Visualización basada en inmunofluorescencia de las interacciones de las proteínas de reparación del ADN

Las roturas de doble hebra de ADN inducidas por radiación, o DSB, inician el reclutamiento de proteínas de reparación del ADN en el sitio dañado, activando la reparación del ADN.

Para detectar las proteínas de reparación del ADN γH2AX y 53BP1 en los sitios DSB utilizando inmunofluorescencia indirecta, tome cubreobjetos que contengan células epiteliales. Irradiar un subconjunto de las células. Incubar, permitiendo que las células irradiadas y no irradiadas de control crezcan durante tiempos específicos.

Tratar con un tampón para extraer los núcleos celulares. Fije los núcleos celulares para preservar su morfología. Tratar con una solución bloqueadora para minimizar la unión de anticuerpos primarios no específicos.

Agregue anticuerpos primarios dirigidos a las dos proteínas de reparación del ADN. Los anticuerpos se unen a las proteínas respectivas.

Incubar con anticuerpos secundarios marcados con fluoróforos rojos y verdes, respectivamente. Los anticuerpos secundarios, específicos para cada anticuerpo primario, se unen a sus objetivos. Agregue un medio de montaje que contenga DAPI en un portaobjetos de vidrio. Monte los cubreobjetos en él para obtener imágenes.

DAPI, un tinte de unión al ADN, se une a los surcos menores ricos en AT del ADN bicatenario, contratiñendo los núcleos. Visualice los núcleos celulares con un microscopio de fluorescencia.

En comparación con los núcleos celulares no irradiados, los núcleos irradiados exhiben múltiples focos de γH2AX que disminuyen con el tiempo, lo que indica una reparación progresiva del ADN en células cultivadas durante períodos más largos.

Las señales de fluorescencia rojas y verdes superpuestas aparecen en amarillo, lo que indica la colocalización de γH2AX y 53BP1 en el sitio DSB después de la irradiación.

Comience cultivando 40,000 células HeLa en cada pocillo de una placa de 12 pocillos con un cubreobjetos de vidrio redondo de 18 milímetros hasta una confluencia del 80%. Después de exponer las células a la irradiación gamma 4 Gray, lávelas dos veces con 1 mililitro de PBS. Luego, retire el PBS por completo y agregue 200 microlitros de NEB a cada pocillo. Incube las células durante 2 minutos a temperatura ambiente, luego retire el NEB.

Tenga en cuenta que el tiempo de incubación puede variar según la línea celular, pero generalmente no debe exceder los dos minutos. Lave las células con 1 mililitro de PBS. Luego, retire el PBS por completo y agregue 200 microlitros de PFA al 4% a cada pocillo para la fijación celular.

Incube las células durante 10 minutos a 4 grados centígrados, luego, retire el PFA y agregue 1 mililitro de PBS a cada pocillo. Retire el PBS por completo y luego, agregue 200 microlitros de solución bloqueante a cada pocillo e incube las células durante 2 horas a temperatura ambiente, o de 16 a 18 horas a 4 grados centígrados.

Diluya el anticuerpo primario en tampón de dilución y vórtice hasta que esté bien mezclado. En una caja de humedad, adhiera un trozo de parafilm y agregue 10 microlitros de anticuerpo primario en una sola gota. Alinee un borde del cubreobjetos del pocillo con la gota y bájelo lentamente sobre el parafilm, esparciendo el líquido. Incube el cubreobjetos durante 2 horas a temperatura ambiente.

Después de la incubación, lave los cubreobjetos tres veces en PBS durante 1 minuto por lavado. Diluya el anticuerpo secundario en tampón de dilución y vórtice hasta que esté bien mezclado. Aplique 10 microlitros de anticuerpo secundario a cada cubreobjetos como se describió anteriormente, e incube durante 2 horas a temperatura ambiente, protegido de la luz.

Lave los cubreobjetos tres veces con PBS, y una vez con agua, durante 1 minuto por lavado. Luego, móntelos en portaobjetos de vidrio con un medio de montaje a base de glicerol que contenga DAPI. Selle los cubreobjetos con esmalte de uñas transparente y déjelos secar durante 20 minutos. Coloque una gota de aceite de inmersión en la lente del objetivo 60X y use DAPI para ubicar los núcleos a través del ocular.

Para la adquisición de imágenes XYZ, abra el software de adquisición y configure el "Tipo de escáner" como "Galvano", el "Modo de escáner" como "Ida y vuelta" y el tamaño de imagen "512 por 512". En el panel PMT, establezca el modo en VBM, el promedio en Fotograma y el escaneo secuencial en Línea. A continuación, configure los detectores de tinte y calor. Configure el canal 1 en DAPI y SD1, el canal dos en Alexa Fluor 488 y HSD3, y el canal 3 en Alexa Fluor 647 y HSD4. Seleccione "ON" en "Z".

Para ajustar la imagen en vivo, presione el botón Live en la ventana en vivo y ajuste el enfoque. Luego, use la ventana "Herramienta PMT" para configurar la intensidad, la sensibilidad, la ganancia y el desplazamiento del láser. Para Pilas Z, seleccione De principio a fin y 15 sectores. Seleccione la carpeta para guardar imágenes y presione el botón Inicio de LSM para comenzar a adquirir. Cuando termine, presione el botón Serie terminada para completar la adquisición de imágenes.