Name: Aislamiento y Caracterización de Hoechst Baja CD45 Negativo Mouse células madre mesenquimales de pulmón (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 55 s
Description: Aprende a aislar células madre mesenquimales de pulmón Hoechst baja CD45 negativas en ratones mediante citometría de flujo. Este protocolo permite estudiar su función inmunomoduladora y aplicaciones en enfermedades pulmonares.

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Este trabajo fue financiado por becas de SMM: AHA GIA0855953G, NIH 1R01 HL091105-01. El apoyo adicional fue proporcionada por: DW: NIH RO1DK075013, DDK y la Fundación Kleberg, el núcleo de Citometría de Flujo UCCC (NIH 5 P30 CA 46934-15), el núcleo UCCC Microarray (NCI P30 CA 46934-14).

1. Aislamiento de pulmón <ol><li> Sacrificio de los ratones adultos (8-10 semanas de edad, 18 a 20 g; C57Bl6J) los ratones con una sobredosis de isoflurano seguido por exanguinación mediante una técnica estéril. Perfiles pueden variar ligeramente entre las cepas. </li><li> Extraer quirúrgicamente el diafragma, abrir la cavidad torácica por el corte de la caja torácica lateralmente a cada lado del ratón. Lavar la sangre de los pulmones por perfusión del ventrículo derecho del corazón con cuidado usando 3-5ml de tampón fosfato salino (PBS). </li><li> Diseccionar los lóbulos pulmonares de retirar la tráquea, los bronquios grandes y colocar en una placa de Petri llena de solución salina tamponada Hanks (HBSS). Tras la recolección de todos los lóbulos pulmonares con fórceps se utilizan para colocar el tejido en la tapa del plato. El tejido se picada en trozos pequeños con bisturí desechable, con suficiente líquido para mantener la humedad, pero no tanto que flotan y se mueven. </li><li> La disección de un miembro posterior de uno de los ratones y aislar la médula ósea para su uso como un control de tinción para establecer la flow citometría de puertas. Mancha de la médula ósea (MO) como se describió anteriormente 1. </li></ol> 2. Preparación de una suspensión de células individuales del tejido pulmonar <ol><li> Cada pulmón se digiere con un peso del tejido optimizado en relación al volumen de 0,2 g: 5ml de pre-calentado 0,2% Worthington tipo 2 colagenasa (Worthington Bioquímicos, Lakewood, NJ, cat # LS004202) disuelto en HBSS estéril. La mezcla se sumerge en un baño de agua 37 ° C durante 30 min 2,3. </li><li> Triturar la muestra bien hasta que digerir el tejido pulmonar fluye fácilmente a través de una pipeta de 10 ml (aproximadamente 10 repeticiones). Incubar durante otros 15 minutos a 37 ° C para completar el tejido digiere y se asegura una suspensión de células individuales más uniforme. </li><li> Diluir la suspensión de células de pulmón con HBSS y triturar con una pipeta de 5 ml para dispersar fragmentos residuales del tejido. </li><li> Filtrar la suspensión utilizando un colador para eliminar células 70μM fragmentos sin digerir el tejido. Muestra se puede dividir en multipltubos cónicos e en este punto para evitar la sobrecarga de un colador celular y disminuir el tiempo. </li><li> Pellet la suspensión celular durante 10 minutos a 1500 rpm y se decanta el sobrenadante. </li><li> Resuspender el sedimento celular suavemente con la temperatura ambiente RBC tampón de lisis (eBiosciences, San Diego, CA, cat # 00-4333-57) e incubar a temperatura ambiente durante 5 min. Añadir un volumen igual de HBSS para desactivar el buffer de lisis y el filtro de la suspensión celular de células utilizando un colador para eliminar los restos 40μM y agregados de células. </li><li> Pipeta 10μl de cada muestra que se tiñen y contar el número de células, tanto para el pulmón y muestras BM utilizando un hemocitómetro. Nota: El registro del volumen total de las células. </li><li> Pellet la suspensión de células individuales de las células del pulmón por centrifugación a 1500 rpm durante 10 minutos. </li><li> Resuspender los pulmones y las células BM en 1x10 6 células / ml en precalentado (37 ° C) + DMEM (Dulbecco modificado de Eagle medio, alto nivel de glucosa (Gibco, Carlsbad, CA, cat # 11965-092) que contiene 