2 डिग्री सेल्सियस से 8 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। प्रवाह साइटोमेट्रिक विश्लेषण के लिए नमूने दो प्रयोगशालाओं में भेजें।
    नोट: नकारात्मक नियंत्रण नमूना और सेल एकल-दाग नियंत्रण एक साथ संसाधित किया जाना चाहिए।

2. मुआवजा मोती और एकल दाग वाले नियंत्रण तैयार करना

  1. लेबल V500-एंटी-CD45 सिंगल-दागदार, APC-H7-एंटी-CD3 सिंगल-दागदार, FITC-एंटी-CD4 सिंगल-सना हुआ, R718-एंटी-CD8 सिंगल-दागदार, BV605-एंटी-CD27 सिंगल-दागदार, APC-एंटी-CD45RA सिंगल-दागदार, PE-anti-CD25 सिंगल-दागदार, BV421-एंटी-CD127 सिंगल-सना हुआ, BB700-एंटी-CD127 सिंगल-सना हुआ, BB700-एंटी-दागदार, BB700-एंटी-CD19
  2. 5 एमएल राउंड-बॉटम पॉलीस्टाइनिन टेस्ट ट्यूब में 1% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) युक्त 1 एक्स डलबेको के फॉस्फेट-बफर्ड सेलाइन (डीपीबीएस) बफर का 100 μL जोड़ें।
  3. प्रत्येक ट्यूब और भंवर में नकारात्मक मोतियों के 50 μL और एंटी-माउस Ig के 50 μL जोड़ें।
  4. एकल-दाग वाली ट्यूब में प्रत्येक लेबल एंटीबॉडी (CD45, CD3, CD4, CD8, CD25, CD127, CD45RA, CD27, CD19, IgD) के 2 μL जोड़ें। भंवर मिश्रण को धीरे से और कमरे के तापमान (20 डिग्री सेल्सियस से 25 डिग्री सेल्सियस) पर अंधेरे में 15 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  5. मोतियों को 1x PBS के 2 mL में पुन: निलंबित करें, सेंट्रीफ्यूज को 5 मिनट के लिए 300 × ग्राम पर रखें, और सतह पर तैरने वाले को अलग करें।
  6. मोतियों को 1x PBS के 0.5 mL में पुन: निलंबित करें और अच्छी तरह मिलाएं। 2 डिग्री सेल्सियस से 8 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

3. दो प्रयोगशालाओं में अलग-अलग साइटोमीटर पर समान कॉन्फ़िगरेशन नामों का उपयोग करना

  1. साइटोमीटर A के सॉफ़्टवेयर में एक नया कॉन्फ़िगरेशन बनाएँ. साइटोमीटर बटन क्लिक करें और कॉन्फ़िगरेशन विंडो प्रदर्शित करने के लिए कॉन्फ़िगरेशन देखें चुनें.
  2. कॉन्फ़िगरेशन सूची में, आधार कॉन्फ़िगरेशन फ़ोल्डर राइट-क्लिक करें, नया फ़ोल्डर चुनें, और उसका नाम बदलें.
  3. आधार कॉन्फ़िगरेशन राइट-क्लिक करें और प्रतिलिपि चुनें.
  4. नया फ़ोल्डर राइट-क्लिक करें और एक नया कॉन्फ़िगरेशन बनाने के लिए आधार कॉन्फ़िगरेशन चिपकाएँ। नए कॉन्फ़िगरेशन "मानकीकृत विधि स्थानांतरण" का नाम बदलें।
  5. पैरामीटर सूची से पैरामीटर नाम, जैसे FITC, को उपयुक्त डिटेक्टर (530/30) पर खींचें।
  6. अतिरिक्त पैरामीटर (PE, BB700, PE-CY7, APC, R718, APC-H7, BV421, V500, और BV605) को नए कॉन्फ़िगरेशन में संपादित करें.
  7. एक ही नाम "मानकीकृत विधि स्थानांतरण" का उपयोग करएक अलग प्रवाह साइटोमीटर मॉडल पर एक नया कॉन्फ़िगरेशन बनाने के लिए इस विधि का पालन करें। सुनिश्चित करें कि कॉन्फ़िगरेशन में प्रत्येक डिटेक्टर के लिए समान पैरामीटर शामिल हैं।
    नोट: दो अलग-अलग प्रवाह साइटोमीटर मॉडल पर प्रयोग टेम्पलेट की सफलतापूर्वक पहचान करने के लिए, सुनिश्चित करें कि नाम सुसंगत है।
  8. साइटोमीटर कॉन्फ़िगरेशन के तहत, साइटोमीटर बेसलाइन को परिभाषित करने और साइटोमीटर प्रदर्शन को ट्रैक करने के लिए साइटोमीटर सेटअप और ट्रैकिंग (सीएसटी) मोतियों का उपयोग करें। साइटोमीटर बटन पर क्लिक करें और साइटोमीटर सेटअप और ट्रैकिंग कार्यस्थान प्रदर्शित करने के लिए सीएसटी चुनें।
  9. 5 एमएल राउंड-बॉटम पॉलीस्टाइनिन टेस्ट ट्यूब में 1x PBS के 0.5 mL में सेटअप मोतियों की तीन बूंदें (150 μL) जोड़ें। साइटोमीटर पर मोतियों की ट्यूब रखें।
  10. सेटअप नियंत्रण विंडो में, आधार रेखा निर्धारित करें चुनें, और चलाएँ क्लिक करें.

