Expresión transitoria y localización celular de proteínas recombinantes en células cultivadas de insectos

El objetivo general de este procedimiento es expresar proteínas de interés marcadas con fluorescencia dentro de células de insectos disponibles comercialmente para mejorar la elucidación de la función de las proteínas y/o el tráfico celular de proteínas. Este método puede ayudar a responder preguntas clave basadas en la biología celular y la bioquímica con respecto a la funcionalidad de las proteínas, las interacciones de las proteínas o la localización de las proteínas subcelulares. La principal ventaja de esta técnica es que las proteínas pueden generarse rápidamente y expresarse funcionalmente en células vivas sin efectos deletéreos asociados con la expresión de baculovirus, mejorando así el rendimiento.

Aunque este método puede proporcionar información en el estudio de las proteínas de los insectos, también se puede aplicar a cualquier sistema para el que se desee el estudio de la función de las proteínas o la localización celular. Danni LeRoy, un técnico de mi laboratorio, demostrará el procedimiento para el cultivo y la transfección de células de insectos. Para comenzar este procedimiento, retire los viales de stock de células SF9 y Tni congeladas del congelador a menos 80 grados centígrados y permita que se descongelen en un baño de agua a 37 grados centígrados.

Después de descongelar, descontamine los viales con etanol al 70% y colóquelos sobre hielo. Todas las manipulaciones celulares que requieran la apertura de viales y matraces de cultivo de tejidos deben realizarse dentro de una campana de flujo laminar para mantener las condiciones estériles. Añada cuatro mililitros de medio de insectos sin suero a un nuevo matraz T25 y cuatro mililitros de medio TNM-FH a otro matraz T25.

Transfiera un mililitro de células Tni descongeladas al matraz con medio de insectos sin suero y un mililitro de células SF9 descongeladas al matraz con medio TNM-FH. Coloque los matraces en una incubadora no humidificada a 28 grados centígrados y deje que las celdas se adhieran durante 30 a 45 minutos. Reemplace el medio de siembra con cinco mililitros del medio apropiado.

Y regrese los matraces a la incubadora no humidificada a 28 grados centígrados. Monitoree la confluencia celular diariamente. Pase las células cuando alcancen el 90% de confluencia como se muestra en estas imágenes representativas.

Incline el matraz que contiene las células confluentes de modo que el medio fluya hacia una esquina alejada de la monocapa celular y utilice una pipeta serológica estéril de cinco mililitros para extraer cuidadosamente el medio sin alterar las células. En el caso de las células Tni, utilice una nueva pipeta serológica estéril de cinco mililitros para añadir suavemente cuatro mililitros de medio de insectos sin suero sobre la monocapa confluente. Mueva la punta de la pipeta a través del matraz y riegue lentamente para eliminar las células que estén adheridas al fondo del matraz.

Para comprobar el adecuado desprendimiento de las células, retire todos los medios, dé la vuelta al matraz y observe que el fondo del matraz está limpio. Para las células SF9, que se adhieren más firmemente, agregue cuatro mililitros de medio TNM-FH fresco y use un raspador de células para desalojar las células adheridas. Utilice una pipeta serológica de cinco mililitros para mezclar suavemente y reducir la aglomeración de células.

Después de separar las celdas, transfiera aproximadamente 0,1 mililitros de cada célula y mezcla de medio a un tubo de micro-fuga de 1,5 mililitros. En un tubo de micro-fuga de 0,5 mililitros por separado, agregue 10 microlitros de cada celda y mezcla de medio a 10 microlitros de azul de tripán. Retire el portaobjetos de la cámara del contador de celdas de su empaque y agregue 10 microlitros de la mezcla de azul de tripán del medio celular a cada lado del portaobjetos de conteo.

Inserte el portaobjetos en un contador de celdas automatizado y determine la densidad y viabilidad de las celdas. Transfiera aproximadamente de una a 1,5 veces 10 a la 6ª celda a matraces T25 con medios frescos. Etiquete los matraces con la línea de celdas, la fecha, el medio utilizado, el número de celdas agregadas y el número de paso.

Coloque los matraces en una incubadora a 28 grados centígrados durante un máximo de 72 horas. El procedimiento para la transfección de células de insectos también debe realizarse dentro de una campana de flujo laminar. Siembre un matraz T25 con hasta una vez 10 por la 6ª célula Tni o SF9 en un medio celular de insecto apropiado.

En esta demostración se utilizan células Tni. Haga crecer las células hasta la confluencia durante 72 horas a 18 grados centígrados. 72 horas después, retire y deseche el medio viejo y desaloje las células Tni con cuatro mililitros de medio de insecto fresco sin suero como se muestra anteriormente.

El aspecto más difícil de este procedimiento es obtener la densidad adecuada de células adheridas a las placas de fondo de vidrio durante la transfección. No se deben agregar más de siete veces 10 a la 5ª celda a cada plato. Después de usar un contador de células automatizado para estimar la densidad de celdas, mezcle a fondo pero suavemente la suspensión celular invirtiendo el tubo y agregue aproximadamente siete veces 10 a la quinta celda a platos individuales de fondo de vidrio de 35 milímetros.

