Cromatografía líquida de alta resolución en fase reversa: un método robusto para la cuantificación de ácidos siálicos marcados y derivatizados con fluorescencia aislados de hígado de ratón

Los ácidos siálicos, como el ácido N-acetilneuramínico y el ácido N-glicolilneuramínico, son restos de carbohidratos cargados negativamente que se encuentran en los extremos distales de las cadenas de oligosacáridos en la superficie celular de los mamíferos.

Para cuantificar las cantidades relativas de estos ácidos siálicos en el tejido hepático de ratón mediante cromatografía líquida de alta resolución de fase reversa o RP-HPLC, primero trate la mezcla aislada de ácido siálico con un agente de derivatización. El agente de derivatización interactúa con los grupos funcionales de los ácidos siálicos, generando derivados estables y fluorescentes del ácido siálico.

Ensamble una columna RP-HPLC, conectada a un detector de fluorescencia. La columna comprende una fase estacionaria porosa a base de sílice unida a ligandos de cadena alquilo hidrófobos no polares para facilitar las interacciones selectivas con los derivados del ácido siálico durante la ejecución cromatográfica.

Equilibre la columna utilizando fase móvil polar acuosa que contenga bajas concentraciones de acetonitrilo, un disolvente orgánico menos polar, para un acondicionamiento óptimo de la columna.

Cargue la mezcla de ácido siálico derivatizado en la columna.

El ácido N-acetilneuramínico, que contiene un grupo N-acetilo hidrofóbico, se adsorbe más fuertemente a los ligandos hidrofóbicos de la fase estacionaria que el ácido N-glicolilneuramínico con un grupo N-glicolilo hidrófilo.

Analice las muestras utilizando un sistema HPLC estándar conectado a un detector de fluorescencia en línea. Utilice una columna C-18 de fase inversa con una longitud de 250 milímetros y un diámetro de 4,6 milímetros para el análisis.

Después de preparar el disolvente A y el disolvente B, y configurar la ejecución de HPLC como se detalla en el protocolo de texto, inyecte 50 microlitros de la muestra en el sistema de HPLC.

Monitoree los eluyentes, utilizando la longitud de onda de excitación del detector de fluorescencia de 373 nanómetros y una longitud de onda de emisión de 448 nanómetros.

Finalmente, calcule la cantidad relativa de Neu5Gc como se describe en el protocolo de texto.