4. स्थानांतरण प्रयोगशाला में साइटोमीटर ए का उपयोग करके प्रयोग को मानकीकृत करना

  1. साइटोमीटर सेटअप का उपयोग करके प्रदर्शन जांच चलाएं और यह सत्यापित करने के लिए कि साइटोमीटर अच्छा प्रदर्शन कर रहा है।
  2. सॉफ़्टवेयर ब्राउज़र विंडो में, साइटोमीटर सेटिंग्स राइट-क्लिक करें और कार्यपत्रक बनाने के लिए अनुप्रयोग सेटिंग्स चुनें.
  3. एक बिना दाग वाले नमूने का उपयोग करके, एफएससी, एसएससी और सभी प्रतिदीप्ति मापदंडों के फोटोमल्टीप्लायर ट्यूब (पीएमटी) वोल्टेज को समायोजित करें। एफएससी: 260; एसएससी: 460; एफआईटीसी: 490; पीई: 575; बीबी 700: 620; पीई-सीवाई 7: 640; एपीसी: 600; आर 718: 620; एपीसी-एच 7: 620; बीवी 421: 466; V500: 420; और बीवी 605: 505।
  4. प्रयोग साइटोमीटर सेटिंग्स पर राइट-क्लिक करें और इसे सहेजने के लिए एप्लिकेशन सेटिंग्स चुनें।
  5. प्रयोग बटन पर क्लिक करें और मुआवजा सेटअप मेनू चुनें। फिर, स्वचालित रूप से मुआवजा नियंत्रण जोड़ने के लिए मुआवजा नियंत्रण बनाएँ चुनें.
  6. सभी मुआवजा नियंत्रण मोतियों के लिए डेटा रिकॉर्ड करें।
  7. प्रयोग पर क्लिक करें और मुआवजा सेटअप चुनें। फिर, स्वचालित रूप से मुआवजे की गणना करें।
  8. सेल एकल-दाग वाले नियंत्रणों के लिए डेटा रिकॉर्ड करें।
  9. R718 के मुआवजा मूल्य को 15% APC में संशोधित करने के लिए CD45RA APC का उपयोग करें। APC-H7 के मुआवजा मूल्य को 14% BB700 में संशोधित करने के लिए CD19 BB700 का उपयोग करें. APC-H7 के मुआवजा मूल्य को 60% R718 में संशोधित करने के लिए CD8 R718 का उपयोग करें.
  10. सीएसटी मोतियों के लिए डेटा रिकॉर्ड करें।
  11. CST उज्ज्वल मोतियों के लिए लक्ष्य मान टेम्पलेट का एक वैश्विक कार्यपत्रक बनाएँ।
  12. एसएससी प्लॉट का उपयोग करके, सीएसटी उज्ज्वल मोतियों के लिए बहुभुज गेट खींचें। सीएसटी उज्ज्वल मोतियों के लिए 10 प्रतिदीप्ति चैनलों के हिस्टोग्राम प्लॉट प्राप्त करें: एफआईटीसी, पीई, बीबी 700, पीई-साइ 7, एपीसी, आर 718, एपीसी-एच 7, बीवी 421, वी 500, और बीवी 605। हिस्टोग्राम भूखंडों में अंतराल द्वार बनाएं। अंतराल गेट के माध्य को दिखाकर सांख्यिकी दृश्य बनाएँ।
  13. प्रवाह साइटोमीटर पर नमूने चलाएं; कुल 25,000 लिम्फोसाइट्स एकत्र करें।
  14. नमूने के लिए विश्लेषण टेम्पलेट का एक वैश्विक कार्यपत्रक बनाएँ।
  15. निम्न नमूना गेटिंग रणनीति का उपयोग करें:
    1. सीडी 45/साइड स्कैटर-एरिया (एसएससी-ए) डॉट प्लॉट का उपयोग करके, मलबे को छोड़कर बरकरार लिम्फोसाइट आबादी की पहचान करने के लिए बहुभुज गेट खींचें।
    2. सीडी 3 / सीडी 1 9 डॉट प्लॉट का उपयोग करके, सीडी 3 + टी कोशिकाओं और सीडी 1 9 + बी कोशिकाओं का चयन करने के लिए एक आयताकार गेट खींचें।
    3. सीडी 4 / सीडी 8 डॉट प्लॉट का उपयोग करके, सीडी 4 + या सीडी 8 + टी कोशिकाओं (क्रमशः इन मार्करों के लिए उच्च प्रतिदीप्ति वाली कोशिकाओं) का चयन करने के लिए एक क्वाड गेट खींचें।
    4. CD45RA/CD27 डॉट प्लॉट का उपयोग करके, CD8+ या CD4+ T कोशिकाओं को भोले (CD27+CD45RA+), TCM (CD27+ CD45RA-), T EM (CD27-CD45RA-), और TEMRA (CD27-CD45RA+) कक्षों में विभाजित करने के लिए एक क्वाड गेट खींचें।
    5. सीडी 25/सीडी 127 डॉट प्लॉट का उपयोग करके, सीडी 4 + टी कोशिकाओं को ट्रेग कोशिकाओं (सीडी 4 + सीडी 25 + + सीडी 127कम) में उप-विभाजित करने के लिए एक क्वाड गेट खींचें।
    6. सीडी 27 / आईजीडी डॉट प्लॉट का उपयोग करके, सीडी 19 + बी कोशिकाओं को भोले बी कोशिकाओं (सीडी 27-आईजीडी +) और मेमोरी बी कोशिकाओं (सीडी 27 + आईजीडी-) में उप-विभाजित करने के लिए एक क्वाड गेट खींचें।
  16. साइटोमीटर ए पर प्रयोगात्मक टेम्पलेट सहेजें।
  17. प्रयोगात्मक टेम्पलेट निर्यात करने के लिए CD-ROM का उपयोग करें।