Deje que las celdas se adhieran durante 20 a 25 minutos a 28 grados centígrados. Para cada transfección, agregue dos microgramos de ADN plasmídico a 0,1 mililitros de medio de insectos libre de suero sin FBS en un tubo de micro-fuge estéril de 1,5 mililitros. En un tubo aparte, mezcle ocho microlitros de reactivo de transfección con 0,1 mililitros de medio de insectos sin suero.

A continuación, transfiera la solución al tubo que contiene el ADN plasmídico de interés. Agite ligeramente e incube a temperatura ambiente durante 20 a 30 minutos. A continuación, diluya la mezcla de transfección de plásmidos con 0,8 mililitros de medio de insectos sin suero, elevando el volumen total a un mililitro.

Retire con cuidado el medio del plato de vidrio que contiene las celdas adheridas. Superponga las células adjuntas con el medio de transfección de plásmidos diluido. Incubar las células a 28 grados centígrados durante cinco horas.

Después de cinco horas, retire y deseche el medio de transfección y lave suavemente las células con un mililitro de medio de insectos sin suero, teniendo cuidado de no desalojar las células. Agregue dos mililitros de medio celular de insecto fresco sin suero e incube a 28 grados centígrados durante 48 a 72 horas. De 48 a 72 horas después de la transfección de las células del insecto, lave las células una vez con un mililitro de medio para insectos IPL-41 y luego cúbralas con dos mililitros de IPL-41 para obtener imágenes.

Añada cuatro gotas de reactivo de tinción de células vivas de Hoechst al medio e incube a 28 grados centígrados durante 20 a 25 minutos. Coloque el plato de 35 milímetros en el microscopio confocal de escaneo láser autoincluido. Aunque hay muchos platos de vidrio disponibles comercialmente, es importante que se ajusten a la etapa del microscopio y puede ser necesario determinar empíricamente qué cristalería es más compatible con la fijación de células.

Ajuste el microscopio para las condiciones de observación de Hoechst, EGFP y mCherry. 359 nanómetros y 461 nanómetros para excitación y emisión de Hoechst. 489 nanómetros y 510 nanómetros para excitación y emisión de EGFP.

Y 580 nanómetros y 610 nanómetros para la excitación y emisión de mCherry. Usando un objetivo 10X, realice un escaneo inicial para confirmar la expresión fluorescente. Después de eso, cambie al modo de escaneo usando un objetivo de inmersión en agua con contraste de fase de 60X.

Ajuste la potencia del láser, la sensibilidad del detector, la velocidad de escaneo, la profundidad del eje Z y el zoom digital para optimizar el contraste y la resolución de la imagen. Visualice las celdas con un zoom digital de 1,5X para obtener una amplificación total de 90X. Guarde y exporte los datos sin procesar como archivos de imagen TIFF para su posterior análisis.

Las células Tni se transfectaron con los plásmidos indicados y la expresión de proteínas recombinantes se visualizó mediante microscopía de fluorescencia confocal. El éxito de la transfección y expresión de BtDrip1-EGFP recombinante es evidente por la presencia de fluorescencia verde en la superficie de la célula. Las células transfectadas con BtDrip2 versión uno EGFP muestran fluorescencia verde en su interior, lo que indica la expresión intracelular de BtDrip2 versión uno.

Del mismo modo, las células transfectadas con PIB DmSPR-mCherry o PIB PLA2G15-mCherry muestran fluorescencia roja que indica la expresión de las quimeras respectivas. En las imágenes combinadas, las áreas naranjas o amarillas indican la expresión de EGFP y mCherry, lo que sugiere que las proteínas están colocalizadas dentro de las mismas estructuras subcelulares. Una superposición de células doblemente transfectadas con PIB BtDrip1-EGFP y PIB DmSPR-mCherry sugiere la colocalización de BtDrip1-EGFP y DmSPR-mCherry en la superficie de la célula.

Las células doblemente transfectadas con BtDrip2 versión uno, EGFP y PIB DmSPR-mCherry muestran poca colocalización de señales de fluorescencia verde y roja, lo que confirma la expresión intracelular de BtDrip2 versión uno. Por el contrario, la coexpresión de PIB BtDrip2 versión uno EGFP y el marcador lisosomal PIB PLA2G15-mCherry dio lugar a una superposición significativa en las señales fluorescentes citoplasmáticas verde y roja. Esto sugiere fuertemente que BtDrip2 es el tráfico a los lisosomas intercelulares.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo expresar quimeras de proteínas fluorescentes dentro de células de insectos cultivadas. Este sistema ofrece una rápida construcción de vectores en la síntesis de proteínas, evita los desafíos de los sistemas de expresión basados en virus y proporciona un medio sólido para observar las proteínas de tráfico celular.