Métodos para grabaciones de parche Capacidad de la pinza del cáliz

Hola, mi nombre es Ken Paradiso. Trabajo para Ling Gang Wu en el Instituto Nacional de Trastornos Neurológicos y Accidentes Cerebrovasculares (National Institute of Neurological Disorders and Stroke Intramuros), que se encuentra en el campus de Bethesda de los NIH. Voy a mostrarles las técnicas para la grabación presináptica de la caly que han sostenido la fijación del parche.

Entonces, para preparar el tejido cerebral, extraemos el cerebro de la rata. Pusimos el cerebro dentro de esta solución, que sería una solución helada y baja en calcio, y estaría burbujeando con carbgeno para asegurarnos de que haya un suministro de oxígeno al cerebro en todo momento. Y también tiene que estar helado para minimizar el DA para minimizar la cantidad de daño.

Así que el cerebro estaría ahora en esta solución. Lo sacaríamos, lo cortaríamos adecuadamente para que pueda colocarse en el bloque, montarlo en el bloque con correlato Sano o pegamento loco, pero luego llenaríamos la cámara con una solución helada y baja en calcio, la burbujearíamos, la colocaríamos en el vibrador y luego cortaríamos rodajas de 180 a 190 micras de grosor a una frecuencia de cuchilla de 70 hercios y una velocidad avanzada de avance de 0,01 a 0,02 milímetros por segundo. Eso sería de 10 a 20 micras por segundo.

Una vez que se hace cada rebanada, transferimos las rodajas de la solución salina helada a esta cámara, que contiene una solución de calcio normal. Esta es la misma solución en la que grabamos y está a 37 grados de temperatura fisiológica. Luego colocamos las rodajas aquí para su recuperación.

Permanece aquí durante media hora o una hora antes de que se ejecuten los experimentos de fisiología. Así que aquí tengo el cerebro y voy a sacarlo de la solución. Así que este es un cerebro más grande para fines de demostración.

Esto es de una rata P 20. Le daremos la vuelta. Lo que nos interesa es el tronco encefálico.

Así que esta área de aquí abajo y el cáliz se ha sostenido está más o menos en esa área justo allí. Así que lo que vamos a hacer es cortar el resto del cerebro, aislar el tronco encefálico y luego preparar el tronco encefálico para la cámara de corte. Bien, vamos a cortar el resto del cerebro simplemente aislando el tronco encefálico.

Voy a darle la vuelta para demostrar dónde estamos. Normalmente no lo haríamos de esta manera, y de nuevo, podemos deshacernos de toda esa porción. Al darle la vuelta, hemos aislado el tronco encefálico y estamos haciendo otro corte allí mismo.

Está bien, eso es todo. Ese es el tronco encefálico. El cáliz de sostenido está justo allí y allí.

Este es el tronco encefálico. De nuevo, lo retrasaremos un poco. Vamos a cortar un lado del cerebelo y eso va a permitir que el tronco encefálico se asiente de lado así.

Ponemos un poco de pegamento acrílico Sano y, manteniéndolo colocado de lado, lo llenamos rápidamente con hielo frío, una solución fría baja en calcio. Coloque la línea de oxígeno allí lo antes posible. Ahora lo recogemos y lo llevamos al vibrato.

Lo traemos rápido para llegar al principio del cerebro, y luego, una vez que llegamos al comienzo del cerebro, bajamos la velocidad a 0,01 milímetros por segundo. Así que son 10 micros por segundo. Así que se está moviendo a un ritmo increíblemente lento.

La primera parte del cerebro es, es la parte que tiene el mtb, que es el Nilo medial del cuerpo trapezoidal. Y esa es la parte que contiene el, está bien, así que una vez que lo tengo en la pipeta de transferencia, trato de acercarlo lo más posible a la punta de la pipeta. Y ahí está el trozo de cerebro y lo transfiero bastante rápido a esta cámara, que contiene una solución de registro estándar que tiene niveles normales de calcio y también una temperatura más alta.

