Un método mejorado de inmunoprecipitación de reticulación para la identificación eficiente del ARN unido a proteínas en testículos de ratón

Tome un testículo de ratón recién cosechado en un tampón frío. Retire la túnica albugínea, la capa de tejido fibroso.

Triturar los testículos para liberar túbulos seminíferos que contienen células germinales y de Sertoli.

Agregue tampón y someta los túbulos a la radiación UV para una reticulación irreversible del ARN con las proteínas asociadas, preservando las interacciones.

Centrifugar y desechar el sobrenadante.

Vuelva a suspender los túbulos en un tampón de lisis que contenga inhibidores de la ARNasa y la proteasa.

Sonicar el tejido, liberando complejos proteína-ARN y otros componentes intracelulares. Los inhibidores de la ARNasa y la proteasa inactivan las ARNasas y proteasas endógenas.

Agregue ADNasa para degradar el ADN. Introducir ARNasa diluida para la digestión parcial del ARN.

Centrifugar y transferir el sobrenadante que contiene complejos ARN-proteína a una solución de perlas magnéticas recubierta de anticuerpos con alta especificidad para la proteína de unión al ARN diana.

Aplique un campo magnético para separar los complejos proteína-ARN unidos a perlas. Deseche el sobrenadante.

Lavar con tampón. Separe magnéticamente los complejos proteína-ARN y utilícelos para un mayor análisis de la interacción ARN-proteína.

Para comenzar este procedimiento, recolecte alrededor de 100 miligramos de testículos de ratones de la edad apropiada para cada experimento de inmunoprecipitación. Coloque los pañuelos en PBS helado. Con unas pinzas de punta fina, retira suavemente la túnica albugínea. Agregue 3 mililitros de PBS helado a un molinillo de tejidos y use un mortero de vidrio suelto para triturar el tejido con una fuerza mecánica leve. A continuación, transfiera la suspensión de tejido a una placa de cultivo celular y agregue PBS helado de hasta 6 mililitros. Agite el plato rápidamente para que el líquido cubra el fondo del plato de manera uniforme.

Reticular la suspensión en hielo tres veces con 400 milijulios por centímetro cuadrado a 254 nanómetros. Asegúrese de mezclar la suspensión entre cada irradiación, luego, recoja la suspensión en un tubo cónico de 15 mililitros y centrifugue a 1.200 veces g y a 4 grados durante 5 minutos. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender el gránulo en 1 mililitro de PBS. Después de esto, transfiera la suspensión a un tubo de centrífuga de 1,5 mililitros. Centrifugar a 1.000 veces g y a 4 grados centígrados durante dos minutos y desechar el sobrenadante.

Primero, agregue 125 microlitros de perlas magnéticas de proteína A por muestra a un tubo de centrífuga nuevo. Coloque el tubo sobre el imán para separar las perlas de la solución. Después de 10 segundos, retire el sobrenadante y lave las perlas dos veces con 1 mililitro de tampón de lisis helado. Vuelva a suspender las perlas en 100 microlitros de tampón de lisis fría con 10 microgramos de anticuerpo eCLIP. Gire los tubos a temperatura ambiente durante 45 minutos, luego lave las perlas dos veces con 1 mililitro de tampón de lisis helado.

Para comenzar, vuelva a suspender los gránulos de tejido en 1 mililitro de tampón de lisis fría que contenga 22 microlitros de cóctel inhibidor de proteínas sin EDTA 50X y 11 microlitros de inhibidor de ARNasa. Siga lisando las muestras en hielo durante 15 minutos. Sonicate cada muestra se describe en el protocolo de texto. A continuación, agregue 4 microlitros de ADNasa a cada tubo y mezcle bien. Incube a 37 grados centígrados durante 10 minutos mientras agita a 1,200 RPM. Después de esto, agregue 10 microlitros de ARNasa diluida y mezcle bien. Incube a 37 grados centígrados durante 5 minutos mientras agita a 1,200 RPM.

Luego, centrifugar a 15.000 veces g y a 4 grados centígrados durante 20 minutos para limpiar el lisado. Recoge con cuidado el sobrenadante. Primero, agregue 1 mililitro de lisado a las perlas preparadas y gire las muestras a 4 grados Celsius durante dos horas o durante la noche. Después de esto, recoge las cuentas con el soporte magnético y desecha el sobrenadante. Lave las perlas dos veces con 900 microlitros de tampón con alto contenido de sal y luego lave las perlas dos veces con 900 microlitros de tampón de lavado.