Adhesión y agregación plaquetaria bajo flujo con células de microfluidos de flujo

El sistema de bioflujo es un instrumento automatizado y un dispositivo microfluídico para ejecutar ensayos de células vivas bajo flujo puro controlado. Este sistema utiliza tecnología microfluídica de placas de pocillos para integrar dispositivos de celda de flujo a escala micrométrica en placas de pocillos estándar SBS. BioFlex se puede utilizar para realizar estudios de adhesión y agregación de plaquetas con alto rendimiento y volúmenes sanguíneos reducidos.

La sangre entera marcada con tinte fluorescente se agrega a los pocillos y luego fluye a través de los canales. Bajo flujo puro controlado, se producen datos de microscopía de alta resolución, que cuantifican la adhesión y agregación plaquetaria en presencia de compuestos farmacológicos y otros parámetros variables. Hola, soy Mike Schwartz del laboratorio de RD en Flexion Biosciences.

Hoy le mostraremos un procedimiento para el uso de celdas de flujo microfluídicas en ensayos de adhesión plaquetaria. Utilizamos este protocolo en nuestro laboratorio para una variedad de ensayos de biología vascular. Así que comencemos.

Carne de res, antes de ejecutar el experimento de celda de flujo, los canales microfluídicos de la placa de flujo biológico deben prepararse con un recubrimiento de proteína de colágeno de interés que se utilizará en este experimento. Cada uno de los 24 canales experimentales de la placa de biofundente se conecta a un pozo de entrada y un pozo de salida para esta placa. El pocillo de entrada es el pocillo de la izquierda que alimenta el canal y el pocillo de salida está a la derecha, diluya el caldo de colágeno a una concentración de 200 microgramos por mililitro.

En ácido acético 0,02 molar, se necesitarán 20 microlitros por cada canal utilizado. Dado que este experimento requiere 11 canales, haga 200 microlitros de recubrimiento de colágeno. Un canal permanece sin recubrimiento mezclado mediante una iteración suave con una punta de micropipeta.

Agregue 20 microlitros de recubrimiento a cada canal respectivo usando una micropipeta para dispensar el líquido en el punzón interno del pocillo. La alimentación del canal microfluídico de interés, como se muestra aquí con el colorante amarillo, incluye un canal sin colágeno como control negativo para la adhesión y agregación plaquetaria. Una vez que se haya agregado el recubrimiento de colágeno a todos los canales respectivos, conecte la interfaz a la placa.

Si está utilizando la interfaz bio flux 1000, puede sujetar ambos pestillos en la plataforma. Si está utilizando el primer dedo de la interfaz Bio flux 200, apriete los cuatro tornillos. Y luego, una vez que estén todos listos, use el destornillador de par para apretar por completo.

El destornillador de par hará clic cuando alcance el máximo. Utilizando el modo manual en el software bio flux, aplique perfusión a los canales de interés a 2D por centímetro cuadrado de la salida. Bueno, use un objetivo de baja potencia en un microscopio para encontrar el pozo de entrada y observe que el punzón interno opuesto se llena de líquido.

Primero debería ver una pequeña cantidad de líquido, llenando lentamente el punzón interno después de varios minutos y cuando el punzón interno de entrada esté lleno, detenga la profusión en todos los canales presionando stop en el software. Incuba la placa a temperatura ambiente durante una hora. Durante este período de incubación, puede comenzar a preparar la sangre entera al final de la incubación de una hora.

Una vez que se haya preparado la sangre, retire la interfaz y agregue un mililitro de PBS más iones de calcio y magnesio a la salida. Comience la profusión desde el pozo de salida a dos centavos por centímetro cuadrado y continúe la profusión durante 10 minutos. Después de 10 minutos, detenga la profusión Después de quitar la interfaz, elimine el exceso de PBS de los pozos de entrada y salida.

Nunca extraiga el líquido que llena el punzón interior. Para bloquear los canales, agregue un mililitro de solución de bloqueo a cada salida. Pocillo a utilizar, perfundir desde el pocillo de salida a dos por centímetro cuadrado y continuar la perfusión durante 10 minutos.

Detenga la profusión después de 10 minutos y retire la interfaz. Los canales ya están listos y se pueden utilizar durante todo el día mientras la placa se recubre con colágeno. Durante una incubación de una hora, se debe preparar sangre humana fresca de un individuo en ayunas para obtener imágenes y entrar en la placa.

La sangre debe extraerse en citrato de sodio, anticoagulante, y usarse dentro de las tres horas posteriores a la recolección. En primer lugar, se añade a la sangre una reserva de cuatro milimolares de calcio M en DMSO a una dilución de uno a 1000 volumen por volumen. Para obtener cuatro micromolares de calcio se mezcla mediante una inversión suave.

