Continua observación microscópica de alta resolución de replicativa envejecimiento en la levadura en ciernes

El objetivo general de este procedimiento es rastrear células haploides de levadura individuales durante toda su vida útil replicativa. El primer paso consiste en fabricar un chip microfluídico que contenga un arreglo de microplataformas. A continuación, las células de levadura se cargan en el chip microfluídico, y debido a que la zona situada debajo de las microplataformas tiene una altura similar al diámetro de una célula de levadura, las células se asientan allí.

Posteriormente, se aplica un flujo continuo de medio fresco sobre las células de levadura atrapadas, y las células hijas emergentes son arrastradas por el flujo del medio en microscopía de campo brillante y fluorescencia. Se utiliza microscopía para visualizar los cambios en la morfología celular u organular, la expresión proteica y la localización proteica que pueden ocurrir en células de levadura envejecidas. La principal ventaja de esta técnica frente al método clásico de microdisección es que requiere menos trabajo manual y permite obtener imágenes microscópicas continuas a largo plazo de toda la vida individual de células de levadura.

Aunque este método puede proporcionar información sobre el envejecimiento replicativo, también puede utilizarse en estudios que requieran observación microscópica continua durante períodos prolongados de tiempo. Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque es necesario tener cuidado en pasos específicos de la producción del microchip feic. Además, la carga de las células en el microchip feic puede requerir cierta experiencia.

El molde de oblea de silicio se produce mediante litografía suave. Para obtener detalles sobre su producción, consulte el protocolo adjunto. Corte un trozo de etiqueta resistente en tiras delgadas de aproximadamente 0,5 milímetros por tres milímetros.

Con un escalpelo, coloque cuidadosamente las tiras sobre el molde de oblea de silicio ligeramente encima de la estructura del canal, entre los canales de entrada y el micro padre. A continuación, cubra un recipiente de vidrio de Petri con una doble capa de papel de aluminio y coloque la oblea dentro del recipiente. El papel de aluminio evitará que el PDMS fluya entre la oblea y el recipiente durante la fabricación de los chips microfluídicos.

Para comenzar el procedimiento para fabricar chips microfluídicos, coloque un vaso de plástico vacío sobre la balanza y taree la balanza. Vierta 40 gramos de la base de PDMS en el vaso de plástico. Añada el agente de curado de PDMS en una proporción peso a peso de uno a 10, lo que en este caso equivale a aproximadamente cuatro mililitros.

Utilizando la pipeta de plástico desechable, mezcle cuidadosamente durante varios minutos; es importante que la mezcla quede bien homogeneizada para garantizar una adecuada polimerización del PDMS posteriormente. Vierta el PDMS sobre el oblea en el recipiente de vidrio de Petri. La mezcla de PDMS en el recipiente de Petri contendrá muchas burbujas que deben eliminarse mediante desgasificación.

Coloque el PDMS en la placa de Petri dentro de un desecador conectado a una bomba de vacío durante aproximadamente 30 minutos, hasta que se hayan eliminado todas las burbujas. Polimerice el PDMS colocando la placa de Petri con el oblea en la parte superior de una placa calefactora a 120 grados Celsius durante una hora, seguido de 65 grados Celsius durante otra hora. Después de las dos horas, retire el oblea de aluminio y el PDMS polimerizado de la placa de Petri de vidrio.

Retire la lámina de aluminio del PDMS desde la parte posterior del oblea. Luego, levante cuidadosamente la capa de PDMS desde la parte superior del oblea. Coloque la capa de PDMS boca abajo, con los canales hacia arriba sobre el banco de trabajo, y corte cuidadosamente los diseños individuales de los chips impresos en el PDMS con el bisturí.

Trate de conservar aproximadamente tres milímetros de PDMS alrededor de los bordes de los canales. El siguiente paso consiste en perforar orificios en el PDMS en los extremos del canal de entrada, del canal de salida y del canal lateral, como se ilustra en este diagrama. Para hacer un orificio, introduzca un punzón de calibre 20 completamente a través del PDMS de forma recta.

Retire la columna de PDMS en el extremo del cebo antes de extraer el extremo. Nuevamente, esto evita que la columna de PDMS bloquee el orificio recién perforado. Una vez que se hayan perforado todos los orificios, limpie las superficies del chip de partículas de polvo y restos de PDMS colocando cinta adhesiva sobre ellas y retirando inmediatamente la cinta.

De manera similar, limpie el cubreobjetos al que se adherirá el chip. Coloque el chip y el cubreobjetos debajo de la lámpara UV de un limpiador de ozono UV de banco, con las caras que deben unirse juntas, frente a la lámpara, expuestas a la luz UV durante seis a ocho minutos, y coloque las superficies expuestas una encima de la otra. Toque suavemente alrededor de los bordes del chip para favorecer la adhesión del PDMS al cubreobjetos y eliminar cualquier burbuja de aire.

No toque la parte superior de la estructura del canal, ya que esto podría hacer que las microplacas se adhieran a la cubierta. Tampoco el vidrio. Coloque el dispositivo microfluídico recién elaborado sobre una placa calefactora a 100 grados Celsius durante una hora.