2% fetal BOVIne suero (FBS) y HEPES 10 mM. </li><li> Preparar una solución de 1mg/ml de colorante Hoechst 33342 (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO, cat # B2261) en el agua y el filtro de esterilización de 1,4. El colorante Hoechst se puede almacenar en alícuotas a -80 ° C. </li><li> Agregar colorante Hoescht 33342 a una concentración final de 5μg/ml (una dilución de 200 veces de un depósito 1mg/ml) a la suspensión de células individuales. </li><li> Mezclar suavemente las células por la inversión e incubar a 37 ° C baño de agua durante exactamente 90 minutos. </li></ol> 3. Tinción y preparación de la suspensión de pulmón de células para el análisis de citometría de flujo <ol><li> Después de 90 minutos todas las medidas con las células del pulmón Hoechst manchadas deben ser ejecutados a 4 ° C o en hielo para evitar flujo de salida de medio de contraste. Que sedimenten las células por centrifugación a 1500 rpm durante 10 min a 4 ° C y se resuspenden las células en helado tinción de amortiguación (PBS 2% de SFB). </li><li> Resuspender las células a una concentración de no más de 1x10 7 células / tubo con 300-600μl de PBS que contenía 2%FBS y HEPES 10 mM. </li><li> Añadir adecuadamente risita anticuerpos CD45 (por lo general la dilución 1:200 de CD45-APC (BD Pharmingen, San Diego, CA, cat # 559864) en el pulmón y las muestras BM Incubar en hielo durante 10-15 minutos Incluye un control sin manchas durante la.. procedimiento experimental es útil para establecer el análisis de las puertas. </li><li> Precipitar las células a 4 ° C por 5 min a 1500 rpm. Decantar el sobrenadante y resuspender las células en 500 l de tampón de tinción refrigerados (PBS 2% de SFB). Transferencia a los tubos enfriados previamente snap de polipropileno tapa (Fisherbrand, Schaumburg, IL, cat # 14-956-1D). </li><li> Añadir yoduro de propidio (PI, las acciones de 200μg/ml en PBS) a las muestras para una concentración final de 2μg/ml para excluir las células muertas. PI debe ser utilizado en combinación con el colorante Hoechst 33342 para lograr el perfil correcto de fluorescencia en el análisis de citometría de flujo. </li><li> Tubos de tienda en el hielo, protegido de la luz hasta el análisis de citometría de flujo. </li></ol> 4. El análisis de citometría de flujo para definir y aislarun pulmón de células madre mesenquimales (MSC pulmón) Población que utiliza el reactivo de Hoechst Eflujo para detectar un lado la población (SP) <ol><li> Este ensayo tiene los requisitos siguientes instrumentos: </li><ul><li> 488 nm y láser UV (350 a 355 nm) </li><li> 2 detectores en el camino láser UV de color azul (450/65) y filtros de color rojo (675/50). </li><li> El detector de color rojo UV debe tener una alta sensibilidad para la luz roja. Esto puede ser un problema con los clasificadores celulares viejos. </li><li> Chiller para mantener la unidad de la muestra a 50-10 º C. </li></ul><li> Alinear los láseres y preparado para la selección de células siguiendo el protocolo del fabricante. </li><li> Recoger la roja (eje x) y azul (eje Y) las señales de Hoechst utilizando una escala lineal. </li><li> Ajustar los voltajes de tubo fotomultiplicador colocar el pico G0/G1 en la parte superior derecha del centro de la parcela para permitir la visualización adecuada de la población hemisferio posterior. Una parte de la fase S y todo el G2 del ciclo celular puede ser fuera de escala en la parte superior derecha de la trama. El SIG azulnal es relativamente brillante, mientras que la señal roja es tenue. Típica XDP MoFlo (Beckman Coulter, Miami, FL) voltajes son 425 para el azul y 650 para el rojo. </li><li> Las células muertas son cerradas a cabo con PI. La norma camino PI (excitación 488 nm, emisión 630 nm) pueden ser utilizados. Por otra parte, PI también está entusiasmado por el láser UV y la población de células muertas se encuentra fuera de escala en el lado derecho de la población lateral (SP) trama. Esto alivia la necesidad de compensar la señal IP de cualquier otra fluorocromos como el FITC y PE. El método original de Goodell seguido los procedimientos de este