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Comience con un plato con fondo de vidrio que contenga pupas de Drosophila transgénicas que lleven epitelio herido marcado con sus proteínas de la superficie celular que exhiben fluorescencia verde.
Las células inmunitarias de las pupas, o hemocitos, expresan fluoróforos verdes fotoconvertibles en el citoplasma y proteínas fluorescentes rojas en el núcleo, lo que facilita el seguimiento celular.
Las células heridas liberan quimioatrayentes, o moléculas inflamatorias, que atraen a los hemocitos al sitio herido.
La microscopía confocal revela el área herida rodeada de células epiteliales verdes.
Durante la curación, los hemocitos verdes con núcleos rojos cerca de la herida extienden las protuberancias de la membrana: filopodios y lamelipodios y migran hacia el área herida.
Con el tiempo, a medida que el quimioatrayente se difunde, los hemocitos distantes migran hacia la herida, creando una onda de células inmunitarias.
Iluminar la subpoblación de hemocitos migratorios con una longitud de onda de 405 nanómetros. Esto convierte irreversiblemente el fluoróforo fotoconvertible de los hemocitos de verde a rojo.
Estos hemocitos fotoconvertidos reparan el epitelio herido y se alejan del sitio de la herida, diferenciando los hemocitos fotoconvertidos de los hemocitos no fotoconvertidos y dilucidando la dinámica de las células inflamatorias.
Después de herir los márgenes de las alas de la pupila, transfiera rápidamente el plato con fondo de vidrio a un microscopio apropiado para obtener imágenes de lapso de tiempo. Luego, abra el software de captura de imágenes apropiado.
En el software, encienda los láseres apropiados y ajuste su potencia y compensación de ganancia para obtener suficiente señal fluorescente sin saturación de píxeles. Generalmente, la potencia láser más baja posible en el rango del 5% al 20% funciona mejor para minimizar el fotoblanqueo.
Concéntrese en todo el ala de la pupila con poco aumento o concéntrese en la herida con gran aumento para investigar la reparación de heridas. Para capturar tanto el epitelio reparador como el reclutamiento de células inflamatorias, primero, configure el microscopio para registrar una pila z utilizando el ajuste de enfoque fino en el panel de control. Exploración desde el epitelio herido hasta el espacio extracelular debajo, que contiene hemocitos migratorios.
A continuación, configure el software para registrar cortes en Z a través del ala de la pupila cada 3 micras o a intervalos aún más estrechos. Para imágenes de lapso de tiempo, grabe z-stacks al menos cada 30 segundos durante al menos una hora.
Cuando utilice las sondas fotoconvertibles para fotoconvertir y etiquetar selectivamente un subconjunto de células durante la obtención de imágenes, abra los módulos apropiados dentro del software de imágenes para realizar la fotoconversión y activar el láser de 405 nanómetros. Luego, seleccione las celdas que se convertirán en fotos dentro del software FRAP usando una herramienta de selección.
A continuación, establezca el curso de tiempo para la conversión de fotos en un solo fotograma de iteración y configure el láser de 405 nanómetros en 20% de potencia láser, luego haga clic en Iniciar el experimento para realizar la conversión de fotos. Una vez completado, salga del módulo FRAP y regrese a la pantalla de imágenes original. Allí, sintonice los láseres a los fluoróforos en uso y obtenga imágenes de las células fotoconvertidas y no fotoconvertidas mediante grabaciones de lapso de tiempo.