Expresión transitoria y localización celular de proteínas recombinantes en células cultivadas de insectos

El objetivo general de este procedimiento es expresar proteínas de interés marcadas con fluorescencia dentro de células de insecto disponibles comercialmente, para una mejor elucidación de la función proteica y/o del tráfico celular de proteínas. Este método puede ayudar a responder preguntas clave de biología celular y bioquímica relacionadas con la funcionalidad de proteínas, interacciones proteicas y/o la localización subcelular de proteínas. La principal ventaja de esta técnica es que los constructos pueden generarse rápidamente y las proteínas expresadas pueden evaluarse funcionalmente en células vivas sin efectos perjudiciales asociados con la expresión mediante baculovirus, mejorando así el rendimiento.

Aunque este método puede aportar conocimientos en el estudio de proteínas de insectos, también puede aplicarse a cualquier sistema en el que se desee estudiar la función proteica o la localización celular. La técnica para el cultivo y transfección de células de insecto será demostrada por Danni LeRoy, una técnica de mi laboratorio. Para comenzar este procedimiento, retire los viales stock de células SF9 y Tni congeladas del congelador a menos 80 grados celsius y déjelas descongelar en un baño de agua a 37 grados celsius.

Después de descongelar, descontamine los viales con etanol al 70% y colóquelos sobre hielo. Todas las manipulaciones celulares que requieran abrir viales y frascos de cultivo de tejidos deben realizarse dentro de una cabina de flujo laminar para mantener condiciones estériles. Añada cuatro mililitros de medio para insectos sin suero a un nuevo frasco T25 y cuatro mililitros de medio TNM-FH a otro frasco T25.

Transfiera un mililitro de células Tni descongeladas al frasco con medio para insectos sin suero y un mililitro de células SF9 descongeladas al frasco con medio TNM-FH. Coloque los frascos en una incubadora no humectada a 28 grados Celsius y permita que las células se adhieran durante 30 a 45 minutos. Reemplace el medio de siembra con cinco mililitros del medio adecuado.

Y devuelva los matraces al incubador no humedecido a 28 grados Celsius. Monitoree diariamente la confluencia celular. Pase las células cuando alcancen una confluencia del 90 %, como se muestra en estas imágenes representativas.

Incline el matraz que contiene las células confluentes de manera que el medio fluya hacia una esquina alejada de la monocapa celular y utilice una pipeta serológica estéril de cinco mililitros para retirar cuidadosamente el medio sin perturbar las células. Para las células Tni, use una nueva pipeta serológica estéril de cinco mililitros para agregar suavemente cuatro mililitros de medio para insectos sin suero sobre la monocapa confluyente. Mueva la punta de la pipeta a través del matraz e irriague lentamente para eliminar las células débilmente adheridas al fondo del matraz.

Para verificar la adecuada desprendimiento de las células, retire todo el medio, invierta el frasco y observe que el fondo del frasco esté limpio. Para las células SF9, que se adhieren más firmemente, agregue cuatro mililitros de medio TNM-FH fresco y utilice un raspador celular para desprender las células adheridas. Use una pipeta serológica de cinco mililitros para mezclar suavemente y reducir la formación de agregados celulares.

Después de separar las células, transfiera aproximadamente 0,1 mililitros de cada mezcla de células y medio a un tubo microfuga de 1,5 mililitros. En un tubo microfuga separado de 0,5 mililitros, agregue 10 microlitros de cada mezcla de células y medio a 10 microlitros de azul de tripano. Retire la lámina de cámara para conteo de células de su envase y agregue 10 microlitros de la mezcla de medio celular con azul de tripano a cada lado de la lámina de conteo.

Introduzca el portaobjetos en un contador celular automatizado y determine la densidad celular y viabilidad. Transfiera aproximadamente de uno a 1,5 veces 10 a la 6ª células a frascos T25 con medio fresco. Etiquete los frascos con la línea celular, la fecha, el medio utilizado, el número de células añadidas y el número de pase.

Coloque los frascos en una incubadora a 28 grados Celsius durante un máximo de 72 horas. El procedimiento de transfección de células de insecto también debe realizarse dentro de una cabina de flujo laminar. Siembre un frasco T25 con hasta una vez 10 a la 6ª células Tni o SF9 en un medio adecuado para células de insecto.

Se utilizan células Tni en esta demostración. Cultive las células hasta alcanzar confluencia durante 72 horas a 18 grados celsius. 72 horas después, retire y deseche el medio antiguo y desprenda las células Tni con cuatro mililitros de medio para insectos fresco sin suero, como se mostró anteriormente.

El aspecto más difícil de este procedimiento consiste en obtener la densidad adecuada de células adheridas a los platos con fondo de vidrio durante la transfección. No se deben añadir más de siete veces 10 a la 5ª células a cada plato. Después de utilizar un contador celular automatizado para estimar la densidad celular, mezcle bien pero suavemente la suspensión celular invirtiendo el tubo y añada aproximadamente siete veces 10 a la 5ª células a platos individuales de 35 milímetros con fondo de vidrio.