Y eso permitirá que las rodajas se recuperen después de los procedimientos de corte que están listos de los experimentos de fisiología. Bien, de aquí en adelante, va a ser lo mismo una y otra vez. El siguiente equipo es el que usaré para hacer la sujeción del parche.

Disponemos de un microscopio vertical de platina fija. La platina es fija, como he dicho, por lo que el microscopio se mueve por debajo de ella desde un manipulador. Usamos pelucas y un micro manipulador Newman para sostener el escenario, la etapa principal del amplificador, usamos un amplificador de abrazadera de parche EPC 10 de heca.

Y lo que también debería haber mencionado es que usamos DIC con luz infrarroja. Así que tenemos una cámara IR aquí, por lo que todo lo que vemos se verá en la pantalla cuando busquemos CAE. El amplificador de abrazadera de parche está controlado por este software, que se llama Pulse, que también es de Heca, y controlará el amplificador y todo el experimento de fisiología.

Los resultados saldrán en esta pantalla. El caly que se ha sostenido es un terminal presináptico grande y, debido a que es grande, nos permite conectarlo físicamente al terminal. Así que podemos tomar grabaciones presinápticas y eso es algo único, especialmente en el SNC.

Esto nos permite medir los canales de calcio activados presinápticamente. Además, también podemos medir la actividad potencial de acción si quisiéramos estimular el nervio que conduce al cáliz. Lo que hacemos en este laboratorio es medir un proceso llamado exocitosis, que es la fusión de vesículas que contienen neurotransmisor con la membrana.

Ahora, en esas vesículas se fusionan con la membrana en un proceso llamado exocitosis, agregan membrana a la terminal sináptica, y podemos medir eso como un cambio en la capacitancia. Obtendremos un aumento en la capacitancia a medida que se agrega la membrana al terminal, por lo que los experimentos que mostraré hoy son mediciones de capacitancia, presinápticamente cuando se elimina la membrana. Por lo tanto, no puede seguir agregando membrana, por supuesto, debe quitar alguna.

Ese proceso se denomina endocitosis o captación de membranas. También podemos medir eso y eso se medirá como una disminución en el nivel de capacitancia y mostraremos ejemplos de eso más adelante. Ahora lo que esto nos permite hacer es monitorizar la actividad de los canales de calcio y también monitorizar algunas de las proteínas que están implicadas en la exocitosis y la endocitosis y estudiarlas.

Podemos poner cosas como péptidos para bloquear proteínas que están involucradas en exo o endocitosis. También podemos usar toxinas que hagan lo mismo. También podemos ajustar las cantidades de calcio que entran en la terminal, por lo que realmente podemos estudiar el proceso de exocitosis, la liberación de neurotransmisores, así como la absorción de membrana que sigue a ese evento.

Este es el tubo que contiene nuestra solución de registro intracelular. Lo preparamos con anticipación y luego lo congelamos y, por lo general, podemos usarlo durante varias semanas a un mes antes de tener que hacer una nueva solución. Una vez más, pensamos inmediatamente antes de hacer nuestras grabaciones, y siempre vas a tener una cierta cantidad de partículas de polvo u otro tipo de residuos que van a entrar en tu tubo.

Puedes hacer una de dos cosas. Puede sacar la solución y filtrarla, o puede girarla durante uno o dos minutos y luego retirar la solución, dejando una parte inferior que tendría desechos y otros materiales en su interior. Así que prefiero girarlo y lo haré ahora mismo.

Así que este es el tubo que contiene nuestra solución intracelular. Está descongelado. Vamos a hacerlo girar durante unos dos o tres minutos en una pequeña centrífuga diminuta, y eso debería ser suficiente para sacar las partículas grandes de polvo de la solución.

Así que ahora simplemente quito la parte superior, la solución que acabamos de hilar, teniendo cuidado de no agitarla, transfiriéndola a un tubo limpio, y saco aproximadamente el 90% de ella. Trato de no volver a coger ese último poquito. Así que me detendré justo ahí.