último 5-7. </li><li> Mantener un diferencial de presión relativamente baja durante el análisis y la clasificación para asegurar la resolución ajustada de la población de lado. </li><li> El SP se presenta como un brazo lateral, aparte de la principal población de células de los pulmones. Esta población se denomina Hoechst baja. </li><li> La baja Hoechst / SP se analiza para separar las poblaciones CD45 positivos y negativos utilizando un histograma 2,3 (Figura 1). </li><li> Después de la selección y la compuerta de la Hoechst baja CD45 neg población MSC pulmón, las células pueden ser recogidos por la clasificación, ya sea como una población mixta en un tubo o de un solo aislar clones en una placa de 96 pocillos 3. </li><li> Para la placa de clasificación de la desviación tipo corriente se ajusta al 25% para crear una corriente de tipo más vertical que suele utilizar para la clasificación del tubo. </li><li> El objetivo de la corriente de clase mediante el envío de un pulso de corriente de prueba en la parte superior izquierda y luego la parte inferior derecha de una placa de 96 pocillos. </li><li> Configure el software clasificador de mapa de la placa para depositar la cantidad deseada de células en cada pocillo. </li><li> Para aislar clones de células individuales un MSC solo pulmón se clasifica en el pozo de una placa de 96 pocillos en 150μl de la cultura de los medios de comunicación (α-MEM suplementado con FBS al 20%). Después de la clase un 100μl de medio adicional se agrega. </li></ol> 5. Aislamiento, cultivo y caracterización de los pulmones y el MSC Clones <ol><li> Culture y la expansión de la población mixta MSC pulmón y clones de células individuales siguiente clasificación es idéntica con las condiciones de cultivo estándar (37 ° C, 5% de CO 2 y humedad&gt; 95%). Las células se permite que se adhieran aislamiento después de 16 horas. Los medios de comunicación se reemplaza cada 48 horas (α-MEM suplementado con FBS al 20%). Cuando las células empiezan a proliferar más rápidamente y llegar a la confluencia entre el 75-80% que se pasan (Figura 2). </li><li> Las células se lavan con HBSS precalentado y se incubaron con tripsina al 0,5% / EDTA (Cellgro, Manassas, VA, cat # 25-053-Cl) a 37 ° C durante menos de 2 min. Las células se determinan con un alcance invertido para confirmar la aparición de una suspensión celular. </li><li> MSC pulmón se dividen en proporciones de 1:2 o 1:3 dependiendo de la tasa de proliferación actual de la cultura. </li><li> La capacidad de las MSC de pulmón de diferenciarse en linajes mesenquimales tradicionales de los osteoblastos, adipocitos y condrocitos y su expresión en la superficie de células de aceptada marcadores mesenquimales is evaluados para cada preparación de células. El análisis citogenético de bandas también se realiza para confirmar la ausencia de graves anomalías cromosómicas 2,3,8-11. </li></ol> 6. La enumeración de MSC pulmón mediante un ensayo de formadoras de colonias (CFU-F) <ol><li> Diluir las células en un medio de MesenCult completo (Tecnologías de Células Madre, Vancouver, BC) a una concentración final de 1x10 6 células / ml. </li><li> Realizar diluciones en serie para alcanzar las concentraciones finales en un plato de 100 mm de 6x10 4 células, 3x10 4 células, 1,5 x10 4 células y 0,75 x10 4 células en 10 ml de los medios de comunicación. Los análisis se realizaron por triplicado o duplicado para cada concentración de células y puede ser escalado para superficies pequeñas. </li><li> Células en cultivo durante 10 días en condiciones normales. El día 10 las células se lavan con PBS y fijadas con metanol al 100% durante 5 minutos a temperatura ambiente. </li><li> Detectar la CFU-F colonias mediante la tinción con w / v 0.4% de solución de Giemsa(Sigma Chemical Co, St. Louis, MO) diluido 1:20 con agua desionizada. Permita que las muestras se sequen al aire y cuantificar el número de colonias que contenga más de 25 células por colonia (Figura 3). </li></ol> 7. Análisis de las propiedades inmunomoduladoras de MSC pulmón en células T-proliferación y la apoptosis <ol><li> 6.25x10 4 