Un método de inmunotinción múltiple que utiliza anticuerpos primarios de la misma especie huésped

Tome una sección suprarrenal fija y permeabilizada que comprende una corteza y una médula. Trátelo con un tampón ácido hirviendo, rompiendo los enlaces cruzados inducidos por la fijación para el desenmascaramiento del antígeno.

Bloquea los sitios de unión no específicos e introduce anticuerpos primarios que se unen a marcadores específicos de la corteza.

Agregue anticuerpos secundarios biotinilados dirigidos a los anticuerpos primarios y peroxidasas conjugadas con estreptavidina que se unen a la biotina.

Introduzca una tiramida marcada con fluoróforo y peróxido de hidrógeno.

Las peroxidasas inmovilizadas utilizan peróxido de hidrógeno para activar la tiramida, que se une a las proteínas cercanas, marcando la corteza.

A continuación, trate la sección con el tampón hirviendo para eliminar los anticuerpos unidos.

Introducir los mismos anticuerpos primarios generados por la especie huésped dirigidos a marcadores específicos de la médula y anticuerpos secundarios biotinilados.

Introduzca peroxidasas conjugadas con estreptavidina y una tiramida conjugada con fluoróforos diferente para marcar la médula.

La eliminación de los anticuerpos primarios específicos de la corteza inhibe la unión de anticuerpos secundarios reintroducidos, evitando la reactividad cruzada.

Aplique una tinción nuclear y realice imágenes para visualizar la corteza y la médula claramente teñidas, confirmando que no hay reactividad cruzada de anticuerpos.

Antes de teñir, desparafinar y rehidratar los portaobjetos fijados en formol e incluidos en parafina con inmersiones de cinco minutos en cada solución como se indica. Después de la segunda inmersión en agua destilada, coloque los portaobjetos en 275 mililitros de solución hirviendo de citrato de sodio en el fondo de una caja de puntas de pipeta con tapa, y coloque la caja en un microondas de 700 vatios al 70% de potencia durante ocho minutos.

Al final del tratamiento, abra la tapa y deje que la solución se enfríe a temperatura ambiente antes de lavar los portaobjetos con tres lavados de cinco minutos de PBST fresco en un frasco Coplin. Para bloquear cualquier sitio de unión inespecífico, después del último lavado, agite el exceso de PBST de cada portaobjetos y cubra los portaobjetos con un volumen suficiente de una solución de bloqueo adecuada.

Después de 30 minutos a temperatura ambiente en una cámara humidificada, agite el exceso de solución de bloqueo de cada portaobjetos y agregue 250 microlitros del primer anticuerpo primario de interés a cada muestra. Para evitar que las muestras se sequen, los portaobjetos pueden cubrirse con un trozo de película de parafina.

Después de una incubación nocturna a cuatro grados centígrados en la cámara humidificada, lave los portaobjetos tres veces con PBST fresco durante cinco minutos por lavado. Sacuda el exceso de PBST, luego, cubra rápidamente cada portaobjetos con 250 microlitros de una solución de anticuerpos secundarios adecuada para una incubación de una hora en la cámara humidificada a temperatura ambiente.

Al final de la incubación, lave los portaobjetos tres veces en PBST fresco como se ha demostrado, y agregue 250 microlitros de peroxidasa de rábano picante de estreptavidina recién preparada a cada portaobjetos. Después de 30 minutos a temperatura ambiente, lave los portaobjetos tres veces en PBST fresco, luego, sacuda el exceso de PBST y cubra cada portaobjetos con 250 microlitros de solución de tiramida fluoróforo recién preparada.

Un minuto después, sumerja los portaobjetos en PBST fresco, seguido de tres lavados de dos minutos en PBST fresco. Después del último lavado, aplique unas gotas de una solución de glicerol 1 a 1 a PBS en las secciones y verifique la presencia de una señal fluorescente mediante microscopía de fluorescencia.

Para eliminar el primer complejo de anticuerpos, coloque los portaobjetos marcados con anticuerpos en 275 mililitros de solución hirviendo de citrato de sodio durante al menos ocho minutos, como se ha demostrado. Al final del tratamiento, abra la tapa y deje que la solución se enfríe a temperatura ambiente, antes de lavar los portaobjetos tres veces con PBST durante cinco minutos por lavado.

Para teñir la segunda proteína diana de interés, después de demostrar el bloqueo de la unión inespecífica, etiquete cada muestra con 250 microlitros del segundo anticuerpo primario de interés a cuatro grados Celsius durante la noche. A la mañana siguiente, lave los portaobjetos tres veces durante cinco minutos en PBST fresco por lavado antes de cubrir cada portaobjetos con 250 microlitros de una solución de anticuerpos secundarios adecuada para una incubación de una hora a temperatura ambiente.

Al final de la incubación, lave los portaobjetos tres veces en PBST fresco como se ha demostrado, y agregue 250 microlitros de peroxidasa de rábano picante de estreptavidina recién preparada a cada portaobjetos. Para desarrollar la señal para la segunda proteína diana de interés después de tres lavados PBST, trate los portaobjetos con una tiramida conjugada con fluoróforos en un espectro fluorescente diferente.

Para detener el desarrollo de la señal de tiramida, sumerja los portaobjetos en PBST y luego tiña las muestras con un tinte nuclear apropiado.