Generación de partículas similares al virus chikungunya utilizando el sistema de expresión de baculovirus en células de insectos

Las partículas similares al virus Chikungunya, VLP, son estructuras no infecciosas compuestas por proteínas de la envoltura viral incrustadas dentro de una bicapa lipídica y desprovistas de material genético.

Para producir VLP de Chikungunya, infecte las células de insectos Spodoptera frugiperda Sf9 con baculovirus recombinantes que expresan un casete de genes estructurales de Chikungunya. El casete consiste en un promotor de baculovirus fusionado con genes estructurales de chikungunya que codifican proteínas de la cápside y la envoltura.

Durante la incubación, las glicoproteínas de la envoltura del baculovirus se unen a los receptores de superficie de las células del insecto. Esto facilita la entrada del baculovirus y la liberación del ADN viral en el citoplasma, generando poliproteínas que contienen proteínas de la cápside y la envoltura del chikungunya.

Después de la síntesis, la escisión autocatalítica de la proteína de la cápside produce la poliproteína precursora que posee proteínas de la envoltura en el retículo endoplásmico, RE. En la luz del RE, las enzimas escinden la poliproteína precursora, generando proteínas individuales que ingresan al compartimento de Golgi para su posterior procesamiento, formando heterotrímeros proteicos.

Las proteasas residentes de Golgi escinden los heterotrímeros proteicos, produciendo proteínas maduras de la envoltura con proteínas E2 y E1. Estas proteínas de la envoltura se translocan a la membrana, se convierten en VLP y se liberan en el medio.

Transfiera el cultivo infectado a un tubo y centrífugo para granular las células del insecto. Aspire el sobrenadante que contiene VLP y fíltrelo para eliminar los residuos.

El filtrado resultante, que contiene VLP de chikungunya, está listo para estudios de inmunopatología.

Cultivar células de Spodoptera frugiperda, o Sf9, previamente preparadas en suspensión en matraces giratorios agitando continuamente a 130 rpm en un sistema de placa de agitación multipunto. Mantenga los volúmenes de cultivo a no más de la mitad del volumen del matraz giratorio para una aireación adecuada. A continuación, exprese las VLP de CHIK infectando 250 mililitros de células Sf9 en un matraz giratorio a una densidad de 2 x 10⁶ células por mililitro con baculovirus recombinante previamente preparado, y devuelva las células a una incubadora de 28 grados Celsius.

Utilice la exclusión de azul de tripano para determinar si la viabilidad celular ha disminuido al 70% al 80%. Tras la confirmación, transfiera los cultivos directamente de la suspensión a tubos cónicos de 50 mililitros y gire las células hacia abajo. Recoja los sobrenadantes y fíltrelos a través de una membrana de poros de 0,22 micras antes de la sedimentación.