A continuación, dispense un mililitro de la sangre marcada con calcio en diez microtubos de un punto cinco mililitros. Añada el anticuerpo inhibidor GP dos B tres a cada tubo con la dilución deseada. Asegúrese de incluir un control negativo sin anticuerpos y un control positivo de anticuerpos no relacionados mezclados por inversión suave.

Incube los tubos a temperatura ambiente durante una hora, mezclando por inversión suave cada 10 minutos antes de ejecutar el experimento de celda de flujo. Se debe establecer un protocolo automatizado en el módulo de control de flujo biológico para el colágeno. Uno. Establezca un protocolo para hacer correr la sangre a diez y nueve centímetros cuadrados durante 10 minutos desde la salida.

Bueno, usando la estación de trabajo BioFlex 1000 se deben configurar los parámetros de adquisición de datos, que incluyen la adquisición de las posiciones de etapa deseadas en la longitud de onda de Fitz y la configuración de lapso de tiempo. Un plan de adquisición de imágenes típico para este protocolo comprendería un campo de visión por canal que se capturaría utilizando un objetivo 10 x cada 30 segundos durante una duración total de 10 minutos. También son posibles campos de visión adicionales y configuraciones alternativas de TimeLapse.

Una vez que se hayan configurado el protocolo automatizado y los parámetros de adquisición de datos, regrese a la placa BioFlex y elimine el líquido a ambos lados del canal, excepto los punzones internos. Teniendo cuidado de trabajar rápidamente, coloque 500 microlitros de sangre de cada condición en los pocillos de salida de cada canal. Tenga en cuenta que los pocillos de salida se utilizan para suministrar la sangre porque es el camino más corto a la zona de visualización y proporcionará una reacción más inmediata de la sangre al recubrimiento de colágeno.

Además, coloque la sangre de control sin anticuerpos en un canal que esté cubierto de colágeno y que simplemente esté bloqueado. Coloque la placa en el microscopio de la estación de trabajo BioFlex 1000 y sujete la interfaz. Realice la calibración de la lista de etapas localizando el primer punto de calibración que se define como el origen.

A continuación, localice y marque el segundo punto de calibración. Aplique esta calibración a la lista de etapas adecuada. Esto garantiza que todas las ubicaciones de visualización en la placa se puedan encontrar automáticamente.

Mover el escenario a uno de los canales que contiene el conjunto de sangre se ajusta a los parámetros de captura de imagen, como el tiempo de exposición y la ganancia en el software de montaje BioFlex. Inicie el flujo de trabajo adecuado haciendo clic en el botón deseado. Esto iniciará el protocolo de flujo y la adquisición de imágenes simultáneamente.

Al final del experimento, retire la placa de la estación de trabajo BIOFLU 1000 y deséchela de acuerdo con las pautas institucionales. Uso de canales microfluídicos recubiertos de colágeno del sistema bio flux. La formación agresiva de trombos se observa a lo largo del tiempo con la muestra de sangre de control no tratada.

Por el contrario, no se observa formación de trombos con el canal no recubierto. En un experimento realizado recientemente, el tamaño promedio de los agregados en condiciones de control fue de 2000 micrómetros cuadrados. GP dos B tres A es un potente mediador de las interacciones plaquetarias y la estabilización de la agregación cuando se activa por adhesión al colágeno, como se muestra aquí después de la incubación con el anticuerpo anti GB dos B tres a durante una hora antes de la exposición pura, se observa una disminución en el tamaño de los trombos, así como una disminución en la frecuencia de formación de trombos.

Por lo general, se puede observar una respuesta dependiente de la dosis a diez y nueve centímetros cuadrados y el valor de IC 50 para este inhibidor en particular fue de 17 nanomolares. La inhibición máxima para este donante en comparación con el control sin anticuerpos fue del 11% a 10 centímetros cuadrados. También está disponible una placa de cizallamiento de 48 pocillos de alto para realizar experimentos de sangre total de hasta 200 D por centímetro cuadrado o 5.000 segundos inversos.

Acabamos de mostrarle cómo utilizar los canales de flujo microfluídico para realizar experimentos de biología vascular fisiológicamente relevantes. Al realizar este protocolo, es importante recordar diluir el colágeno en el tampón correcto. Utilice siempre la técnica de pipeteo correcta para evitar la introducción de burbujas de aire y siga siempre las normas de bioseguridad de su laboratorio.

Así que eso es todo. Gracias por mirar y buena suerte con tus experimentos.