Drosofilia Dissezione cerebrale adulta: un metodo nella neurobiologia della mosca

- Eseguire la dissezione in un piatto con una soluzione tampone e sotto illuminazione uniforme. Trasferire una mosca, un lato ventrale verso l'alto, nel piatto e mantenere la preparazione sommersa durante tutta la procedura. Tenendo la base della proboscide, tirare delicatamente la testa di mosca lontano dal corpo per separare i due. Il cervello si trova nella parte posteriore, o caudale, della testa della mosca. Pertanto, tenere sulla parte anteriore, o rostrale, della cuticola durante la dissezione per evitare di danneggiare l'organo.

Per isolare il cervello, tenere il bordo mediale di un occhio e afferrare e tirare la proboscide nella direzione opposta per creare un'apertura nella capsula della testa. Tenendo la cuticola a quell'occhio, afferrare il bordo mediale della cuticola dall'altro occhio e tirare lentamente la capsula della testa dritta per rivelare il cervello. Se necessario, continuare a cancellare cuticola residua, sacche d'aria attaccate o trachea. I preparati di alta qualità conserveranno strutture come i lobi ottici, il cervello centrale e il SOG. Nel protocollo di esempio, vedremo una dimostrazione dettagliata di una dissezione cerebrale adulta drosophila utilizzato per studiare i corpi dei funghi.

- Per impostare la dissezione, posizionare le mosche anestetizzate di interesse su un cuscinetto di metallo freddo o in una piastra di Petri seduta sul ghiaccio. In alternativa, utilizzare un fly pad che emette anidride carbonica. Successivamente, posizionare una piccola quantità di PTN al centro della piastra di dissezione per creare una bolla di PTN. Quindi, sotto uno stereomicroscopio, riempire il campo visivo con la bolla PTN sotto illuminazione uniforme. Ora, manipolare le mosche in modo che siano pancia in su e trasferirne una dall'addome nel PTN. Immergere completamente l'animale nella PTN ed eseguire l'intera dissezione sommersa in PTN. Con un secondo paio di forcep, afferrare la proboscide e tirare la testa fuori dal corpo.

- Occassionalmente, la proboscide verrà rimossa ma la testa rimarrà attaccata al corpo. In questo caso, afferrare il bordo mediale di una retina e applicare la forza laterale per rimuovere la testa.

- Scartare l'addome e il torace. È fondamentale mantenere la testa nel PTN durante questo passaggio. Le connessioni dal cervello centrale al VNC chiaramente non possono essere analizzate utilizzando questo metodo. Successivamente, afferrare il bordo mediale della retina sinistra sul bordo del foro centrale nella cuticola e tirare lentamente le forcep direttamente l'una dall'altra per evitare lo strappi del lobo ottico, che è la struttura opaca coperta da trachea bianca e filante. Man mano che la retina si dissocia, ci sarà una leggera diminuzione della tensione.

- Per evitare che il cervello si strappi, è di fondamentale importanza afferrare il bordo mediale di ogni occhio e allontanare molto lentamente le forcep. Muoversi troppo rapidamente può causare alterazioni della morfologia cerebrale o danni al tessuto cerebrale.

- Come mostrato qui, afferrare la cuticola con ogni coppia di forcep e tirarle molto lentamente in direzioni opposte. Se eseguita correttamente, la cuticola deve separarsi dal tessuto cerebrale, lasciando intatto il cervello. Per questo passaggio sono necessarie pini molto affilate. Successivamente, rimuovere con attenzione la cuticola circostante pezzo per pezzo. Durante la rimozione della cuticola ostinatamente attaccata, può aiutare a proteggere il cervello afferrando il VNC rimanente per evitare di schiacciare il cervello. Infine, utilizzare una pipetta P200 per trasferire il cervello sezionato in un pozzo di una piastra piena di PTN per la fissazione e l'immunostaining.