Aislamiento y Caracterización de Hoechst Baja CD45 Negativo Mouse células madre mesenquimales de pulmón

Este video muestra un protocolo para el aislamiento de células madre mesenquimales pulmonares negativas para CD 45 del huésped. Las células madre mesenquimales resonantes tisulares o MSC son importantes reguladores de la reparación o regeneración de tejidos, fibrosis, inflamación y angiogénesis. Primero, se diseccionan los pulmones de un ratón sacrificado.

El tejido pulmonar se digiere para obtener una suspensión de una sola célula. Las células se tiñen con troquel falso y CD 45 y se clasifican mediante citometría de flujo para obtener MSC pulmonares negativas para CD 45 bajo del huésped. A continuación, las MSC pulmonares se expanden en cultivo y se realiza un ensayo de formación de colonias para evaluar las capacidades de diferenciación de las MSC.

A continuación, se pueden realizar más estudios para examinar el papel de las MSC durante la homeostasis de los tejidos y la enfermedad. El método que mostramos aquí se puede utilizar para aislar células madre mesenquimales pulmonares de ratón o humanos y se puede aplicar a este estudio de enfermedades pulmonares como la fibrosis pulmonar, la hipertensión pulmonar y la EPOC. Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades debido a la variedad de métodos disponibles para la preparación de tejidos, así como a la configuración del citómetro de flujo, los controles y análisis adecuados.

La demostración visual de este método es fundamental, ya que es difícil describir la técnica adecuada para picar y digerir el tejido pulmonar para una viabilidad óptima de las células solo con palabras. Además, la configuración y los análisis del instrumento de citometría de flujo se comunican mejor a través de la demostración. Comience este protocolo extrayendo los pulmones que se utilizarán para obtener células madre mesenquimales de un ratón adulto sacrificado.

Use un par pequeño de tijeras afiladas para cortar la caja torácica lateralmente a cada lado del ratón. Abra la cavidad torácica y luego retire el diafragma. Inserte una jeringa de 10 mililitros con una aguja de calibre 20 y medio en el ventrículo cardíaco derecho y presione suavemente el émbolo para perfundirlo con tres a cinco mililitros de PBS, eliminando la sangre de los pulmones.

A continuación, con unas tijeras, corte la tráquea y el bronce grande y deséchelos. Luego, usando fórceps. Recoja los pequeños lóbulos de pulmón blancos y colóquelos en una placa de Petri llena de solución salina tamponada de Hank o HBSS.

A continuación, se extrae el corazón y se separan los lóbulos pulmonares. Repita este proceso para todos los ratones del estudio. Transfiera los lóbulos pulmonares a la tapa del plato.

Humedezca el pañuelo con suficiente HBSS para evitar que se sequen. Luego, con un bisturí desechable, pique los lóbulos pulmonares para obtener médula ósea y usar el control de sostenimiento para la citometría de flujo. Usa un par de tijeras afiladas para cortar el tobillo y la parte superior del fémur.

Coloque la extremidad en una nueva placa de Petri. A continuación, corta la rodilla, dejando un trozo lineal de fémur y un segundo trozo que contiene la tibia y el peroné. Con pinzas, retira el músculo para revelar la tibia, el peroné y el fémur.

Ahora tome una jeringa de cinco mililitros con una aguja de calibre 26 y medio e inserte la aguja en la abertura de la médula ósea. En un extremo de la tibia, sostenga el hueso con el otro extremo dirigido a un tubo cónico de 50 mililitros lleno de HBSS de 15 mililitros y presione el émbolo para dispensar HBSS y enjuagar la médula ósea en el tubo. Repite este proceso con un peroné y un fémur.

Teñir la médula ósea con el huésped 3 3 3 4 2 die a una concentración final de cinco microgramos por mililitro en DMEM de alta glucosa suplementado. A continuación, se generará una suspensión unicelular de tejido pulmonar a partir del tejido aislado. Coloque cada pulmón en un tubo que contenga precalentamiento.0.2%Worthington.

Colágenosa tipo dos Preparado en HBSS estéril, luego sumergir el tubo en un baño de agua a 37 grados centígrados e incubar durante 30 minutos. Después de la incubación, utilice la pipeta de 10 mililitros para tritratar la muestra hasta que la digestión fluya fácilmente a través de la pipeta. Aproximadamente 10 repeticiones se incuban durante 15 minutos adicionales, a 37 grados centígrados para completar la digestión del tejido.

Una vez que se complete la digestión, diluya la suspensión celular con HBSS y use una pipeta de cinco mililitros para intentar dispersar nuevamente los fragmentos de tejido residual. A continuación, para eliminar los fragmentos de tejido no digeridos, vierta la suspensión a través de un colador de células de 70 micromolares en un tubo cónico de 50 mililitros. Agregue la suspensión poco a poco para permitir que la muestra fluya a través del filtro de celdas.

