Continua observación microscópica de alta resolución de replicativa envejecimiento en la levadura en ciernes

El objetivo general de este procedimiento es rastrear células de levadura haplo individuales durante toda su vida útil replicativa. El primer paso es hacer un chip microfluídico que contenga una matriz de micro almohadillas. A continuación, las células de levadura se cargan en el chip microfluídico y, debido a que el área debajo de las microalmohadillas tiene una altura similar al diámetro de una célula de levadura, las células se asentarán allí.

Posteriormente, se aplica un flujo continuo de medio fresco sobre las células de levadura atrapadas, y las células hijas emergentes son lavadas por el flujo de campo claro medio y fluorescencia. La microscopía se utiliza para visualizar los cambios en la morfología de las células u orgánulos, la expresión de proteínas y la localización de proteínas que pueden ocurrir en las células de levadura envejecidas. La principal ventaja de esta técnica sobre el método clásico de microdisección es que es menos laboriosa y que permite obtener imágenes microscópicas continuas a largo plazo de toda la vida útil de las células de levadura individuales.

Aunque este método puede proporcionar información sobre el envejecimiento replicativo, también se puede utilizar para estudios que requieren observación microscópica continua durante períodos prolongados de tiempo. En general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque se debe tener cuidado en pasos particulares de la producción del micro chip feico. Además, la carga de las células en el chip microfeico puede requerir cierta experiencia.

El molde de oblea de silicona se produce mediante litografía suave. Para obtener más información sobre su producción, consulte el protocolo adjunto. El texto corta un trozo de etiqueta resistente en tiras finas de unos 0,5 milímetros por tres milímetros.

Con un bisturí, coloque las tiras con cuidado en el molde de oblea de silicona ligeramente encima de la estructura del canal entre los canales de entrada y el micro padre. A continuación, cubra una placa de Petri de vidrio con una doble capa de papel de aluminio y coloque la oblea en la placa de Petri. El papel de aluminio evitará que el PDMS se interponga entre la oblea y la placa de Petri durante la producción de los chips microfluídicos.

Para comenzar el procedimiento para hacer chips microfluídicos, coloque un vaso de plástico vacío sobre la balanza y rasgue la balanza. Vierta 40 gramos de base de PDMS en el vaso de plástico. Agregue el agente de curado PDMS en una proporción de peso a peso de uno a 10, que en este caso es de aproximadamente cuatro mililitros.

Utilizando la pipeta de plástico desechable mezclada bien durante varios minutos, es importante que la mezcla esté bien mezclada para garantizar una polimerización adecuada del PDMS posteriormente. Vierta el PDMS encima de la oblea en la placa de Petri de vidrio. La mezcla de PDMS en la placa de Petri contendrá muchas burbujas para Degas.

El PDMS coloca, la placa de Petri en un desecado conectado a una bomba de vacío durante unos 30 minutos cuando se han eliminado todas las burbujas. Polimerice el PDMS colocando la placa de Petri con la oblea encima de una placa caliente a 120 grados centígrados durante una hora, seguida de 65 grados centígrados durante otra hora. Después de las dos horas, retire la oblea de papel de aluminio y el PDMS polimerizado de la placa de Petri de vidrio.

Despegue el papel de aluminio en PDMS desde la parte posterior de la oblea. A continuación, levante con cuidado la capa de PDMS de la parte superior de la oblea. Coloque la capa de PDMS boca abajo con los canales hacia arriba en el banco y corte con cuidado los diseños de un solo chip impresos en el PDMS con el bisturí.

Trate de retener unos tres milímetros de PDMS alrededor de los bordes de los canales. El siguiente paso es perforar agujeros en el PDMS en los extremos de la salida de entrada y el canal lateral, como se ilustra en este diagrama. Para perforar un agujero, empuje un trozo de señuelo de calibre 20 a través del PDMS de manera recta.

Retire la columna de PDMS en el talón del señuelo antes de sacarlo. De nuevo, esto evita que la columna PDMS bloquee el orificio recién perforado. Una vez que se hayan perforado todos los agujeros, limpie las superficies del chip de partículas de polvo y PDMS residuales colocando cinta adhesiva sobre él y retirando inmediatamente la cinta.

Del mismo modo, limpie la cubierta de vidrio a la que se conectará el chip. Coloque el chip y el vidrio de cubierta debajo de la lámpara UV de un limpiador de ozono UV de sobremesa con los lados que deben unirse, frente a la lámpara expuesta a la luz UV durante seis a ocho minutos, y coloque las superficies expuestas una encima de la otra. Golpee suavemente los lados del chip para promover la fijación del PDMS al cubreobjetos y para eliminar las burbujas de aire.

No golpee la parte superior de la estructura del canal, ya que esto puede hacer que las micro almohadillas se adhieran a la cubierta. El vidrio también. Coloque la configuración microfluídica recién hecha en una placa caliente a 100 grados centígrados durante una hora.

A continuación, compruebe la unión del cubreobjetos al chip PDMS levantando ligeramente los bordes del chip PDMS. Si esto no es posible, la unión es exitosa y el chip está listo para su uso. Para preparar el chip microfluídico para la carga de celdas, coloque el chip en el soporte metálico con gel de silicona entre el vidrio del chip y las partes metálicas del soporte.