5. परीक्षण विधि प्रयोगशाला में साइटोमीटर बी में प्रयोगात्मक टेम्पलेट को स्थानांतरित करना

नोट: प्रयोगात्मक टेम्पलेट में उपकरण सेटिंग्स, विश्लेषण टेम्पलेट और औसत प्रतिदीप्ति तीव्रता (एमएफआई) का लक्ष्य मूल्य टेम्पलेट शामिल है।

  1. साइटोमीटर अच्छा प्रदर्शन कर रहा है यह सत्यापित करने के लिए सीएसटी मोतियों का उपयोग करके प्रदर्शन जांच करें।
  2. प्रयोगात्मक टेम्पलेट आयात करें और टेम्पलेट का उपयोग करके साइटोमीटर बी के लिए एक प्रयोग बनाएं।
  3. पिछले एमएफआई उपकरण से मेल खाने के लिए प्रत्येक फ्लोरेसेंस चैनल के लिए फ्लोरोसेंट पैरामीटर वोल्टेज को समायोजित करने के लिए सीएसटी मोतियों के समान लॉट का उपयोग करें।
    नोट: एमएफआई मान ±5% के भीतर भिन्न होते हैं (स्थानांतरण से पहले और बाद में उज्ज्वल मोतियों का एमएफआई तालिका 2 में दिखाया गया है)।
  4. यदि आवश्यक हो, तो बिना दाग वाले नमूने का उपयोग करके एफएससी के लिए वोल्टेज समायोजित करें।
  5. प्रयोगात्मक साइटोमीटर सेटिंग्स पर राइट-क्लिक करें और एप्लिकेशन सेटिंग्स को सहेजने के लिए एप्लिकेशन सेटिंग्स चुनें।
  6. R718 के मुआवजा मूल्य को 15% APC में संशोधित करने के लिए CD45RA APC का उपयोग करें। APC-H7 के मुआवजा मूल्य को 24% BB700 में संशोधित करने के लिए CD19 BB700 का उपयोग करें. APC-H7 के मुआवजा मूल्य को 60% R718 में संशोधित करने के लिए CD8 R718 का उपयोग करें.
  7. प्रवाह साइटोमीटर पर नमूने चलाएं; कुल 25,000 लिम्फोसाइट्स एकत्र करें।

