Name: Métodos para grabaciones de parche Capacidad de la pinza del cáliz (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-07-29T00:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 58 s
Description: Aprende técnicas de grabación de parche presináptico en el cáliz de Held de rata. Este método permite estudiar mecanismos de liberación de neurotransmisores y exocitosis en terminales sinápticos del sistema nervioso central.

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Setup Patch Clamp: Óptica: La óptica es muy importante encontrar un buen celular, y para establecer la posición de la misma. Trate de obtener una imagen clara de las células: los bordes afilados, aspecto suave de la célula. Escanear todo el campo en busca de buenas células MNTB principal con cáliz unido. Gire plato en busca de los cálices desde diferentes ángulos. En un primer momento, está bien practicar en forma de globo terminal. Recogida de células en la superficie de corte, o en la capa de 2 º de la célula. Objetivo de la primera 1 / 3 de la celda con una pipeta La identificación de cálices: Busque una doble membrana (ver Figura 1), y girar el plato división para ver desde diferentes ángulos para ayudar a confirmar que se trata de un cáliz. <img src="/files/ftp_upload/old/244_2008_8_22_2/244_Figure-01.png" alt="Figura 1" width="298" height="159" /> Figura 1 La profundidad del Cáliz Cáliz debe estar en la superficie o lo más cerca posible de la superficie. La superficie disponible para parchear: Use la perilla de enfoque fino en microscopio para determinar cómo &quot;de ancho / profundo&quot; es el cáliz. Por ejemplo, alrededor del 10% de una vuelta completa en el enfoque fino le dará más de superficie suficiente para el parche en. Sellado en una célula presináptica: Para llegar a la celda adjunta, busque una &quot;pequeña&quot; deformación en la superficie de la célula debido a la presión de punto de venta (~ 0.15psi) en la pipeta, el uso manipulador de ejecutar la pipeta hacia arriba, abajo ya través, y en hasta la superficie de la terminal presyn para obtener una deformación bueno, entonces liberar la presión y el efecto de succión, siempre y cuando sea necesario. PULSE, el programa de adquisición de datos: Necesidad de aumentar el tamaño del búfer antes del primer uso, y siempre que sea necesario por la capacidad de toma de muestras. Necesidad de cargar macros modificada cada vez. Junction potencial líquido: solución de grabación Presyn es-11mV (11mV negativo). Presyn: Cslow = ~ 15 pF Rs un borrador de presyn: 10 microsegundos, el 65% (más la compensación podrá posible w / las oscilaciones) Antes de capacidad de grabación: relajación Corriente de prueba (10 mV, 10 mseg salto) para ver si la relajación es monoexponencial, es decir, ya sea a presyn puede ser modelada por un solo compartimiento. Filtros: Situado a 30 kHz y 10 kHz (filtro de Bessel 1 y 2, respectivamente) durante la medición de la relajación, para asegurarse de que un componente de rápido no está perdido. En las grabaciones mini, Xinsheng utiliza 10 kHz y 5 kHz. LGW me pidió que utilice sólo un filtro ajustado a 30 kHz para asegurarse de que se puede medir tiempo de subida de mini. Los archivos de nombres: 7 dígitos 000mmxx, donde mm es el mes (o mes y año) y xx es el número de células. Limpieza de líneas de solución: Líneas de limpieza al final del experimento con 20 ml de HCl 0,1 M seguido por 200 ml ddH2O. Soluciones externas son reciclados, velocidad de la bomba es de 20-30 rpm. (Solución de regresar de la cámara de baño fluye hacia el cilindro graduado). Establecido tres líneas de salida para asegurar la succión suficiente. Adición de la solución de grabación presináptica: ~ 310 milisegundos osmolar Solución Presyn debe ser ~ 310 mOsm para prevenir R-aumentar el acceso durante el experimento. Presyn solución de la pipeta es diferente de postsyn pipeta solución (Presyn ha ATP y GTP por ej.). TTX-TEA solución (para aislar las corrientes de Ca): <ul><li> Trate de aplicar después de sellar, o parches, incluso, en la célula, como TEA en los bloques de solución de K-canales y despolariza la célula. Esto no es bueno para la célula. Por la misma razón, puede que no sea posible volver a usar el corte después de TTX se aplica. </li><li> Comparar la respuesta primera y la última de la célula, o una rebanada para comprobar si hay algún efecto de la despolarización prolongada. </li><li> TTX se utiliza en una M en lugar de 0,5 M de modo que el efecto es más rápido. Necesidad de esperar menos tiempo después de cambiar las soluciones. </li></ul> Rebanadas de corte Vibratome ajustes: <ul><li> 70Hz vibraciones laterales </li><li> Amplitud: 1,0 mm </li><li> La velocidad de avance 0,01-0,02 mm / seg, mientras cortaba rebanadas de cáliz, de lo contrario 0.1 Espesor: 180 micras (~ 150micras en los animales más viejos) </li></ul> Rebanadas de incubar a 37 º C durante 1 hora (incluye el tiempo de corte), es decir, dejar en el baño de 15-20 minutos después del corte. Pipetas: Presyn: 3,5 a 4,5 mW en un primer momento, desde 3,0 hasta 3,5 mW cuando se sienten más seguros Extractor de uso manual para establecer la configuración. Utilice la función de retraso porque el vidrio es grueso (retrasos de 200 o un trabajo) Vidrio tipo: borosilicato, de pared estándar, sin filamentos Diámetro exterior: 2.0 mm Diámetro interior de 1,16 mm Longitud: 7,5 cm