células de pulmón por MSC y se sembraron en placas de 96 pocillos y se deja reposar durante la noche 2. </li><li> Las células CD4 + a partir de bazos de receptor de células T (TCR) de ratones transgénicos, OT-II con las células T que reconocen el péptido 323-339 ovoalbúmina, son purificadas por el agotamiento de CD8 +, CD19 +, MHC-II + y CD25 + en las células con un clasificador de células Miltenyi AutoMACS (Miltenyi, Auburn, CA). Células presentadoras de antígeno (APC) se encuentran aisladas por la clasificación positiva de MHC-II + en las células 12. </li><li> APC se fija en el 4% de paraformaldehído, se lavaron 3 veces en PBS / EDTA al 5% BSA/2mM, y cargado con 0.5μg/ml o 5μg / ml OVA323 péptido. </li><li> Crecimiento simulado, arrestado APC se añaden a la MSC de pulmón en placas de 96 pocillos. </li><li> Más del 95% de CD4 + puro 1x10 5 células se marcan con 5μM carboxifluoresceína succinimidil ester (CFSE, Sigma, St. Louis MO) en PBS y se incubó durante 5 min en la oscuridad, se lava con PBS-BSA al 5%, y añade a la APC y las células del pulmón MSC en DMEM 5% de SFB medios de comunicación. Células se incubaron durante 96 horas. </li><li> T-células se tiñeron con anti anti-CD40 (Cy5), CD4 (APC-Cy7), CD8 (ViolBlue); vbeta 5 (PE) y se analizaron utilizando un Miltenyi MacsQuant 7 citómetro de flujo del canal (Miltenyi, Aurburn, CA) y Flojo el análisis de software (Treestar, Ashland, Oregón). Proliferación se mide como la disminución de la intensidad media de fluorescencia de CFSE en comparación con el fondo, las células T marcadas con CFSE y no expuestos a la APC (Figura 4). Las células T se cuentan en este momento y de viabilidad determinado con exclusión del azul tripano. </li></ol> 8. Los resultados representativos: Figura 1. Citometría de flujo análisis y definición de MSC pulmón. Suspensiones de células individuales de digerir el tejido pulmonar se tiñeron con Hoechst 33342 y analizadas por citometría de flujo para detectar diferencias en una. dispersión frontal (FSC) y la dispersión lateral (SSC) y B. Hoechst azul y fluorescencia de color rojo. La presencia de un lado la población (SP) es visible en la puerta. La Hoechst baja SP se analiza para separar el C. CD45 negativas de la población de MSC pulmón. El CD45 positivo a las relaciones negativas de pulmón SP son típicamente 70:30 / 60:40. <img src="/files/ftp_upload/3159/3159fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Aislamiento y cultivo de MSC pulmón. Tras la recogida de la MSC de pulmón por la clasificación de células, las células son colocadas en cajas de 30 mm con α-MEM supplemented con FBS al 20%. A. Las células recién ordenados parecen pequeños, redondos y brillantes. B. Después de aproximadamente 2-3 semanas, con colonias de un fenotipo mesenquimatoso, se hacen evidentes y la proliferación es más evidente. <img src="/files/ftp_upload/3159/3159fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Enumeración de MSC por Formadoras de Colonias-fibroblastos de ensayo. Ampliado de pulmón MSC son colocadas por el protocolo descrito para el ensayo de CFU-F. A. Después de 10 días y las colonias Giemsa son evidentes. Colonias B. son grandes y están compuesto por un unos pocos cientos de células. C. Las células presentan un fenotipo mesenquimal. A &amp; B, barra de escala = 0,5 cm, barra de escala C = 0,14 cm. <img src="/files/ftp_upload/3159/3159fig4.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. CFSE células T basada Ensayo de proliferación. En ausencia de MSC pulmonar y la presencia de antigen las células presentadoras (APC) + / - ovoalbúmina (OVA) CD40 células T efectoras positivas demuestran una disminución en la intensidad de la CFSE que indica la proliferación (círculo rojo). La intensidad de fluorescencia CFSE de la membrana de las células T disminuye con cada estequiométricamente es decir, la división celular. con todas las divisiones. En la presencia de cáncer de pulmón MSC, APC + / - OVA, CD40 de células T efectoras positivas demuestran ningún cambio significativo en la intensidad de la CFSE que indica una falta de proliferación (círculo rojo).