Esto lo pongo en hielo inmediatamente para que se mantenga agradable y frío durante el experimento. Eso es muy importante. Esta es la, esta es una de nuestras pipetas.

Usamos esto para registros intracelulares. Es vidrio de sílice de diámetro grueso de dos milímetros de diámetro exterior, 1,16 milímetros de diámetro interior. En primer lugar, lo que hacemos es rellenar la pipeta.

Así que aplicamos succión, colocamos la pipeta en la solución de grabación y aplicamos succión para tratar de llenar la punta de la pipeta, que de otro modo no se llenará de otra manera. Una vez hecho esto, tomamos un tubo capilar y llenamos el resto del electrodo simplemente tomando la parte posterior de la pipeta. Esta es una técnica de fisiología estándar y, literalmente, la golpea.

Corres el peligro de romper el extremo de la pipeta, pero también tendrás, si no lo haces, a menudo tendrás burbujas de aire. Bien, ahora lo colocamos en nuestro soporte de pipeta, que está conectado a nuestra etapa principal del amplificador de la planta de parches. Allí hay un alambre de cloruro de plata.

El alambre de cloruro de plata entra en contacto con la solución intracelular, y eso nos permite medir la actividad eléctrica en el terminal presináptico. Entonces, lo que hacemos es encontrar la porción que tiene muchos CAE. Queremos una alta densidad de CAEs.

Esto es, estamos buscando el núcleo medial del cuerpo trapezoidal, que es el MNTB, y ahí es donde se encuentra el terminal, que forma la cáliz, o que es la aplicación del cáliz. Y entonces lo que hacemos es empezar a escanear a través de la rebanada. Entonces, por ejemplo, ahí tenemos un cáliz que está un poco más profundo de la superficie y no hay mucho para parchear, así que seguimos escaneando a través de nosotros.

Así que este es un cáliz aquí por el que vamos. Lo que he hecho son dos marcas en la pantalla, que es donde va a ir la pipeta. Y puedes ver que ahí está el pedazo de cáliz que voy a ir después de que la pipeta va a bajar.

Voy a aplicar presión positiva para que empuje hacia arriba contra el cáliz, y luego voy a aliviar la presión positiva. A continuación, el cáliz empujará hacia arriba contra la pipeta, y en ese momento aplico una succión muy suave e intento succionar y empujar la membrana o conseguir que la membrana se selle en la punta de la pipeta. Muy bien, alivió la presión positiva.

Y ahora voy a aplicar la succión. Así que aquí estamos a favor, estamos aplicando un pulso de cinco milivoltios, o en realidad un pulso de cuatro milivoltios. Está bien, eso es todo. Bien.

Ahora bajamos el potencial de membrana menos 80, cancelamos el boom transitorio rápido. Ahora vamos a ir a toda la celda. Voy a aplicar una succión suave y tratar de ir al por mayor.

Esos transitorios de carga indican que él es, que la pipeta y la celda ahora son continuas, que él tiene una, una grabación al por mayor. Esa es otra hermosa toma. Entonces, el rojo más claro era el rastro de capacitancia, y se puede ver que hay un salto repentino y luego disminuyó.

Bien, acabo de mostrarte las técnicas básicas para obtener grabaciones de un terminal presináptico sostenido por el cáliz. Te he mostrado cómo producir las rodajas que contienen el núcleo medial del cuerpo trapezoidal. Ahí es donde encontrarás que los cálices se han mantenido.

Y te he mostrado las técnicas para mirar a través de las rebanadas. Vas a pasar por cada una de las rebanadas, buscando la rebanada que tenga la mayor cantidad de caly que hay en la superficie. A continuación, buscará la membrana calosa más grande que pueda encontrar y le colocará el registro de la abrazadera.

Y también les he mostrado las técnicas para la grabación de pinzas de parches, y esas son técnicas estándar de grabación de pinzas de parches.