Si los fragmentos de tejido no digeridos bloquean completamente el flujo de la suspensión celular. Vierta a través de un nuevo colador de células en un tubo nuevo. Granule la suspensión de la celda durante 10 minutos a 450 RCF.

Después del centrifugado, decantar el sobrenadante y resuspender suavemente el pellet de la célula a temperatura ambiente. Tampón de lisis de glóbulos rojos, incube a temperatura ambiente durante cinco minutos. A continuación, añada un volumen igual de HBSS para inactivar el tampón de lisis.

Vierta la suspensión celular en un filtro de células de 40 micromolares para eliminar los desechos y los agregados de células, recogiendo el flujo en un nuevo tubo cónico de 50 mililitros. A continuación, utilizando un hemocitómetro, determine el número de células de las muestras de pulmón y médula ósea. Registre la concentración y el volumen total de la suspensión celular.

A continuación, granule la suspensión de una sola célula pulmonar por centrifugación a 450 RCF durante 10 minutos. Para mantener las células, resuspenda las células pulmonares y de la médula ósea a la vez. De 10 a las seis células por mililitro en el DMEM precalentado con alto contenido de glucosa suplementado.

Para teñir el ADN, agregue el colorante HOAXED 3 3 3 4 2 hasta una concentración final de cinco microgramos por litro. A continuación, mezcle las células mediante una inversión suave e incube en un baño de agua a 37 grados centígrados durante exactamente 90 minutos. Luego centrifugar durante 10 minutos a 450 Gs a cuatro grados centígrados después del centrifugado.

Proceda con la tinción del tejido pulmonar y de la médula ósea con anti CD 45 y yoduro de propidio en preparación para el análisis por citometría de flujo. Una vez teñidas las células, almacene los tubos en hielo protegido de la luz hasta que se realice el análisis de citometría de flujo. Prepárese para la citometría de flujo asegurándose de que los láseres de los instrumentos estén alineados y de que estén configurados para la clasificación de células.

El instrumento utilizado debe estar equipado con láseres azules de 488 nanómetros, rojos de 635 nanómetros y UV de 350 a 355 nanómetros con dos detectores en la trayectoria del láser UV con filtros azules 45 sobre 65 y rojos 6 75 sobre 50. Además, el detector de rojo UV debe tener una alta sensibilidad para la señal roja y el instrumento debe estar equipado con una unidad de enfriamiento para mantener la muestra a 10 grados centígrados. En el software del instrumento, configure gráficos de histograma para mostrar la dispersión lineal hacia adelante frente a la dispersión lateral, un gráfico de discriminación de dobletes apropiado para el instrumento.

Un gráfico de histograma de PI utilizando una señal logarítmica, una costa roja frente a azul utilizando señales lineales y un gráfico de histograma de CD 45 A PC utilizando una señal logarítmica. Una vez que el instrumento esté listo, coloque la muestra de médula ósea teñida en el puerto de carga del instrumento. Esta muestra se utiliza como control de tinción y configuración del instrumento.

Comience a recopilar eventos y ajuste las señales lineales de dispersión interna hacia adelante. Para visualizar claramente la población de celdas, las celdas deben residir aproximadamente en el centro inferior de la dispersión hacia adelante de la gráfica como el eje x. Dado que la tinción nuclear PI es permeable a la membrana IMP, se excluirá de las células vivas.

Dibuje una región de marcha en las células muertas positivas para PI en el histograma IP. Indique al software del instrumento que coloree las células muertas. En esta puerta roja.

Es útil utilizar las células muertas ventiladas de color como navegador para identificar la población huésped G cero G uno. La tinción PI también es excitada por el láser UV y la mayoría de las células muertas deben estar fuera de escala. En el lado derecho de la gráfica de fluorescencia falsa roja frente a azul, la población G cero G uno de la médula ósea debe verse como un grupo apretado de eventos en la gráfica falsa roja frente a azul.

Ajuste los voltajes del detector para colocar el grupo G cero G uno en la parte superior derecha del centro en el gráfico. Una parte de la fase S y la totalidad de G dos del ciclo celular pueden estar fuera de escala. En la parte superior derecha de la gráfica falsa roja frente a la azul, se verá que los huéspedes de población lateral bajos se arrastran desde el lado izquierdo del grupo G cero G uno hasta la esquina inferior izquierda de la gráfica.

Ahora dibuje una puerta alrededor del grupo de células en el FSC frente al SSC. Represente la población de singletes identificada en el diagrama de dobletes y las células vivas en el histograma PI. A continuación, asigne el diagrama de engaño para mostrar solo estas poblaciones cerradas.