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</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

Hemos adaptado un método inicialmente usado para identificar BM células hematopoyéticas para aislar a una población específica de MSC pulmón residente. Debido a la reproducibilidad de aislamiento de estas células fueron entonces bien caracterizados como MSC. Su origen se ha definido como residente en el pulmón de ratones adultos (a diferencia de BM derivados) y un perfil fenotípico y molecular documentado 2. La capacidad de aislar repetidamente esta población caracterizada permite el estudio más de la importancia biológica y el papel del MSC de pulmón durante la homeostasis del tejido y la enfermedad. La reciente definición de esta población en vivo en el tejido pulmonar, tanto murinos y humanos facilita el desarrollo de una estrategia terapéutica dirigida a rescatar a las células endógenas para facilitar la reparación de pulmón durante la lesión y la enfermedad.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nombre del reactivo </th><th> Empresa </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentarios (opcional) </th></tr><tr><td> Tampón fosfato salino (PBS) </td><td> Sigma </td><td> P-5368 </td><td></td></tr><tr><td> Hanks solución salina tamponada (HBSS) </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH30588.01 </td><td></td
></tr><tr><td> 0,2% Worthington tipo 2 colagenasa </td><td> Worthington Bioquímicos </td><td> LS004202 </td><td></td
></tr><tr><td> Glóbulos rojos tampón de lisis </td><td> eBiosciences </td><td> 00-4333-57 </td><td></td
></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen Gibco </td><td> 11965-092 </td><td></td
></tr><tr><td> Colorante Hoechst 33342 </td><td> Sigma </td><td> B2261 </td><td></td
></tr><tr><td> CD45-APC </td><td> BD Pharmingen </td><td> 559864 </td><td></td
></tr><tr><td> Yoduro de propidio </td><td> Sigma </td><td> 81845 </td><td></td
></tr><tr><td> a-MEM </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH30265.01 </td><td>; </td
></tr><tr><td> FBS </td><td> Invitrogen </td><td> 16000-069 </td><td></td
></tr><tr><td> 0,5% de tripsina / EDTA </td><td> Cellgro </td><td> 25-053-Cl </td><td></td
></tr><tr><td> Media MesenCult completa </td><td> Madre Cell Technologies </td><td> 05511 </td><td></td
></tr><tr><td> 0,4% w / v solución de tinción Giemsa </td><td> Sigma </td><td> GS1L </td><td></td
></tr><tr><td> Paraformaldehído al 4% </td><td> Electron Microscopy Servicios </td><td> 15710 </td><td> 16% paraformeldehyde se diluye al 4% con PBS </td
></tr><tr><td> Carboxifluoresceína succinimidil ester (CFSE) </td><td> Sigma </td><td> 21888 </td><td></td
></tr></tbody></table>

aislamiento y caracterización de hoechst baja cd45 negativo mouse células madre mesenquimales de pulmón

Isolation &#38; Characterization of Hoechstlow CD45negative Mouse Lung Mesenchymal Stem Cells

Las células madre mesenquimales de tejido residente (MSC) son importantes reguladores de la reparación de tejidos o la regeneración, fibrosis, inflamación de la angiogénesis y la formación de tumores. En conjunto, estos estudios sugieren que el MSC pulmón residentes juegan un papel en la homeostasis del tejido pulmonar, lesión y reparación en enfermedades como la fibrosis pulmonar (PF) y la hipertensión arterial (PAH). Aquí se describe una tecnología para definir una población de MSC pulmón residente. La definición de esta población en el tejido pulmonar in vivo utilizando un conjunto de marcadores definir facilita el aislamiento repetido de una población de células madre bien caracterizada por citometría de flujo y el estudio de un tipo específico de célula y la función.

En este artículo se demuestra el aislamiento de las células del pulmón murino residentes madre mesenquimales (MSC pulmón), su expansión, la caracterización y análisis de las propiedades inmunomoduladoras.

Aislamiento y Caracterización de Hoechst Baja CD45 Negativo Mouse células madre mesenquimales de pulmón

Las células madre mesenquimales (MSC) residentes en los tejidos son reguladores importantes de la reparación o regeneración tisular, la fibrosis, la inflamación, la angiogénesis y el tumor...

