Análisis unicelular de Immunophenotype y producción de citoquinas en sangre periférica por citometría de masas

Este método puede ayudar a responder preguntas en el campo de la autoinmunidad, como la identificación de anomalías en la frecuencia celular y diferencias de función, como la producción de citocinas clave en el entorno de una enfermedad autoinmune. La principal ventaja de este método es que puede capturar un amplio repertorio de diferentes tipos de células y diferencias de función a partir de una muestra de sangre periférica fácilmente obtenible. Por lo general, las personas nuevas en este proceso pueden tener dificultades para determinar el momento de los pasos de procesamiento de la sangre, el diseño del panel de anticuerpos, el proceso de código de barras en sí y el análisis de datos de células individuales de alta dimensión.

Este enfoque de inmunología sistémica es particularmente adecuado para enfermedades autoinmunes como el LES, donde la desregulación inmune es generalizada y evidente en la sangre periférica. La demostración visual de este método es importante para aclarar el tiempo de los pasos y también para mostrar cómo se pueden codificar y agrupar múltiples muestras antes del análisis de citometría de masas. Para comenzar este procedimiento, coloque los tubos de poliestireno de fondo redondo etiquetados de cinco condiciones diferentes para el procesamiento de sangre completa en un estante.

A continuación, agregue un mililitro de 37 grados Celsius RPMI a cada tubo. A continuación, añada un mililitro de sangre entera a cada tubo y pipetee hacia arriba y hacia abajo varias veces para mezclar bien con RPMI. A continuación, añada 10 microlitros de ruxolitinib prediluido al tubo etiquetado como T six plus five R y mezcle bien.

Coloque el estante de tubos en la incubadora a 37 grados centígrados y comience a cronometrar la incubación. Para procesar la muestra T cero, pipetee todo el contenido del tubo T cero en un tubo cónico etiquetado que contenga 20 mililitros de tampón de lisado/fijación a 37 grados Celsius a una concentración de trabajo. Para optimizar la recuperación celular, enjuague el tubo con tampón de lisado/fijación y mezcle invirtiendo el tubo cónico.

Incubar las células a 37 grados centígrados durante 15 minutos para permitir la lisis y la fijación. A continuación, centrifugar las células a 500 veces G durante cinco minutos a temperatura ambiente. Después, decanta el sobrenadante y vuelve a suspender las células en un mililitro de PBS helado para romper el pellet.

Luego, llene el tubo cónico hasta un volumen de 15 mililitros con PBS. Posteriormente, centrifugar las células a 500 veces G durante cinco minutos a temperatura ambiente. Vuelva a suspender las células en un mililitro de CSM para romper el pellet.

Luego, transfiera la muestra a un tubo de microcentrífuga marcado para la tinción de anticuerpos. Usando un contador de células automatizado, cuente las células con una muestra de 10 microlitros. A continuación, centrifugar las células a 500 veces G durante cinco minutos a temperatura ambiente.

A continuación, aspirar el sobrenadante, dejando el pellet en unos 60 microlitros de residual. Mantenga este pellet en hielo hasta que las muestras de otras condiciones hayan completado el procesamiento. A T igual a 30 minutos, transfiera la rejilla de tubos a la campana de cultivo de tejidos.

Agregue 10 microlitros de R848 a 0,1 gramos por microlitro al tubo T six plus R848 y mezcle bien. A continuación, añade 10 microlitros de LPS a 0,01 microgramos por microlitro al tubo T six plus LPS y mezcla bien. Después, agregue cuatro microlitros de inhibidor del transporte de proteínas a los tubos marcados como T seis, T seis más cinco R y T seis más LPS y devuelva las muestras a la incubadora hasta que T sea igual a seis horas.

Mezcle bien las muestras con una pipeta P1000 cada dos horas. A T es igual a dos horas, agregue cuatro microlitros de cóctel de inhibidores del transporte de proteínas al tubo T six plus R848. Mezcle todas las muestras y devuelva la rejilla a la incubadora hasta que T sea igual a seis horas.

A T igual a cuatro horas, mezcle las muestras con una pipeta P1000 una vez más. A T igual a seis horas, procese los tubos de muestra de sangre T seis, T seis más LPS, T seis más R848 y T seis más cinco R como se describe para la muestra T cero. Luego, almacene los gránulos en el volumen residual de CSM a menos 80 grados Celsius para procesarlos más tarde.

Para codificar el código de barras de las células fijas lisadas, descongele lentamente las muestras del almacenamiento a menos 80 grados centígrados sobre hielo. Dilúya el tampón permanente de código de barras 10X con PBS de uno a 10 y haga suficiente tampón para tres mililitros por muestra. Llene un recipiente no estéril con CSM y otro con el tampón permanente de código de barras X.

A continuación, añada un mililitro de CSM helado a las muestras recién descongeladas, mezcle bien y transfiéralo a los respectivos tubos de polipropileno preetiquetados. Ahora, tome una muestra de 10 microlitros y cuente las células usando un contador de células automatizado. Normalice los recuentos de células en cada tubo de grupo eliminando el volumen del exceso de células.