métodos para grabaciones de parche capacidad de la pinza del cáliz

Methods for Patch Clamp Capacitance Recordings from the Calyx

Se demuestra las técnicas básicas para la grabación de presináptica de patch clamp en el cáliz de Held, un mamífero nervioso central terminal nerviosa del sistema. Registros eléctricos de la terminal presináptica permitir la medición de potenciales de acción, las corrientes de los canales de calcio, la fusión de vesículas (exocitosis) y la absorción de la membrana posterior (endocitosis). La fusión de vesículas que contienen neurotransmisores provoca la membrana de la vesícula que se añade a la membrana celular del cáliz. Este aumento en la cantidad de membrana celular se mide como un aumento de la capacidad. La consiguiente reducción de capacidad indica la endocitosis, el proceso de absorción de la membrana o la eliminación de la membrana del cáliz. Endocitosis, es necesario mantener la estructura del cáliz, y también es necesario para formar vesículas que se llenará con el neurotransmisor de la exocitosis eventos futuros. Grabaciones de capacitancia en el cáliz de Held han hecho posible medir directamente y con rapidez la liberación vesicular y la endocitosis posterior en un terminal nervioso SNC de los mamíferos. Además, la actividad postsináptica correspondientes se pueden medir simultáneamente mediante el uso de grabaciones de pares. Por lo tanto una imagen completa de la actividad eléctrica presináptica y postsináptica en la sinapsis del sistema nervioso central que se puede lograr utilizando esta preparación. En este caso, los métodos para la preparación de corte, las características morfológicas para la identificación de los cálices de las técnicas de Held, parche básico de sujeción, y los ejemplos de las grabaciones de capacidad para medir la exocitosis y la endocitosis se presentan.

Métodos para grabaciones de parche Capacidad de la pinza del cáliz

Demostramos las técnicas básicas para el registro de patch clamp presináptico en el cáliz de Held, una terminal nerviosa del sistema nervioso central de mamíferos. ...

Hola, mi nombre es Ken Paradiso. Trabajo para Ling Gang Wu en el programa intramural del Instituto Nacional de Trastornos Neurológicos y Accidentes Cerebrovasculares, que se encuentra en el campus de los NIH en Bethesda. Voy a mostrarles las técnicas para la grabación presináptica en el calículo mediante el método de parche en configuración de sello adherente (patch clamping).Para preparar el tejido cerebral, extraemos el cerebro de la rata. Colocamos el cerebro dentro de esta solución, que debe estar fría con hielo y con bajo contenido de calcio, y se burbujea con carbógeno para asegurar un suministro constante de oxígeno al cerebro. Además, la solución debe mantenerse fría con hielo para minimizar la DA y reducir al mínimo la cantidad de daño.Entonces, el cerebro quedaría ahora en esta solución. Lo sacaríamos, lo cortaríamos adecuadamente para que pudiera colocarse sobre el bloque, fijándolo al bloque con Sano correlate o pegamento sintético, pero llenaríamos la cámara con una solución fría con bajo contenido de calcio, la burbujearíamos, la colocaríamos sobre el vibrátomo y luego cortaríamos secciones de 180 a 190 micrones de grosor a una frecuencia de la cuchilla de 70 hercios

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Esta pretende ser una introducción a la revisión de la grabación de la abrazadera ovocitos de Xenopus laevis. Cubre la eliminación vitelina membrana, la formación de un sello gigaohm (gigaseal), y la conversión opcional de la revisión a la topología de fuera-out.