Este video demuestra un protocolo para el aislamiento de células madre mesenquimatosas pulmonares negativas con bajo nivel de CD45. Las células madre mesenquimatosas, o MSCs, son reguladores importantes de la reparación o regeneración tisular, la fibrosis, la inflamación y la angiogénesis. Primero, se diseccionan los pulmones de un ratón sacrificado.El tejido pulmonar se digiere para obtener una suspensión de células individuales. Las células se tiñen con el colorante hoax y CD45 y se clasifican mediante citometría de flujo para obtener MSCs pulmonares CD45 negativas de bajo contenido en células hospedadoras. Luego, los MSCs pulmonares se amplifican en cultivo y se realiza un ensayo de formación de colonias para evaluar las capacidades de diferenciación de los MSCs.Posteriormente, se pueden realizar estudios adicionales para examinar el papel de las MSC en la homeostasis tisular y en la enfermedad. El método que mostramos aquí puede utilizarse para aislar células madre mesenquimales pulmonares de ratón o humanas, y puede aplicarse a este estudio de enfermedades pulmonares como la fibrosis pulmonar, la hipertensión pulmonar y la EPOC. En general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades debido a la variedad de métodos disponibles para la preparación de tejidos, así como para el ajuste del citómetro de flujo, los controles apropiados y el análisis.La demostración visual de este método es fundamental, ya que es difícil describir únicamente con palabras la técnica adecuada para picar y digerir el tejido pulmonar con el fin de obtener una viabilidad óptima de las células. Asimismo, el montaje del instrumento de citometría de flujo y los análisis se comunican mejor mediante una demostración. Comience este protocolo extrayendo los pulmones que se utilizarán para obtener células madre mesenquimales de un ratón adulto sacrificado.Utilice un par pequeño de tijeras afiladas para cortar lateralmente la caja torácica en cada lado del ratón. Abra la cavidad torácica y luego retire el diafragma. Introduzca una jeringa de 10 mililitros con una aguja de calibre 20 y medio en el ventrículo derecho del corazón y presione suavemente el émbolo para perfundir con tres a cinco mililitros de PBS, eliminando la sangre de los pulmones.A continuación, usando tijeras, corte la tráquea y los grandes bronquios y deséchelos. Luego, con pinzas, tome los pequeños lóbulos pulmonares blancos y colóquelos en una placa de Petri llena con solución salina tamponada de Hank o HBSS.Luego retire el corazón y separe los lóbulos pulmonares. Repita este procedimiento con todos los ratones del estudio. Transfiera los lóbulos pulmonares a la tapa del recipiente.Humedezca el tejido con suficiente HBSS para evitar que se seque. Luego, utilizando un escalpelo desechable, pique los lóbulos pulmonares para obtener médula ósea que servirá como control de sostenimiento para citometría de flujo. Utilice un par de tijeras afiladas para cortar en el tobillo y en la parte superior del fémur.Coloque el miembro en una nueva placa de Petri. Luego corte la rodilla, dejando una pieza lineal del fémur y una segunda pieza que contiene la tibia y el peroné. Usando pinzas, retire el músculo para exponer la tibia, el peroné y el fémur.Ahora tome una jeringa de cinco mililitros con una aguja de calibre 26 y media e inserte la aguja en la abertura de la médula ósea. En un extremo de la tibia, sostenga el hueso con el otro extremo dirigido hacia un tubo cónico de 50 mililitros lleno con 15 mililitros de HBSS y presione el émbolo para dispensar HBSS y lavar la médula ósea hacia el tubo. Repita este proceso con la fíbula y el fémur.Tiña la médula ósea con el huésped 3 3 3 4 2 a una concentración final de cinco microgramos por mililitro en DMEM de glucosa alta suplementado. A continuación, se generará una suspensión de células individuales del tejido pulmonar a partir del tejido aislado. Coloque cada pulmón en un tubo que contenga precalentado 0,2 % Worthington.Colagenasa tipo dos preparada en HBSS estéril, luego sumerja el tubo en un baño de agua a 37 grados Celsius e incube durante 30 minutos. Tras la incubación, utilice la pipeta de 10 mililitros para triturar la muestra hasta que el digesto fluya fácilmente a través de la pipeta. Repita aproximadamente 10 veces e incube adicionalmente 15 minutos a 37 grados Celsius para completar la digestión del tejido.Una vez finalizada la digestión, diluya la suspensión celular con HBSS y utilice una pipeta de cinco mililitros para volver a tritar cualquier fragmento residual de tejido. A continuación, para eliminar los fragmentos de tejido no digeridos, vierta la suspensión a través de un filtro celular de 70 micrómetros en un tubo cónico de 50 mililitros. Añada la suspensión poco a poco para permitir que la muestra fluya a través del filtro celular.Si los fragmentos de tejido no digeridos bloquean completamente el flujo de la suspensión celular, vierta a través de un nuevo filtro celular hacia un tubo nuevo. Precipite la