Posteriormente, verifique la unión del vidrio de cubierta al chip de PDMS levantando ligeramente los bordes del chip de PDMS. Si esto no es posible, la unión ha sido exitosa y el chip está listo para usarse. Para preparar el chip microfluídico para la carga de células, coloque el chip en el soporte metálico con gel de silicona entre el vidrio del chip y las partes metálicas del soporte.

Para crear un sello impermeable, enrosque suavemente las tuercas para evitar romper el vidrio. Conecte tubos delgados al canal lateral y al canal de salida del chip. El uso de pinzas facilita la inserción de los tubos en los orificios perforados.

Llene una jeringa de bloqueo de cebo de 50 mililitros con medio de cultivo. Retire el aire de la jeringa y conéctela sucesivamente a una jeringa. Filtre un cebo de calibre 20, un tubo corto y grueso y un tubo delgado.

Coloque la jeringa en la bomba de jeringa y avance rápidamente la bomba hasta que el tubo delgado se llene completamente con medio. Introduzca el tubo delgado conectado a la jeringa en el canal de entrada y deje que el medio fluya a través del chip a una velocidad de 10 microlitros por minuto. Recoja el medio que sale del chip en una placa de Petri.

El medio saldrá a través del canal lateral debido a la diferencia de resistencia entre el canal lateral fabricado con la etiqueta grande y resistente y el canal de salida. Coloque el chip sobre la platina del microscopio y enfoque el microscopio en los pads.

Para comenzar este procedimiento, conecte una jeringa con punta de cinco mililitros a un conector de 20 gauge y a un tubo grueso. Cargue la jeringa con aproximadamente un mililitro de la suspensión celular que se introducirá en el chip. El recuento celular recomendado para la carga está entre uno y cinco veces 10⁶ células por mililitro.

Disminuya el caudal de la bomba de jeringa a 0,5 microlitros por minuto. La parte más difícil de este procedimiento es la carga de las células en el micromatriz. Esto generalmente requiere algo de práctica.

Conecte la jeringa que contiene la suspensión celular al tubo del canal de salida. Cargue las células presionando el émbolo de la jeringa. Observe suavemente cómo entran las células y se asientan debajo de las microplataformas a través del ocular o de la pantalla del ordenador.

Mantenga presión sobre el émbolo hasta que se asienten suficientes células debajo de las almohadillas. La carga óptima es de una a tres células por almohadilla. Desconecte la jeringa utilizada para la carga de células y lave el canal lateral durante unos minutos a tasas de flujo más altas para eliminar burbujas de aire o células que aún no hayan salido del chip.

Reduzca nuevamente el flujo de la bomba de jeringa a 0,5 microlitros por minuto y cierre el canal lateral conectándolo a un tubo grueso que contenga un tapón de catéter en su extremo. Aumente el flujo de la bomba de jeringa hasta una velocidad final de flujo de uno a cinco microlitros por minuto. Las velocidades de flujo pueden variar según el medio y la cepa de levadura.

Inicie una película con el microscopio y la configuración de la cámara adecuadas para el objetivo del experimento. Este es un ejemplo de película de lapso de tiempo de una sola célula E de tipo silvestre creciendo en YPD. Se tomaron imágenes del medio cada 10 minutos y la barra de escala mostrada representa cinco micrómetros.

La célula produce un total de 30 brotes antes de morir. La longevidad replicativa puede determinarse contando el número de brotes producidos por una sola célula madre. Estos datos se transforman en una curva de longevidad al graficar el porcentaje de células viables frente al número de brotes producidos o al número de generaciones.

Esta figura muestra un ejemplo de curvas de duración de vida obtenidas para una cepa salvaje de levadura y dos cepas mutantes. La eliminación del gen SER dos provoca una duración de vida más corta, mientras que la eliminación del gen FOB uno provoca una duración de vida más larga. La morfología mitocondrial en función de la edad puede estudiarse utilizando el dispositivo microfluídico.

Se realizó un experimento de envejecimiento con células de levadura tipo silvestre BY 7 42 que expresan ILV 3G FP, que se dirige a las mitocondrias. En esta figura, un ejemplo representativo de los cambios asociados con la edad en la morfología mitocondrial en una sola célula se indica mediante la flecha blanca. Todas las imágenes están escaladas de manera idéntica y la barra de escala representa cinco micrómetros.

La segunda película de lapso de tiempo muestra una sola célula que expresa ILV 3G FP del experimento en el que se observó la morfología mitocondrial en función de la edad. Las imágenes se tomaron cada 30 minutos y la barra de escala representa cinco micrómetros. Esta figura final muestra las morfologías mitocondriales observadas en el mismo conjunto de células a diferentes edades replicativas antes de producir su primer brote, después de 10 brotes y antes de la muerte.

Se incluye una imagen de ejemplo de cada clase de morfología: tubular, tubular fragmentado, puntos y puntos grandes. Los cambios morfológicos observados en células de edad intermedia se asemejan a los descritos previamente mediante el monitoreo continuo de las células mientras se dividen. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el envejecimiento replicativo de levaduras, como por qué envejece una célula de levadura, qué cambios fenotípicos están ocurriendo y cómo influyen estos en la longevidad replicativa de la levadura?

Después de ver este video, debería saber cómo crear sus propios microchips y estudiar el envejecimiento replicativo en células utilizando básicamente cualquier microscopio fluorescente.