Parche de grabación Clamp de canales iónicos expresados ​​en ovocitos de Xenopus

Corriente iónica de los canales BK se registraron con la técnica de patch clamp. Canales BK se expresan...

Patch clamp y técnicas de perfusión para el estudio de los canales iónicos expresados ​​en Xenopus Ovocitos

Ofrecemos un protocolo de paso a paso para la grabación de células enteras patch clamp de calcio activados por calcio de lanzamiento (CRAC) las corrientes en mononucleares de sangre periférica de células derivadas de los linfocitos T humanos.

De células enteras de grabación de calcio activados por calcio de lanzamiento (CRAC) Las corrientes en los linfocitos T humanos

A continuación se describe un protocolo para la preparación de agar-incrustados trozos de retina que son adecuados para la electrofisiología y la Ca2 + imágenes. Este método permite estudiar la cinta del tipo de sinapsis en la retina utilizando microcircuitos directa patch-clamp grabaciones de una sola terminales nerviosas presinápticas.

Patch-clamp mediciones de capacitancia y Ca 2 + Imágenes en las terminaciones nerviosas individuales en rebanadas de retina

Este protocolo describe una técnica llamada electrofisiología de pinza de parche de célula completa, que es un método para estudiar las propiedades eléctricas de las neuronas de Mauthner y otras células reticuloespinales en embriones de pez cebra.

Electrofisiología de pinza de parche de célula completa: un método para estudiar las propiedades eléctricas de las neuronas

Hemos desarrollado una preparación espinal cerebral espinal intacta para registrar y monitorear la actividad eléctrica a través de la grabación de patch clamp de las neuronas y otras células de Mauthner reticulospinal en embriones de pez cebra. Por lo tanto, somos capaces de registrar las corrientes sinápticas excitatorias e inhibitorias, la actividad del canal dependiente de voltaje y los potenciales de acción de las neuronas clave en un embrión en desarrollo.

Patch Clamp Las grabaciones de las células embrionarias de pez cebra Mauthner

Descrito aquí es un procedimiento para la obtención de largos tramos de grabación actual de un canal de iones con la técnica de patch-clamp de células-adjunto. Este método permite observar, en tiempo real, el modelo de open-close conformaciones de canales que son la base de la señal biológica. Estos datos informan acerca de las propiedades de los canales en las membranas biológicas inalteradas.

Un canal celular conectado a Patch-clamp grabación

Después de la exocitosis, la membrana plasmática fusionada se recupera a través de un proceso conocido como endocitosis. Este mecanismo reforma las nuevas vesículas sinápticas para la siguiente ronda de liberación. Los eventos endocíticos individuales se capturan y analizan mediante el uso de los registros de capacitancia adjuntos a la célula en células cromafines suprarrenales de ratón.

Los métodos para mediciones de capacitancia celulares inscritos en ratón suprarrenal Cromafín Cell

El presente protocolo describe un método eficiente para la adquisición dinámica y en tiempo real de corrientes de canal de potasio (Kv) dependientes de voltaje en cardiomiocitos H9c2 utilizando la técnica de pinza de parche de células enteras.

Registro de corriente de potasio dependiente del voltaje en cardiomiocitos H9c2 mediante la técnica de pinza de parche de células enteras

Esta es una guía para modificar la forma de pipetas de vidrio. En concreto, mediante el uso de calor y presión de aire el cono se ensancha sin aumentar la apertura de la punta, lo que lleva a la resistencia a la pipeta inferior. Esto es fundamental para conseguir grabaciones de bajo nivel de ruido de células pequeñas, pero es útil en muchas aplicaciones.

Pulido a presión para la Mejora de pipetas de patch-clamp grabación

Aprende técnicas de grabación de parche presináptico en el cáliz de Held de rata. Este método permite estudiar mecanismos de liberación de neurotransmisores y exocitosis en terminales sinápticos del sistema nervioso central.

Métodos para grabaciones de parche Capacidad de la pinza del cáliz

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