suspensión celular durante 10 minutos a 450 RCF.Tras la centrifugación, decante el sobrenadante y resuspenda suavemente el botón celular en tampón para la lisis de glóbulos rojos a temperatura ambiente. Incube a temperatura ambiente durante cinco minutos. A continuación, añada un volumen igual de HBSS para inactivar el tampón de lisis.Vierta la suspensión celular en un filtro celular de 40 micrómetros para eliminar los restos y los agregados celulares, recolectando el flujo filtrado en un nuevo tubo cónico de 50 mililitros. A continuación, utilizando un hemocitómetro, determine el número de células en las muestras de pulmón y médula ósea. Registre la concentración y el volumen total de la suspensión celular.Luego, pelletice la suspensión de células individuales de pulmón mediante centrifugación a 450 RCF durante 10 minutos. Para mantener las células, resuspenda simultáneamente las células de pulmón y de médula ósea. Diez elevado a seis células por mililitro en DMEM con alto contenido de glucosa suplementado y precalentado.Para teñir el ADN, agregue el colorante HOAXED 3 3 3 4 2 hasta una concentración final de cinco microgramos por litro. A continuación, mezcle las células mediante inversión suave e incube en un baño de agua a 37 grados Celsius durante exactamente 90 minutos. Luego, centrifugue durante 10 minutos a 450 Gs a cuatro grados Celsius después de la centrifugación.Continúe con la tinción del tejido pulmonar y de médula ósea con anti CD45 y yoduro de propidio en preparación para el análisis mediante citometría de flujo. Una vez que las células hayan sido marcadas, almacene los tubos en hielo protegidos de la luz hasta que se realice el análisis por citometría de flujo. Prepárese para la citometría de flujo asegurándose de que los láseres del instrumento estén alineados y configurados para el ordenamiento celular.El instrumento utilizado debe estar equipado con láseres azul de 488 nanómetros, rojo de 635 nanómetros y UV de 350 a 355 nanómetros, con dos detectores en la trayectoria del láser UV con filtros azul 45/65 y rojo 675/50. Además, el detector UV rojo debe tener alta sensibilidad para la señal roja y el instrumento debe contar con una unidad refrigeradora para mantener la muestra a 10 grados Celsius. En el software del instrumento, configure gráficos de histograma para mostrar dispersión directa lineal frente a dispersión lateral, y un gráfico de discriminación de dobletes adecuado para el instrumento.Un gráfico de histograma de PI utilizando una señal logarítmica, un gráfico de dispersión rojo versus azul usando señales lineales y un gráfico de histograma de CD45 APC utilizando una señal logarítmica. Una vez que el instrumento esté listo, coloque la muestra de médula ósea teñida en el puerto de carga del instrumento. Esta muestra se utiliza como control de tinción y de configuración del instrumento.Comience a recopilar eventos y ajuste las señales lineales de dispersión directa. Para visualizar claramente la población celular, las células deben ubicarse aproximadamente en la parte inferior central del gráfico, con la dispersión directa en el eje x. Dado que el colorante nuclear PI es permeable a membranas IMP, será excluido de las células vivas.Dibuje una región de selección en la población de células muertas positivas para PI en el histograma de PI. Instruya al software del instrumento para colorear las células muertas con este color de compuerta: rojo.Es útil utilizar el color de las células muertas con ventilación como guía para identificar la población huésped G0/G1. La tinción con PI también es excitada por el láser UV y la mayoría de las células muertas deben estar fuera de escala. En el lado derecho del gráfico de fluorescencia roja versus azul hoaxed, la población G0/G1 de la médula ósea debe observarse como un grupo compacto de eventos en el gráfico de fluorescencia roja versus azul hoaxed.Ajuste los voltajes del detector para colocar el grupo G0G1 en la parte superior derecha del centro del gráfico. Una porción de la fase S y todo el G2 del ciclo celular pueden estar fuera de escala. En la parte superior derecha del gráfico de rojo versus azul manipulado, se observará que la población lateral de bajo nivel se extiende desde el lado izquierdo del grupo G0G1 hasta la esquina inferior izquierda del gráfico.Ahora dibuje una compuerta alrededor del grupo celular en el gráfico de FSC versus SSC. Represente la población de células individuales identificada en el gráfico de dobletes y las células viables en el histograma de PI. Luego asigne el gráfico hoax para mostrar únicamente estas poblaciones compuertadas.Después de seleccionar el gráfico del hospedador, dibuje una región alrededor de la población lateral. Asigne esta región como un filtro al histograma de CD45 APC junto con los filtros de dispersión lateral de partículas simples y de células viables. Ahora que el sistema está configurado, retire la muestra del puerto de carga y coloque la muestra de pulmón en el puerto de carga.Los ajustes del