형광 현장에서 하이브리드화 (물고기) 프로토콜

인간 정자 핵의 형광 현장 교잡 프로토콜은 임상 진단 분야에 널리 통합되어 있습니다. 이 방법론의 응용 분야 중 하나는 정자 ploidy screening입니다. 불임 남성에게 주어진 생식에 대한 조언의 일부로, 이러한 개인은 일반 인구보다 수치 이상의 존재가 더 높으며 종종 비정상적인 정액 매개변수를 나타냅니다.

이는 이러한 변칙성이 자손에게 전염될 위험이 증가했음을 나타냅니다. 오늘 우리는 염색체 13, 18, 21 x 및 Y의 분석을 위해 decon 응축 정자 핵의 형광 현장 혼성화 프로토콜을 설명 할 것입니다. 샘플이 수집되면 액체 작용이 발생할 때까지 20 분 동안 실온에 두어야합니다. 프로토콜을 시작하려면 샘플을 원심분리 튜브로 옮겨야 합니다.

실험의 첫 번째 부분에서 사용할 솔루션은 37°C에서 예열된 고긴장성과 3:1의 비율로 메탄올 아세트산입니다. 이것들은 신선하게 준비되어야 합니다. 그런 다음 샘플은 5 분 동안 천 Gs에서 원심 분리 할 준비가됩니다.

이제 상등액을 부드럽게 제거하고 약 10ml의 부피가 될 때까지 고긴장 용액을 한 방울씩 첨가하십시오. 이 튜브는 30분 동안 37°C에서 유지해야 하며 그런 다음 샘플을 다시 원심분리해야 합니다. 원심분리는 정자가 튜브 바닥에 모이게 하여 저장성 용액을 메탄올로 대체할 수 있도록 합니다.

아세트산 원심분리를 반복하여 메탄올 아세트산을 백색 펠릿을 얻는 데 필요한 횟수만큼 변경해야 합니다. 이 경우 더 많은 메탄올 아세트산을 첨가해야 합니다. 최종 부피는 추가 확장에서 얻고자 하는 세포 분산에 따라 조정해야 합니다.

마지막 단계는 영하 20도의 메탄올에 저장된 리드 슬라이드에 고정 샘플을 떨어뜨려 확장하는 것인데, 이는 잠재 고객 재국소화를 위해 정자 확장이 포함된 슬라이드 영역을 델리하는 데 도움이 C.It. 이것은 슬라이드 반대편에 있는 다이아몬드 연필을 사용하여 쉽게 수행할 수 있습니다. 최적의 세포 분산이 확인되면 슬라이드는 최소 24시간 동안 영하 20°C에서 보관해야 합니다.

프로토콜을 진행하기 전에. 실험의 이 부분에서는 식염수 구연산나트륨 용액 에탄올 시리즈 DRE가 치명적이고 fide를 사용할 것입니다. 슬라이드가 해동되면 고정된 샘플을 두 번의 SSC를 포함하는 두 개의 연속 코플랜 항아리에 담가 세척 및 탈수해야 합니다.

각 코플랜에 대해 3분이 소요됩니다. 그런 다음 슬라이드를 농도가 증가된 순서대로 각 에탄올 코플랜 용기에 2분 동안 담가야 합니다. 이 시점에서 다음 단계를 계속하려면 슬라이드를 건조시켜야 합니다.

정자핵의 DNA가 고도로 압축되어 있다는 점을 감안할 때, 염색질을 변성시키기 전에 염색질을 응축할 필요가 있습니다. 이것은 37°C에서 DTT 용액을 사용하여 수행할 수 있으며, 이것은 정자 핵에서 DNA를 감는 프로타민의 설루르 브리지를 파괴하여 작용하는 제품입니다. DTT에서 슬라이드의 잠복 시간은 이 제품에 대한 정액 샘플의 반응성에 따라 조정되어야 합니다.

일반적으로 이 시간은 약 8분이며, 이 시간 이후 2분에서 15분까지 다양할 수 있지만, 슬라이드는 즉시 3분 동안 두 번 SSC로 전송하고 다시 3분 동안 전송한 다음 각 에탄올 코플랜 용기에 2분씩 전송해야 합니다. 프로브 혼성화를 위해서는 단일 DNA 가닥으로 작업하는 것이 필수적입니다. 이를 위해서는 73도의 이전 진드기 용액에서 5분의 배양 기간을 포함하는 프로브를 추가하기 전에 변성 단계가 필요하며, 슬라이드 처리를 완료하기 C.To, 에탄올 용액의 최종 전달이 필요하며, 코플랜 항아리당 1분 동안 슬라이드를 담가야 합니다.

그런 다음 슬라이드는 임상 진단을 위해 수행되는 물고기 연구에서 교배될 준비가 됩니다. 가장 일반적으로 분석되는 염색체는 성염색체와 13, 18, 21번 염색체입니다. 이러한 염색체를 분석하기 위해 VICES의 다색 DNA 프로브 키트를 사용합니다.

여기에는 염색체 X, Y, 18번 염색체의 알파 위성 영역에 대한 프로브 조합이 있는 바이알 1개(각각 녹색 기원 및 아쿠아로 표시됨)와 염색체 13 및 21번(각각 녹색 및 주황색 라벨)에 대한 프로브 조합이 있는 다른 바이알이 포함되어 있습니다. 추가된 프로브 혼합물의 부피는 15 x 15 커버 슬라이드에 대한 참조로 혼성화하려는 영역의 크기에 따라 달라집니다. 5마이크로리터의 부피로 충분합니다.

