Visualización basada en inmunofluorescencia de las interacciones de las proteínas de reparación del ADN

Las roturas de doble hebra de ADN inducidas por radiación, o DSB, inician el reclutamiento de proteínas de reparación del ADN en el sitio dañado, activando la reparación del ADN.

Para detectar las proteínas de reparación del ADN γH2AX y 53BP1 en los sitios DSB utilizando inmunofluorescencia indirecta, tome cubreobjetos que contengan células epiteliales. Irradiar un subconjunto de las células. Incubar, permitiendo que las células irradiadas y no irradiadas de control crezcan durante tiempos específicos.

Tratar con un tampón para extraer los núcleos celulares. Fije los núcleos celulares para preservar su morfología. Tratar con una solución bloqueadora para minimizar la unión de anticuerpos primarios no específicos.

Agregue anticuerpos primarios dirigidos a las dos proteínas de reparación del ADN. Los anticuerpos se unen a las proteínas respectivas.

Incubar con anticuerpos secundarios marcados con fluoróforos rojos y verdes, respectivamente. Los anticuerpos secundarios, específicos para cada anticuerpo primario, se unen a sus objetivos. Agregue un medio de montaje que contenga DAPI en un portaobjetos de vidrio. Monte los cubreobjetos en él para obtener imágenes.

DAPI, un tinte de unió