6. दो साइटोमीटर पर प्राप्त प्रयोगात्मक परिणामों के बीच स्थिरता

  1. एक तरफ़ा एनोवा (पी < 0.05) का उपयोग करके उपकरणों के बीच लिम्फोसाइट उपसमुच्चय में अंतर का आकलन करें।

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Representative Results

चित्रा 1 सीएसटी उज्ज्वल मोतियों के लिए लक्ष्य मान टेम्पलेट का एक वैश्विक कार्यपत्रक दिखाता है। एसएससी प्लॉट का उपयोग करके, सीएसटी उज्ज्वल मोतियों का चयन करने के लिए एक बहुभुज गेट खींचा जाता है। सीएसटी उज्ज्वल मोतियों के लिए 10 प्रतिदीप्ति चैनलों के हिस्टोग्राम प्लॉट प्राप्त किए गए थे: एफआईटीसी, पीई, बीबी 700, पीई-साइ 7, एपीसी, आर 718, एपीसी-एच 7, बीवी 421, वी 500, और बीवी 605। प्रत्येक पैरामीटर के लिए लक्ष्य मान तालिका 2 में हिस्टोग्राम गेट के भीतर माध्य दिखाकर प्रदर्शित किया जाता है। साइटोमीटर ए और साइटोमीटर बी के सॉफ्टवेयर में टेम्प्लेट और पैरामीटर सेटिंग्स के स्क्रीनशॉट पूरक चित्रा एस 1 में दिखाए गए हैं।

चित्र 2 उपकरण मानकीकरण के बाद दो उपकरणों के बीच एक नमूने के डॉट प्लॉट दिखाता है। डेटा एक स्वचालित विश्लेषण टेम्पलेट का उपयोग करके विभिन्न उपकरणों के बीच स्थिरता प्रदर्शित करता है। तालिका 3 में दो अलग-अलग उपकरण मॉडल में छह नमूनों के परिणामों की तुलना की गई थी। दो प्रयोगशालाओं में 15 लिम्फोइड उपसमुच्चय के प्रतिशत में कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं मापा गया था। इन परिणामों से पता चलता है कि मानकीकृत विधि का पालन करते हुए अत्यधिक तुलनीय डेटा प्राप्त किया गया था। विभिन्न उपकरणों से 15 लिम्फोइड उपसमुच्चय के प्रतिशत पूरक तालिका एस 1 में दिखाए गए हैं।

