Un método mejorado de inmunoprecipitación de reticulación para la identificación eficiente del ARN unido a proteínas en testículos de ratón

Tome un testículo de ratón recién cosechado en un tampón frío. Retire la túnica albugínea, la capa de tejido fibroso.

Triturar los testículos para liberar túbulos seminíferos que contienen células germinales y de Sertoli.

Agregue tampón y someta los túbulos a la radiación UV para una reticulación irreversible del ARN con las proteínas asociadas, preservando las interacciones.

Centrifugar y desechar el sobrenadante.

Vuelva a suspender los túbulos en un tampón de lisis que contenga inhibidores de la ARNasa y la proteasa.

Sonicar el tejido, liberando complejos proteína-ARN y otros componentes intracelulares. Los inhibidores de la ARNasa y la proteasa inactivan las ARNasas y proteasas endógenas.

Agregue ADNasa para degradar el ADN. Introducir ARNasa diluida para la digestión parcial del ARN.

Centrifugar y transferir el sobrenadante que contiene complejos ARN-proteína a una solución de perlas magnéticas recubierta de anticuerpos con alta especificidad para la proteína de unión al ARN diana.

Aplique un campo magnético para separar los complejos proteína-ARN unidos a perlas. Deseche el sobrenadante.

Lavar con tampón. Separe magnéticamente los complejos proteína-ARN y utilícelos para un ma