instrumento no deberían necesitar ser modificados nuevamente para esta muestra. Comience a recolectar eventos en el gráfico de rojo versus azul. El grupo G cero G uno para la muestra pulmonar generalmente aparece más alargado en la dirección del eje x y se asemeja al símbolo de tilde en un teclado.La puerta de población lateral debe estar en una posición similar a la establecida para la muestra de médula ósea. Pueden ser necesarios pequeños ajustes hacia arriba o hacia abajo para garantizar una resolución nítida de la población lateral. Mantenga una baja diferencia de presión durante la clasificación, asegurándose de que la válvula de flujo de la muestra no esté abierta en exceso.A continuación, para aislar las CMM, coloque una placa de recolección de 96 pocillos en la cámara de clasificación y configure las compuertas de clasificación en el histograma de CD45-A PC para separar las poblaciones positiva y negativa. Finalmente, recolecte las células ya sea como una población mixta en un tubo o células individuales para aislar clones en una placa de 96 pocillos. Tras la recolección de las CMM pulmonares mediante clasificación celular, las células se siembran en placas de 30 milímetros utilizando MEM suplementado con 20 % de suero bovino fetal. En primer lugar, las células clasificadas aparecen pequeñas, redondas y brillantes tras aproximadamente dos o tres semanas.Las colonias con fenotipo mesenquimal se vuelven evidentes y la proliferación es más notable para cada preparación celular. Evalúe la capacidad de las CMM pulmonares para diferenciarse en las líneas mesenquimales tradicionales de osteoblasto, adipocito y condrocito, así como su expresión en la superficie celular de marcadores mesenquimales aceptados. Realice un análisis de bandeo citogenético para confirmar la ausencia de anomalías cromosómicas evidentes.Tras el aislamiento mediante citometría de flujo y la generación de clones de células individuales, se realiza un ensayo de formación de colonias para caracterizar las células MSC y sus capacidades de diferenciación. Comience con células diluidas a tres veces 10 a la cuatro células por mililitro. En medio de cultivo incompleto en placas de 100 milímetros, realice diluciones seriadas de seis veces 10 a la cuatro, tres veces 10 a la cuatro, 1,5 veces 10 a la cuatro y 0,75 veces 10 a la cuatro células por placa en 10 mililitros de medio, en triplicado.Luego, después de 10 días de cultivo, coloque las placas en el incubador, retire el medio y lave las células con PBS. A continuación, fíjelas añadiendo metanol al 100 % durante cinco minutos a temperatura ambiente. Pasados cinco minutos, retire el metanol.Luego, para detectar la formación de colonias, agregue gza al 0,4% peso por volumen diluido uno a veinte con agua ionizada e incube de 10 a 15 minutos. A continuación, deseche el colorante y enjuague con agua ionizada. Deje secar las muestras al aire y cuantifique el número de colonias que contienen más de 25 células por colonia utilizando un microscopio invertido o visualización.Las colonias son grandes y están compuestas por unas pocas cientos de células, como se muestra aquí, y presentan un fenotipo mesenquimal. Las CMM se aislaron como se muestra en este video y se sembraron en placas de 96 pocillos para simular el crecimiento. Luego, se añadieron células presentadoras de antígeno marcadas con CFSE y detenidas al ciclo celular a las CMM pulmonares.La proliferación de las CMM aisladas se midió entonces como la disminución de la intensidad media de fluorescencia de CFSE en comparación con el fondo, que eran linfocitos T marcados con CFSE solamente, como se muestra en esta figura, en ausencia de C-P pulmonar y en presencia de células presentadoras de antígenos, A PC con y sin albúmina; los linfocitos T efector CD40 positivos muestran una disminución en la intensidad de CFSE, lo que indica proliferación, señalada con círculo rojo. La intensidad de fluorescencia de CFSE en la membrana de los linfocitos T disminuye de forma equimétrica con cada división celular, es decir, a la mitad en cada división; en presencia de C-P-M-A pulmonar con y sin OVA, los linfocitos T efector CD40 positivos no muestran un cambio significativo en la intensidad de CFSE, lo que indica ausencia de proliferación tras su desarrollo. Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la biología de las células madre pulmonares exploraran el papel de las células madre mesenquimales en enfermedades pulmonares como la hipertensión arterial pulmonar y la fibrosis pulmonar.Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en aproximadamente cinco horas siguiendo este procedimiento. Se pueden realizar otros métodos, como ensayos de diferenciación, para responder preguntas adicionales, incluyendo si las células madre mesenquimales pulmonares putativas exhiben diferenciación multilínea adecuada y potencial hacia hueso, grasa y cartílago.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

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