Figure 1
चित्रा 1: सीएसटी उज्ज्वल मोतियों के लिए वैश्विक कार्यपत्रक टेम्पलेट। सीएसटी उज्ज्वल मोती एफएससी बनाम एसएससी प्लॉट में गेट किए जाते हैं। सीएसटी उज्ज्वल मोतियों के लिए 10 प्रतिदीप्ति चैनलों के हिस्टोग्राम प्लॉट प्रस्तुत किए जाते हैं। अंतराल गेट प्रत्येक प्रतिदीप्ति डिटेक्टर के लिए सीएसटी मोतियों की उज्ज्वल मोती आबादी को शामिल करने के लिए बनाए जाते हैं। संक्षेप: एफएससी-ए = आगे प्रकीर्णन क्षेत्र; एसएससी-ए = साइड स्कैटरिंग क्षेत्र। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्र 2: दो उपकरणों के बीच एक नमूने से डॉट प्लॉट की तुलना। (A) CD45/SSC-A डॉट प्लॉट का उपयोग लिम्फोसाइटों को गेट करने के लिए किया जाता है। (बी) सीडी 3 / सीडी 1 9 डॉट प्लॉट का उपयोग सीडी 3 + टी कोशिकाओं और सीडी 1 9 + बी कोशिकाओं को गेट करने के लिए किया जाता है। (C) CD4/CD8 डॉट प्लॉट का उपयोग CD3+ CD8+ T और CD3+ CD4+ T कोशिकाओं की पहचान करने के लिए किया जाता है। (D) CD25/CD127 डॉट प्लॉट का उपयोग ट्रेग कोशिकाओं (CD4+CD25++CD127 कम) को गेट करने के लिए किया जाताहै। (E) CD4+ T कोशिकाओं के लिए CD45RA/CD27 डॉट प्लॉट का उपयोग भोले (CD27+CD45RA+), TCM (CD27+ CD45RA-), TEM (CD27-CD45RA-), और TEMRA (CD27-CD45RA+) को गेट करने के लिए किया जाता है। (च) सीडी8+ टी कोशिकाओं के लिए सीडी45आरए/सीडी27 डॉट प्लॉट का उपयोग भोले (सीडी27+सीडी45आरए+), टीसीएम (सीडी27+सीडी45आरए-), टी ईएम (सीडी27-सीडी45आरए-), और टीईएमआरए (सीडी27-सीडी45आरए+) को गेट करने के लिए किया जाता है। (जी) सीडी 27 / आईजीडी डॉट प्लॉट का उपयोग भोले बी कोशिकाओं (सीडी 27- आईजीडी +) और मेमोरी बी कोशिकाओं (सीडी 27 + आईजीडी-) को गेट करने के लिए किया जाता है। गेटिंग रणनीति झांग एट अल.7 से है। संक्षेप: एसएससी-ए = साइड स्कैटरिंग क्षेत्र; टीसीएम = केंद्रीय मेमोरी टी कोशिकाएं; टीईएम = प्रभावक मेमोरी टी कोशिकाएं; टीईएमआरए = टर्मिनल डिफरेंशियल एफेक्टर मेमोरी टी कोशिकाएं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

एंटीबॉडी लक्ष्य फ्लोरोक्रोम क्लोन कैटलॉग संख्या मात्रा प्रति परीक्षण (μL)
CD4 एफआईटीसी SK3 566320 5
CD25 पीई M-A251 555432 20
CD19 BB700 HIB19 745907 5
आईजीडी PE-CY7 IA6-2 561314 5
CD45RA एपीसी HI100 550855 20
CD8 R718 G42-8 751953 5
CD3 APC-H7 SK7 560176 5
CD127 BV421 HIL-7R-M21 562436 5
CD45 V500 HI30 560777 5
CD27 BV605 L128 562656 5

तालिका 1: प्रवाह साइटोमेट्रिक विश्लेषण के लिए एंटीबॉडी वॉल्यूम और संयुग्मित फ्लोरोफोरे जानकारी। संक्षिप्तीकरण: बीवी = शानदार बैंगनी; बीबी = शानदार नीला; एफआईटीसी = फ्लोरेसिन आइसोथियोसाइनेट; पीई = फाइकोएरिथ्रिन; एपीसी = एलोफिकोसायनिन।

चमकीले मोतियों का एमएफआई
चैनल साइटोमीटर ए साइटोमीटर बी MFI में %Diff
FSC 22,133 22,689 2.51%
एसएससी 1,51,361 1,51,261 -0.07%
एफआईटीसी 9,956 9,964 0.08%
पीई 30,877 31,264 1.25%
BB700 19,265 19,440 0.91%
PE-CY7 14,406 14,375 -0.22%
एपीसी 64,494 64,340 -0.24%
R718 41,271 41,456 0.45%
APC-H7 90,666 90,837 0.19%
BV421 9,882 9,776 -1.07%
V500 19,680 19,425 -1.30%
BV605 10,794 10,356 -4.06%

तालिका 2: स्थानांतरण से पहले और बाद में उज्ज्वल मोतियों का एमएफआई। संक्षेप: एमएफआई = औसत प्रतिदीप्ति तीव्रता; बीवी = शानदार बैंगनी; बीबी = शानदार नीला; एफआईटीसी = फ्लोरेसिन आइसोथियोसाइनेट; पीई = फाइकोएरिथ्रिन; एपीसी = एलोफिकोसायनिन।