Deje que las células se adhieran durante 20 a 25 minutos a 28 grados celsius. Para cada transfección, agregue dos microgramos de ADN plasmídico a 0,1 mililitros de medio para insectos sin suero y sin FBS en un tubo microfuge estéril de 1,5 mililitros. En un tubo separado, mezcle ocho microlitros de reactivo de transfección con 0,1 mililitros de medio para insectos sin suero.

Luego, transfiera la solución al tubo que contiene el ADN plasmídico de interés. Vortexee suavemente e incube a temperatura ambiente durante 20 a 30 minutos. A continuación, diluya la mezcla de transfección del plásmido con 0,8 mililitros de medio para insectos sin suero, elevando el volumen total a un mililitro.

Retire cuidadosamente el medio del recipiente de vidrio que contiene las células adheridas. Incube las células a 28 grados Celsius durante cinco horas.

Después de cinco horas, retire y deseche el medio de transfección y lave suavemente las células con un mililitro de medio para insectos sin suero, teniendo cuidado de no desprender las células. Añada dos mililitros de medio fresco para células de insectos sin suero e incube a 28 grados Celsius durante 48 a 72 horas. De 48 a 72 horas después de la transfección de las células de insectos, lave las células una vez con un mililitro de medio insecto IPL-41 y luego cúbralas con dos mililitros de IPL-41 para su observación microscópica.

Agregue cuatro gotas del reactivo de tinción para células vivas Hoechst al medio e incube a 28 grados celsius durante 20 a 25 minutos. Coloque el platillo de 35 milímetros en el microscopio confocal de barrido láser autoencerrado. Aunque hay muchos platillos de vidrio disponibles comercialmente, es importante que se ajusten a la platina del microscopio y puede ser necesario determinar empíricamente qué material de vidrio es más compatible con la adhesión celular.

Ajuste el microscopio para las condiciones de observación de Hoechst, EGFP y mCherry. 359 nanómetros y 461 nanómetros para la excitación y emisión de Hoechst. 489 nanómetros y 510 nanómetros para la excitación y emisión de EGFP.

Y 580 nanómetros y 610 nanómetros para la excitación y emisión de mCherry. Utilizando un objetivo de 10X, realice un escaneo inicial para confirmar la expresión fluorescente. Después, cambie al modo de escaneo utilizando un objetivo de inmersión en agua de contraste de fases de 60X.

Ajuste la potencia del láser, la sensibilidad del detector, la velocidad de escaneo, la profundidad en el eje Z y el aumento digital para optimizar el contraste y la resolución de la imagen. Imagen las células con un aumento digital de 1,5X para obtener un total de 90X de amplificación. Guarde y exporte los datos brutos como archivos de imagen TIFF para su análisis posterior.

Las células Tni fueron transfectadas con los plásmidos indicados y la expresión de proteínas recombinantes se visualizó mediante microscopía de fluorescencia confocal. La transfección exitosa y la expresión de BtDrip1-EGFP recombinante son evidentes por la presencia de fluorescencia verde en la superficie celular. Las células transfectadas con la versión uno de BtDrip2-EGFP muestran fluorescencia verde en el interior, lo que indica la expresión intracelular de la versión uno de BtDrip2.

Asimismo, las células transfectadas con PIB DmSPR-mCherry o PIB PLA2G15-mCherry muestran fluorescencia roja, lo que indica la expresión de las quimeras respectivas. En las imágenes fusionadas, las áreas anaranjadas o amarillas indican la expresión de EGFP y mCherry, lo que sugiere que las proteínas están co-localizadas dentro de las mismas estructuras subcelulares. Una superposición de células doblemente transfectadas con PIB BtDrip1-EGFP y PIB DmSPR-mCherry sugiere la co-localización de BtDrip1-EGFP y DmSPR-mCherry en la superficie celular.

Las células doblemente transfectadas con la versión uno de BtDrip2-EGFP y PIB-DmSPR-mCherry muestran poca co-localización de las señales de fluorescencia verde y roja, lo que confirma la expresión intracelular de la versión uno de BtDrip2. En contraste, la co-expresión de PIB-BtDrip2 versión uno-EGFP y el marcador lisosomal PIB-PLA2G15-mCherry dio como resultado una superposición significativa de las señales fluorescentes verdes y rojas en el citoplasma. Esto sugiere fuertemente que BtDrip2 se dirige hacia los lisosomas intracelulares.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo expresar quimeras de proteínas fluorescentes dentro de células de insecto en cultivo. Este sistema ofrece una construcción rápida de vectores en la síntesis de proteínas, evita los desafíos de los sistemas de expresión basados en virus y proporciona un medio robusto para observar las proteínas de tráfico celular.