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Tome tubos de citómetro de flujo que contengan cepas mutantes y de tipo salvaje de Haemophilus influenzae, tipo f.
Pipetea un tampón que contiene proteínas bloqueadoras y vitronectina. Incubar.
Las proteínas de bloqueo reducen las interacciones no específicas en la superficie bacteriana, mientras que las moléculas de vitronectina se unen a la proteína H, una proteína de unión a la vitronectina, en superficies bacterianas de tipo salvaje. En la cepa mutante, la vitronectina no se une debido a la ausencia de proteína H.
centrífuga. Eliminar la vitronectina no unida y las proteínas bloqueantes.
Agregue un tampón que contenga anticuerpos anti-vitronectina primarios, que se unen específicamente a la vitronectina adherida a las superficies bacterianas de tipo salvaje.
A continuación, introduzca anticuerpos secundarios conjugados con fluoróforos, que se unen a los anticuerpos primarios de la vitronectina y facilitan la detección de la vitronectina.
centrífuga. Eliminar los anticuerpos secundarios no unidos. Vuelva a suspender las bacterias en el tampón.
Realice citometría de flujo para determinar la unión de la vitronectina a la superficie bacteriana.
Compare las señales de fluorescencia de cepas de tipo salvaje y mutantes. Un cambio en la señal de fluorescencia en bacterias de tipo salvaje confirma la unión de la vitronectina a la superficie bacteriana.
Para prepararse para la citometría de flujo, vuelva a suspender los gránulos bacterianos con 50 microlitros de tampón de bloqueo que contenga 250 vitronectina nanomolar. Luego, incube las muestras durante 1 hora a temperatura ambiente sin agitar. Después de la incubación, granular las bacterias por centrifugación a 3.500 x g durante 5 minutos. Luego lave los gránulos tres veces usando PBS y pasos de centrifugación similares.
Después del lavado, agregue 50 microlitros de anticuerpos policlonales primarios de vitronectina antihumana de oveja al gránulo bacteriano, en una dilución de 1 a 100 en PBS / BSA. Incube la suspensión durante 1 hora a temperatura ambiente. Luego, lave las bacterias tres veces con PBS para eliminar los anticuerpos no unidos.
A continuación, agregue 50 microlitros de PBS / BSA que contengan anticuerpos policlonales anti-oveja conjugados con isotiocianato de fluoresceína al gránulo. Incube a temperatura ambiente durante 1 hora en la oscuridad. Finalmente, después de tres pasos de lavado, resuspender el pellet bacteriano con 300 microlitros de PBS, y analizar por citometría de flujo.