प्रतिशत का औसत प्रतिशत का औसत
साइटोमीटर ए (एन = 6) साइटोमीटर बी (एन = 6) P मान
टी कोशिकाएं 71.30 74.73 0.19
CD4+ T कोशिकाएँ 48.63 47.75 0.82
CD4+ TCM 30.68 28.20 0.06
CD4+ भोला 57.60 58.25 0.90
CD4+ TEM 8.98 10.52 0.51
CD4+ TEMRA 2.73 3.07 0.81
ट्रेग 9.07 8.57 0.74
CD8+ T कोशिकाएँ 40.63 40.45 0.98
CD8+ TCM 16.83 14.78 0.75
CD8+ भोला 49.08 47.70 0.80
CD8+ TEM 6.35 8.20 0.51
D4+ TEMRA 27.75 29.30 0.77
बी कोशिकाएं 13.88 13.20 0.84
भोले बी 67.88 70.38 0.84
मेमोरी बी 11.88 11.80 0.95

तालिका 3: उपकरणों के बीच लिम्फोसाइट उपसमुच्चय में अंतर का आकलन। p > 0.05 कोई महत्वपूर्ण अंतर इंगित नहीं करता है। संक्षेप: टीसीएम = केंद्रीय मेमोरी टी कोशिकाएं; टीईएम = प्रभावक मेमोरी टी कोशिकाएं; टीईएमआरए = टर्मिनल रूप से विभेदित प्रभावक मेमोरी टी कोशिकाएं।

पूरक तालिका एस 1: विभिन्न उपकरणों से छह नमूनों मेंलिम्फोसाइट उपसमुच्चय का प्रतिशत। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्रा एस 1: साइटोमीटर ए और साइटोमीटर बी के सॉफ्टवेयर में टेम्प्लेट और पैरामीटर सेटिंग्स के स्क्रीनशॉट। (ए) टेम्प्लेट की एक्सएमएल फ़ाइल। (बी) टेम्प्लेट के स्क्रीनशॉट। (C) साइटोमीटर A. (D) साइटोमीटर B में पैरामीटर सेटिंग्स कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

परिधीय रक्त लिम्फोसाइट उपसमुच्चय के इम्यूनोफेनोटाइपिंग बच्चों में टीकाकरण के बाद सेल-मध्यस्थता अनुकूली प्रतिरक्षा में परिवर्तन को समझने में मदद कर सकते हैं। नैदानिक अनुप्रयोगों में, अप्रत्याशित स्थितियां होती हैं, जैसे कि समय पर तरीके से नमूनों का पता लगाने में विफलता या प्रवाह साइटोमीटर का प्रतिस्थापन; इसलिए, तेजी से मानकीकृत तरीके जो विभिन्न प्रयोगशालाओं में प्रवाह साइटोमीटर के बीच स्थानांतरण की सुविधा प्रदान करते हैं, उन्हें 9,10,11 की आवश्यकता होती है। यहां, हम विभिन्न उपकरणों के बीच लगातार परिणाम सुनिश्चित करने के लिए एक तेजी से मानकीकृत विधि का वर्णन करते हैं। टीकाकरण के बाद बच्चों के परिधीय रक्त में प्रतिरक्षा कोशिकाओं की निगरानी के लिए मानकीकृत विधि का उपयोग किया गया था, और दो प्रयोगशालाओं में लगातार परिणाम प्राप्त किए गए थे। मानकीकृत विधि बीडी कैंटो और एलएसआरफोर्टेसा के बीच स्थापित की गई थी। प्रोटोकॉल FACSCelesta, FACSymphony A5, और FACSAria II के लिए भी उपयुक्त है। अन्य मानकीकरण विधियों 2,3 की तुलना में, इस मानक विधि को डेटा की स्थिरता प्राप्त करने के लिए तृतीय-पक्ष सॉफ़्टवेयर के उपयोग की आवश्यकता नहीं है। यह केवल विभिन्न उपकरणों के बीच हस्तांतरण की विधि का एहसास करने के लिए लक्ष्य मूल्य स्थिति और स्वचालित विश्लेषण युक्त टेम्पलेट मॉड्यूल बनाने के लिए दिवा सॉफ्टवेयर की विशेषताओं का उपयोग करता है, और डेटा विश्लेषण की आवश्यकता को कम करता है। विधि समय बचाती है, संचालित करना आसान है, और स्वचालित गेटिंग टूल के विकास की आवश्यकता नहीं है।