A continuación, centrifugar las células a 600 veces G durante cinco minutos a temperatura ambiente. Vuelva a suspender las celdas en un mililitro de un tampón permanente de código de barras X con una pipeta multicanal y una centrífuga a 600 veces G durante cinco minutos a temperatura ambiente. Después, aspira el sobrenadante.

Alinee los tubos del grupo en una rejilla en el mismo orden que se indica en la clave del código de barras para que la muestra coincida con su código de barras. Añada 800 microlitros de un tampón permanente con código de barras X mediante pipeta multicanal a todas las muestras de los tubos del clúster sin tocar el pellet de celda para reducir la pérdida de células. Luego, deje a un lado la rejilla con los tubos del racimo.

Retire las tiras de tubo del kit de códigos de barras de paladio 20-plex a menos 20 grados centígrados y descongele a temperatura ambiente. Agregue 100 microlitros de un tampón permanente de código de barras X, mezcle bien y transfiera 120 microlitros de la mezcla de código de barras resuspendida a las muestras de celdas correspondientes en los tubos del clúster. Mezcle a fondo con una pipeta multicanal para que no haya contaminación cruzada entre las muestras con códigos de barras individuales.

Incube los tubos de racimo durante 30 minutos a temperatura ambiente para permitir que los códigos de barras etiqueten las células. Después de 30 minutos, centrifugue las muestras a 600 veces G durante cinco minutos a temperatura ambiente. Aspire el sobrenadante, luego vuelva a suspenderlos en un mililitro de CSM.

Posteriormente, centrifugar y volver a suspender en CSM nuevamente. A continuación, centrifugar a 600 veces G durante cinco minutos a temperatura ambiente y aspirar el sobrenadante. Con una sola pipeta y utilizando la misma punta, transfiera todos los gránulos de celdas en aproximadamente 70 a 80 microlitros de volumen residual a un tubo de poliestireno.

No expulse la punta de la pipeta. Deje a un lado la pipeta individual con esta punta. Con una pipeta multicanal y nuevas puntas, agregue 100 microlitros de CSM a cada tubo de clúster original para maximizar la recuperación celular.

Usando la pipeta única con la punta que se reservó, transfiera todos los gránulos celulares en 100 microlitros de volumen residual al mismo tubo de poliestireno. Agregue CSM para completar el tubo de poliestireno a unos tres mililitros. Cuente y registre el número de celda del conjunto de códigos de barras agrupados.

A continuación, centrifugar a 600 veces G durante cinco minutos a temperatura ambiente y aspirar el sobrenadante. Proceda a teñir las muestras con código de barras el mismo día. Este esquema muestra el flujo de trabajo para la estimulación y el procesamiento de las muestras de sangre periférica, incluida la asignación de alícuotas de muestras de sangre, el momento de la adición de agentes de estimulación, el cóctel de inhibidores del transporte de proteínas y los tiempos de incubación hasta la lisis y fijación de los glóbulos rojos.

La elección de los agentes estimulantes dependerá de las vías de señalización y citocinas a las que se dirige la evaluación. Después de la fijación y la lisis de los glóbulos rojos, las muestras individuales de células lisadas y fijas de un donante sano se codificaron con códigos de barras, se marcaron con 26 anticuerpos contra marcadores de superficie, se permeabilizaron y se tiñeron con 14 anticuerpos contra citocinas. Aquí se muestra la estrategia de compuerta limitada que representa la identificación de monocitos CD14 altos.

De izquierda a derecha, cada parcela 2D representada es un subconjunto de población de la población principal que se bloquea desde la parcela 2D inmediatamente a la izquierda. Utilizando monocitos CD14 altos como representativos en ocho subgrupos de células inmunitarias, se realizó un análisis de citometría de masas en muestras de sangre periférica de un donante sano en el tiempo cero sin estimulación y tras la estimulación con el agonista de TLR LPS y R848 y el activador de células T PMA ionomicina. Se muestra un ejemplo de la inducción de citocinas en monocitos CD14 altos y se representan citocinas seleccionadas con especificidad para el agente estimulante utilizado.

R848 induce selectivamente la subunidad IL-12p40 y MCP1 en monocitos CD14 altos, mientras que LPS no lo hace. Por el contrario, la ionomicina PMA no induce citocinas en los monocitos CD14 altos. Una vez dominado, las estimulaciones de la sangre se pueden realizar en aproximadamente siete horas y el paso del código de barras se puede realizar en solo una hora.

Al intentar este procedimiento, es importante tener en cuenta el momento de los pasos y planificar con anticipación en consecuencia. Una vez que haya implementado este procedimiento, puede considerar modificar las condiciones de estimulación sanguínea en el panel de citometría de masas para evaluar las respuestas de las células inmunitarias que son específicas de sus propios objetivos de investigación. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo obtener respuestas de citocinas de muestras de sangre completa y cómo agrupar varias muestras en un conjunto con código de barras para el análisis de citometría de masas.