Para crear un sello impermeable, atornille las tuercas suavemente para evitar romper el vidrio. Conecte tubos delgados al canal lateral y al canal de salida del chip. El uso de pinzas facilita la inserción del tubo en los orificios perforados.

Llene una jeringa de 50 mililitros con medio de cultivo. Retire el aire de la jeringa y conéctela secuencialmente a una jeringa. Filtra un trozo de señuelo de calibre 20, un tubo corto y grueso y un tubo delgado.

Coloque la jeringa en la bomba de jeringa y avance rápido la bomba hasta que el tubo delgado esté completamente lleno de medio. Empuje el tubo delgado conectado a la jeringa en el canal de entrada y deje que el medio fluya a través del chip a una velocidad de 10 microlitros por minuto. Recoja el medio dejando el chip en una placa de Petri.

El medio se agotará a través del canal lateral. Debido a la diferencia de resistencia entre el canal lateral grande y resistente y el canal de salida. Coloque el chip en la platina del microscopio y establezca el enfoque del microscopio en las almohadillas.

Para comenzar este procedimiento, conéctelo a una jeringa de punta de señuelo de cinco mililitros a un trozo de señuelo de calibre 20 y un tubo grueso. Cargue la jeringa con aproximadamente un mililitro de la suspensión de celdas para cargarla en el chip. El recuento de células preferido para la carga está entre una y cinco veces 10 de las seis células por mililitro.

Disminuya el caudal de la bomba de jeringa a 0,5 microlitros por minuto. La parte más difícil de este procedimiento es la carga de las células en el chip del microma. Por lo general, esto requiere algo de práctica.

Conecte la jeringa que contiene la suspensión de la célula al tubo del canal de salida. Cargue las pilas presionando el émbolo de la jeringa. Observe suavemente las células que entran y se depositan debajo de las microalmohadillas a través del ocular o de la pantalla del ordenador.

Mantenga la presión sobre el émbolo hasta que se asienten suficientes celdas debajo de las almohadillas. La carga óptima es de una a tres celdas por almohadilla. Desconecte la jeringa utilizada para la carga de celdas y enjuague el canal lateral durante un par de minutos a caudales más altos para eliminar las burbujas de aire o las celdas que aún no salieron del chip.

Disminuya el flujo de la bomba de jeringa a 0,5 microlitros por minuto nuevamente y cierre el canal lateral conectándolo a un tubo grueso que contenga un tapón de catéter en su extremo. Aumente el caudal de la bomba de jeringa hasta un caudal final de uno a cinco microlitros por minuto. Los caudales pueden variar según el medio y la cepa de levadura.

Comience una película con la configuración del microscopio y la cámara adecuada para el objetivo del experimento. Este es un ejemplo de película de lapso de tiempo de una sola célula E de tipo salvaje que crece en YPD. Las imágenes medianas se tomaron cada 10 minutos y la barra de escala que se acaba de mostrar representa cinco micrómetros.

La célula produce un total de 30 yemas antes de morir. La vida útil de la replicación se puede determinar contando el número de yemas producidas por una sola célula madre. Estos datos se transforman en una curva de vida útil trazando el porcentaje de células viables frente al número de yemas producidas o el número de generaciones.

Esta figura muestra un ejemplo de curvas de vida útil obtenidas para una cepa de levadura de tipo salvaje y dos cepas mutantes. La deleción del gen SER dos da como resultado una vida útil más corta, mientras que la deleción del gen FOB uno resulta en una vida útil más larga. La morfología mitocondrial en función de la edad puede estudiarse utilizando el dispositivo microfluídico.

Se realizó un experimento de envejecimiento con BY 7 42 células de levadura de tipo salvaje que expresan ILV 3G FP, que se dirige a las mitocondrias. En esta figura, un ejemplo representativo de los cambios asociados a la edad en la morfología mitocondrial en una sola célula se indica con la flecha blanca. Todas las imágenes se escalan de forma idéntica y la barra de escala representa cinco micrómetros.

La segunda película de lapso de tiempo es de una sola célula que expresa ILV 3G FP del experimento donde se observó la morfología mitocondrial en función de la edad. Las imágenes se tomaron cada 30 minutos y la barra de escala representa cinco micrómetros. Esta última figura muestra las morfologías mitocondriales observadas en el mismo conjunto de células a diferentes edades replicativas antes de producir su primera yema después de 10 yemas y antes de la muerte.

Se incluye una imagen de ejemplo de cada clase de morfología tubular, tubular fragmentado y manchas y manchas grandes. Los cambios morfológicos observados en las células de mediana edad se asemejan a los informados anteriormente mediante el monitoreo continuo de las células a medida que se dividen. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el envejecimiento replicativo de la levadura, como por qué envejece una célula de levadura, qué cambios fenotípicos se están produciendo y cómo influyen estos en la vida útil replicativa de la levadura.

Después de ver este vídeo, deberías saber cómo crear tus propios microchips y estudiar el envejecimiento replicativo en las células utilizando básicamente cualquier microscopio fluorescente.