Preparación del pulmón de ratón para la citometría de flujo: generación de suspensión celular a partir de tejido pulmonar para el análisis de citometría de flujo

- Comience por tomar un ratón sacrificado y asegúrelo en una tabla de disección con cinta de laboratorio. Usa unas tijeras para cortar la piel. Hacer una incisión vertical a través del diafragma y cortar las costillas para llegar a la cavidad torácica, exponiendo el corazón y los pulmones. A continuación, haga una pequeña incisión en el ventrículo izquierdo del corazón. Posteriormente, localice el ventrículo derecho e inserte una jeringa que contenga PBS en la luz del ventrículo. Perfundir PBS a través del ventrículo derecho, permitiendo que la sangre fluya fuera de la incisión prefabricada en el ventrículo izquierdo hasta que los pulmones se vuelvan blancos. Extraiga el tejido pulmonar que contiene los nódulos tumorales y píquelo en pedazos pequeños.

Incubar los trozos en el tampón de digestión pulmonar. La colagenasa en el tampón de digestión pulmonar ayuda a aislar las células, y la ADNasa ayuda a eliminar el ADN de las células muertas. Cuele la suspensión resultante a través de un colador de celdas para eliminar los grumos y hacer que la suspensión de celdas sea uniforme. Centrifugar y resuspender el pellet en el tampón de cloruro de amonio y potasio para lisar los eritrocitos residuales. Centrífuga para recoger los glóbulos blancos y las células tumorales en el pellet. Vuelva a suspender el pellet en PBS suplementado con FCS, para mantener la estabilidad celular. En el siguiente protocolo, demostraremos la preparación de la suspensión de células pulmonares para el análisis por citometría de flujo.

Después del criterio de valoración experimental apropiado, remoje el cadáver en etanol al 70% y asegure el animal a una tabla de disección. Haga una incisión en la línea media ventral e invierta suavemente la piel para exponer los músculos de la pared torácica y los órganos abdominales. Utilice unas tijeras para perforar el diafragma y cortar las costillas que exponen la cavidad torácica. Corte una pequeña abertura en el ventrículo izquierdo y use una aguja de calibre 27 para perfundir el pulmón tres veces a través del ventrículo derecho con 6 a 8 mililitros de PBS helado por infusión. Después de la última perfusión, los pulmones deben estar completamente limpios de sangre y tener un aspecto blanco. Después de la recolección, use unas tijeras para picar el tejido pulmonar en trozos pequeños.

Transfiera los fragmentos pulmonares a un tubo de microcentrífuga de 2 mililitros que contenga 1,5 mililitros de tampón de digestión pulmonar para una incubación de 30 a 60 minutos a 37 grados Celsius con agitación. Al final de la digestión, transfiera la suspensión celular a través de un colador celular de 70 micras a un tubo de 50 mililitros y use el extremo de un émbolo de jeringa estéril de 10 mililitros para presionar los fragmentos de tejido restantes a través del filtro. Enjuague el colador con 15 mililitros de PBS suplementado con FCS al 2% y recoja las células por centrifugación. Vuelva a suspender el pellet en 1 mililitro de tampón de lisis de cloruro de amonio y potasio durante una incubación de 5 minutos a temperatura ambiente y vuelva a centrifugar las células. A continuación, resuspender el glóbulo de glóbulos blancos en 1 mililitro de PBS suplementado con FCS al 2% y teñir las células para el análisis de citometría de flujo según el protocolo experimental.