Después de bloquear la parcela anfitriona, dibuje una región alrededor de la población lateral. Asigne esta región como una puerta al histograma PC CD 45 A junto con las puertas singlete de dispersión de luz y celdas activas. Ahora que el sistema está configurado, retire la muestra del puerto de carga y coloque la muestra de pulmón en el puerto de carga.

No debería ser necesario volver a ajustar la configuración del instrumento para esta muestra. Comienza a recopilar eventos en la trama de engaño rojo contra azul. El grupo G cero G uno para la muestra de pulmón generalmente parece más alargado en la dirección del eje x y se asemeja al símbolo de tilda en un teclado.

La población lateral debe estar en una posición similar a la establecida para la muestra de médula ósea. Esos ligeros ajustes hacia arriba o hacia abajo pueden ser necesarios para garantizar una resolución ajustada de la población lateral. Mantenga un diferencial de presión bajo durante la clasificación asegurándose de que la válvula de flujo de muestra no se abra demasiado.

A continuación, para aislar MSC, coloque una placa de recolección de 96 pocillos en la cámara de clasificación y configure las puertas de clasificación en el histograma CD 45 A PC para separar la población positiva y negativa. Finalmente, recoja las células como una población mixta en un tubo o células individuales para aislar clones en una placa de 96 pocillos después de la recolección de la MSC pulmonar mediante clasificación de células, las células se siembran en placas de 30 milímetros utilizando A MEM suplementado con 20% de FBS. En primer lugar, las células clasificadas parecen pequeñas, redondas y brillantes después de aproximadamente dos o tres semanas.

Las colonias con el fenotipo mesenquimal se hacen evidentes y la proliferación es más evidente para cada preparación celular. Evaluar la capacidad de las MSC pulmonares para diferenciarse en linajes mesenquimales tradicionales de osteoblastos, adipocitos y condrocitos y su expresión en la superficie celular de marcadores mesenquimales aceptados. Realizar un análisis de prohibición citogenética para confirmar la ausencia de anomalías cromosómicas macroscópicas.

Tras el aislamiento por citometría de flujo y la generación de clones de células individuales, se realiza un ensayo de formación de colonias para caracterizar las células MSC y las capacidades de diferenciación. Comience con células diluidas a tres veces 10 de las cuatro células por mililitro. Medio cul incompleto en platos de 100 milímetros, realizar la dilución del cereal dos, seis veces 10 de los cuatro, tres veces 10 de los cuatro, 1,5 veces 10 a los cuatro y 0,75 veces 10 a las cuatro celdas por plato en 10 mililitros de medio por triplicado.

Luego coloque las placas en la incubadora después de 10 días de cultivo, vierta el medio y enjuague las células con PBS. A continuación, arréglalos añadiendo metanol al 100% durante cinco minutos a temperatura ambiente. Después de cinco minutos, vierta el metanol.

Luego, para detectar la formación de colonias, agregue 0.4% de peso por volumen gza diluido de uno a 20 con el agua ionizada incubar durante 10 a 15 minutos. A continuación, vierte la mancha y enjuaga con agua ionizada. Permita que las muestras se sequen al aire y cuantifique el número de colonias que contienen más de 25 células por colonia utilizando un microscopio invertido o visualización.

Las colonias son grandes y están compuestas por unos pocos cientos de células, como se muestra aquí, y muestran un fenotipo mesenquimatoso. Las MSC se aislaron como se muestra en este video y se colocaron en placas de 96 pocillos para simular el crecimiento. A continuación, se añadieron a las MSC pulmonares células presentadoras de antígenos marcadas con CFSE detenidas.

A continuación, se midió la proliferación de MSC aisladas como la disminución de la intensidad de fluorescencia media de la CFSE en comparación con la de fondo, que eran células T marcadas con CFSE solas, como se muestra en esta figura, en ausencia de SC pulmonar y presencia de células presentadoras de antígenos, las células T efectivas positivas A PC más menos O albúmina CD 40 demuestran una disminución de la intensidad de la CFSE, lo que indica proliferación con un círculo rojo. La intensidad de fluorescencia de CFSE de la membrana de las células T disminuye econométricamente con cada división celular, es decir, la mitad con cada división en presencia de M-S-C-A-P-C pulmonar más menos OVA, las células T afectadas CD 40 positivas no muestran cambios significativos en la intensidad de CFSE, lo que indica una falta de proliferación después de su desarrollo. Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la biología de las células madre pulmonares exploraran el papel de las células madre mesenquimales en enfermedades pulmonares como la hipertensión arterial pulmonar y la fibrosis pulmonar.

Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en aproximadamente cinco horas siguiendo este procedimiento. Se pueden realizar otros métodos, como los ensayos de diferenciación, para responder a preguntas adicionales, como si las células madre mesenquimales pulmonares putativas exhiben o no una diferenciación adecuada de múltiples linajes, con potencial para la grasa ósea y el cartílago.