두 프로브 혼합물 모두 쉽게 사용할 수 있도록 혼성화 버퍼에서 사전 변성되어 있으므로 Deacon 응축 및 변성 슬라이드에 직접 추가할 수 있습니다. 이러한 실험에 사용할 수 있는 광범위한 염색체와 Loki에 사용할 수 있는 다른 상용 프로브도 있습니다. 그러나 일반적으로 이러한 프로브는 혼합물을 대상 샘플에 첨가하기 전에 사전 변성 처리가 필요합니다.

이러한 상황에서는 제조업체의 지침을 따르는 것으로 충분합니다. 대상 영역은 커버 슬라이드로 덮고 고무 시멘트로 밀봉해야 합니다. 그런 다음 슬라이드를 혼성화 챔버에 배치하고 37°C로 예열하고 해당 온도에서 6-24시간 동안 배양할 준비가 됩니다.

프로토콜의 마지막 부분에서는 서로 다른 농도의 식염수 구연산 나트륨 용액과 세제 NP 40으로 구성된 이 두 가지 세척 용액을 사용할 것입니다. 배양 시간 후에, 활주는 고무 시멘트를 제거하기 위하여 혼성화 약실에서 제거될 수 있습니다. 그런 다음 커버 슬라이드를 조심스럽게 제거합니다.

그림과 같이 슬라이드는 첫 번째 세척 용액에서 2분 동안 잠겨 있으며 섭씨 73도로 사전 경고된 다음 실온에서 두 번째 세척 용액으로 1분 더 이동합니다. 이 두 번의 세척은 불특정 혼성화 신호를 제거하는 데 도움이 됩니다. 이 두 번의 세척 후에는 프로토콜의 마지막 단계를 완료하기 위해 슬라이드가 마를 때까지 기다려야 합니다.

이 시점에서, 세포핵의 시각화를 용이하게 하기 위해 카운터 염색 생성물이 추가됩니다. 이 목적으로 사용되는 가장 일반적인 제품 중 하나는 dpi입니다. 추가된 볼륨은 또한 18 x 18 커버 슬라이드에 대한 참조로 하이브리드 영역의 크기에 맞게 조정해야 합니다.

8마이크로리터의 DPI 부피로 충분합니다. 커버 슬라이드는 네일 바니시로 밀봉할 수 있으며 이제 준비를 시각화할 준비가 되었습니다. 그렇지 않으면 잠재 고객 분석까지 영하 20°C에서 보관할 수 있습니다.

시각화에 사용할 현미경은 dpi용 삼중 대역 필터, Texas Red, FITC용 단일 대역 필터, 삼중 대역 필터를 통해 aqua FITC 및 Texas Red용 단일 대역 필터가 장착된 Olympus BX 60 epi 형광등으로, 이 세 염색체에 대한 x, Y 및 18개의 디스플레이 신호와 혼성화된 제제입니다. 아쿠아에 대한 단일 밴드 필터를 사용하면 18번 염색체에 대한 형광 신호만 시각화할 수 있습니다. 우리는 모든 정상적인 정자에서 이러한 신호 중 하나를 예상해야 합니다.

그러나 FITC에만 단일 밴드 필터를 사용할 때 일부 정자는 X 염색체에 해당하는 형광 녹색 신호를 나타냅니다. 녹색 신호가 없는 정자는 Y 염색체에 대한 적색 신호를 표시해야 하며, 이는 삼중 밴드 필터를 통해 1321 혼성화를 시각화하는 텍사스 적색 필터를 통해 구체적으로 시각화할 수 있습니다. 우리는 이 두 염색체에 대한 신호를 구별할 수 있습니다.

녹색 신호는 13번 염색체에 해당하며 FITC용 단일 밴드 필터를 사용하여 구체적으로 시각화할 수 있습니다. Texas Red에 대한 단일 대역 필터를 사용하면 21번 염색체에 대한 신호를 구체적으로 시각화할 수 있습니다. 모든 정상적인 정자는 이 두 개의 프로브 각각에 대해 하나의 신호를 표시해야 합니다.

요약하자면, 프로토콜의 주요 단계는 다음과 같습니다. 다시 말하지만, 고정 공정은 methodol acetic acid의 한 방울 한 방울 첨가로 우수한 품질의 확장을 얻기 위해 정확하게 수행되어야 합니다. 응축 과정에서 정자 응집체의 형성을 방지하기 위해 DTT 용액의 배양 시간은 이 제품에 대한 정액 샘플의 반응성에 따라 조정되어야 합니다.

정자를 DTT에 과도하게 노출시키면 프로토콜이 끝날 때 분산 신호가 발생하는 반면, 불충분한 노출은 프로브 혼성화가 전혀 없고 일부 신호가 부족합니다. 정자 샘플의 변성은 필수이지만 프로브 변성은 제조업체의 적응증에 맞게 조정되어야 합니다. 두 번의 교잡 후 세척의 시간과 온도를 엄격하게 제어하는 것이 중요합니다.

더 높은 온도나 과도한 세척 시간은 일부 신호를 제거할 수 있는 반면, 그 반대의 경우는 불특정 신호를 제거하지 못합니다. 마지막으로, 적절한 특정 필터가 장착된 epi 형광 현미경을 사용하는 것은 우수한 시각화 및 신호 해석을 위해 필수적입니다. 그리고 그게 다야.

지켜봐 주셔서 감사드리며 실험에 행운을 빕니다.