इस अध्ययन में फ्लो साइटोमेट्री प्रोटोकॉल का मानकीकरण एक उपकरण पर एक प्रयोगात्मक टेम्पलेट बनाकर प्राप्त किया जाता है जिसमें साइटोमेट्री सेटिंग्स, स्वचालित डेटा विश्लेषण और लक्ष्य स्थिति कार्यपत्रक शामिल होते हैं। फिर, अन्य उपकरण लक्ष्य मान तक पहुंचने के लिए पैरामीटर वोल्टेज को समायोजित करने के लिए सीएसटी मोतियों का उपयोग करते हैं। विभिन्न प्रवाह साइटोमीटर उपकरणों में सफल मानकीकरण को पूरा करने के लिए कई महत्वपूर्ण विशेषताओं पर विचार किया जाना चाहिए। सबसे पहले, मानकीकृत विधि के लिए उपकरणों को एक ही सॉफ्टवेयर सिस्टम का उपयोग करने की आवश्यकता होती है, ताकि प्रयोग टेम्पलेट की एक्सएमएल फ़ाइल को उपकरणों के सॉफ्टवेयर के बीच साझा किया जा सके। दूसरा, कॉन्फ़िगरेशन के लिए दो उपकरणों का एक ही नाम होना चाहिए, और मापदंडों को भी समान रूप से नामित किया जाना चाहिए। तीसरा, सीएसटी मोतियों को लक्ष्य मूल्यों के रूप में मुआवजे के बिना निर्दिष्ट वोल्टेज शर्तों के तहत एकत्र किया जाना चाहिए। विभिन्न उपकरणों की विभिन्न लेजर शक्तियों और पीएमटी संवेदनशीलता को देखते हुए, अन्य उपकरणों पर लक्ष्य मूल्यों के अनुसार वोल्टेज मापदंडों को समायोजित करने के लिए एक ही लॉट संख्या से सीएसटी मोतियों का उपयोग करना आवश्यक है, और यह सुनिश्चित करना कि एमएफआई मूल्य ±5% के भीतर है। चौथा, उपकरणों के दैनिक गुणवत्ता नियंत्रण आकलन भी बहुत महत्वपूर्ण हैं। यदि एक उपकरण मूल्यांकन में विफल रहता है, तो प्रवाह सेल को बुलबुले के लिए साफ किया जाना चाहिए या लेजर अंशांकन के अधीन होना चाहिए। अंत में, तैयारी प्रक्रियाओं के कारण होने वाले मतभेदों को कम करने के लिए, नमूने को एक समान तरीके से तैयार किया जाना चाहिए जब इस तरह के बड़े बहु-केंद्र अध्ययन आयोजित किए जाते हैं, इसके अलावा विभिन्न प्रयोगशालाओं में नमूनों का विश्लेषण करने में सक्षम होने के लिए सेटिंग्स को स्थानांतरित किया जाता है। हालांकि, इस प्रोटोकॉल में मेमोरी बी कोशिकाओं की बेहतर पहचान के लिए पैनल अनुकूलन के लिए अभी भी जगह है। मेमोरी बी कोशिकाओं की आवृत्ति 2 साल के बच्चों में अपेक्षाकृत कम है, और इन कोशिकाओं की सतह पर सीडी 27 अभिव्यक्ति फैल जाती है। यह मेमोरी बी कोशिकाओं की बेहतर पहचान कर सकता है यदि मार्कर को बीवी 605 की तुलना में एक उज्जवल फ्लोरेसिन के साथ बदल दिया जाता है।

हालांकि, कुछ सीमाओं पर ध्यान दिया जाना चाहिए। सबसे पहले, इस प्रयोग में मानकीकरण के लिए दो प्रवाह साइटोमीटर का उपयोग किया गया था; अतिरिक्त उपकरण मॉडल को बाद के प्रयोगों में शामिल किया जाना चाहिए। दूसरा, कोशिका सतह धुंधला विधि का उपयोग लिम्फोसाइट उपसमुच्चय को अलग करने और निर्धारित करने के लिए किया गया था और इसमें अधिक इंट्रासेल्युलर साइटोकिन्स का पता लगाना शामिल नहीं था। तीसरा, हमने दो प्रवाह साइटोमीटर के मानकीकरण प्रक्रिया के साथ और बिना प्रयोगात्मक परिणामों की तुलना नहीं की।

इस मानकीकृत विधि का लाभ यह है कि सॉफ्टवेयर समान होने पर विभिन्न उपकरण प्रयोग टेम्पलेट की एक्सएमएल फ़ाइल साझा कर सकते हैं। प्रयोगात्मक टेम्पलेट में निश्चित लक्ष्य मान टेम्पलेट होता है, और डेटा केवल पीएमटी वोल्टेज को उपकरणों के बीच लक्ष्य मानों में समायोजित करने के बाद प्राप्त किया जा सकता है। इसके अलावा, प्रयोगात्मक टेम्पलेट में स्वचालित गेट रणनीति विश्लेषण भी शामिल है। एक बार डेटा प्राप्त हो जाने के बाद, स्वचालित विश्लेषण रिपोर्ट उत्पन्न होती है। यह प्रक्रिया संचालित करना आसान है और मैन्युअल विश्लेषण के कारण परिणामों में अंतर को कम करता है। इस मानकीकृत विधि का उपयोग प्रयोगशालाओं में विभिन्न उपकरणों का उपयोग करके जेई-टीकाकरण वाले बच्चों के पूरे रक्त में लिम्फोसाइट उपसमुच्चय में परिवर्तन का आकलन करने के लिए किया जा सकता है, यह सुनिश्चित करने के लिए लक्ष्य प्राप्त करना कि अध्ययन परियोजना कई केंद्रों में लगातार की जाती है। इस अध्ययन में, हम सतह धुंधला करके मानकीकृत विधि की परिवर्तनीयता का परीक्षण करने का लक्ष्य रखते हैं, और इसकी सफलता बाद में इंट्रासेल्युलर धुंधलापन के अभ्यास के लिए एक नींव रखेगी।

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Disclosures

लेखक ों ने हितों के टकराव की घोषणा नहीं की है।

Acknowledgments

आरडब्ल्यू को बीजिंग नेचुरल साइंस फाउंडेशन, चीन (नंबर 7222059), नेशनल नेचुरल साइंस फाउंडेशन ऑफ चाइना (नंबर 82002130) द्वारा समर्थित किया गया था, एक्सजेड को मेडिकल साइंसेज के लिए सीएएमएस इनोवेशन फंड (नंबर 2019-आई 2 एम -5-026) द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BD CompBeads Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control Compensation Particles Set BD 552843 compensation
BD FACSCanto BD FACSCanto flow Cytometry A in the transferring lab
BD FACSDiva CS&T Research Beads BD 655051 define flow cytometer baseline and track cytometer performance
BD Horizon BV421 Mouse Anti-Human CD127 BD 562436 Fluorescent antibody 
BD Horizon BV605 Mouse Anti-Human CD27 BD 562656 Fluorescent antibody 
BD Horizon V500 Mouse Anti-Human CD45 BD 560777 Fluorescent antibody 
BD LSRFortessa BD LSRFortessa flow Cytometry B in the test method lab
BD OptiBuild BB700 Mouse Anti-Human CD19 BD 745907 Fluorescent antibody 
BD OptiBuild R718 Mouse Anti-Human CD8 BD 751953 Fluorescent antibody 
BD Pharmingen APC Mouse Anti-Human CD45RA BD 550855 Fluorescent antibody 
BD Pharmingen APC-H7 Mouse Anti-Human CD3 BD 560176 Fluorescent antibody 
BD Pharmingen FITC Mouse Anti-Human CD4 BD 566320 Fluorescent antibody 
BD Pharmingen PE Mouse Anti-Human CD25 BD 555432 Fluorescent antibody 
BD Pharmingen PE-Cy7 Mouse Anti-Human IgD BD 561314 Fluorescent antibody 
Brilliant Staining Buffer Plus BD 566385 Staining Buffer
Centrifuge Eppendorf 5810 Cell centrifugation
Centrifuge Tube BD Falcon BD-35209715 15 mL centrifuge tube
CS&T IVD Beads BD 662414 standard beads to setup cytometer settings in different flow cytometer
Lysing Solution 10x Concentrate BD 349202 lysing red blood cells
Phosphate-buffered Saline (PBS) Gibco 10010-023 PBS
Round-bottom test tube BD Falcon 352235 5 mL test tube

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References

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Ge, H., Zhang, L., Liu, M., Yang,… More

Ge, H., Zhang, L., Liu, M., Yang, X., Wu, X., Wang, R., Xie, Z. Standardization of Transfer across Labs between Flow Cytometers for Detection of Lymphocytes in Japanese Encephalitis Vaccinated Children. J. Vis. Exp. (192), e64949, doi:10.3791/64949 (2023).

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