Generación de neuronas simpáticas postganglionares a partir de células madre pluripotentes humanas

Tome una microplaca recubierta de matriz extracelular y agregue células madre pluripotentes humanas suspendidas en un medio de diferenciación.

El medio contiene moléculas de señalización que influyen en las vías de señalización celular, dirigiendo la diferenciación en células progenitoras neurales.

Introducir otro medio de diferenciación que contenga moléculas de señalización que induzcan la diferenciación en células de la cresta neural, o NCC, precursoras de células neuronales y no neuronales.

Agregue enzimas para alterar la matriz, disociando así las células.

Lave para neutralizar las enzimas, luego centrifugue y deseche el sobrenadante. Vuelva a suspender los NCC en un medio esferoide y transfiéralos a una microplaca.

Los factores de crecimiento del medio y las moléculas pequeñas inducen la formación de esferoides.

Suplemento con ácido retinoico, que promueve la diferenciación en neuronas progenitoras simpáticas.

Transfiera el esferoide a una microplaca recubierta de proteína de adhesión en un medio de maduración de neuronas simpáticas, lo que provoca la unión del esferoide.

Los factores de crecimiento neural y el ácido retinoico en el medio promueven la maduración en neuronas simpáticas postganglionares, que forman parte del sistema nervioso periférico y regulan los procesos involuntarios.

Un día antes de la inducción de la diferenciación, cubra el número apropiado de placas de seis pocillos con dos mililitros de matriz de membrana basal por pocillo y almacene las placas a cuatro grados Celsius durante la noche. A la mañana siguiente, caliente las placas a temperatura ambiente y lave el cultivo de células madre pluripotentes humanas listas para dividir dos veces con PBS fresco por lavado.

Después del segundo lavado, trate las células con siete mililitros de EDTA 0,5 milimolares durante 15 minutos en la incubadora de cultivo celular, antes de aspirar las células madre pluripotentes humanas flotantes y transferir las células recolectadas a un tubo de 50 mililitros.

Agregue un volumen igual de PBS al tubo para diluir el EDTA y recolecte las células por centrifugación. Vuelva a suspender el pellet en un mililitro de medio de diferenciación del día 01. Antes de agregar un volumen apropiado de medio para contar, diluya las células a una concentración de 1,25 x 10⁵ células por centímetro cuadrado en dos mililitros de medio de diferenciación por pocillo.

Aspire toda la solución de matriz de membrana basal de cada pocillo de la placa de seis pocillos previamente preparada. Luego, siembre 2 mililitros de células en cada pocillo y coloque la placa en la incubadora de cultivo celular. A la mañana siguiente, alimente las células con 3 mililitros de medio de diferenciación del día 01 por pocillo.

En el segundo día de diferenciación, alimente a las células con tres mililitros de medio de diferenciación del día dos a diez por pocillo. Luego, alimente las células cada dos días hasta el día 10. Para agregar las células de la cresta neural en esferoides, el día 10, lave las células con PBS y agregue dos mililitros de medio de disociación a cada pocillo. Después de 20 minutos en la incubadora de cultivo celular, transfiera las células flotantes a un tubo cónico de 50 mililitros y lleve el volumen de suspensión en el tubo a 50 mililitros con PBS fresco.

Recoja las células por centrifugación y vuelva a suspender el gránulo en un volumen suficiente de medio esferoide de día 10 a 14 para el recuento. Después de contar, diluya las células a una concentración de 5 x 10^{5 células} por 500 microlitros usando medio esferoide de día 10 a 14, y coloque 500 microlitros de células en cada pocillo de una placa de 24 pocillos de fijación ultrabaja. Luego devuelva las células a la incubadora de cultivos celulares.

Para inducir un cultivo esferoide mínimo, en el día 11 de cultivo, alimente los esferoides de la cresta neural con 500 microlitros adicionales de medio esferoide del día 10 a 14 por pocillo. El día 12, incline la placa para acumular los esferoides en un lado de la placa y aspire cuidadosamente la mayor cantidad de medio posible de cada pocillo sin aspirar esferoides. Luego, alimente los esferoides con un mililitro de medio esferoide de día 10 a 14 por pocillo.

Para inducir un cultivo de esferoides expandido el día 15, alimente a los esferoides con 1,5 mililitros de medio esferoide de los días 10 a 14 suplementado con 0,5 ácido retinoico micromolar por pocillo. Luego, devuelva los esferoides a la incubadora de cultivo celular.

Para la diferenciación de neuronas simpáticas en el día 14 o 28, incline la placa para acumular los esferoides en un lado de la placa y aspire cuidadosamente la mayor cantidad de medio posible. Alimente las células con un mililitro de medio neuronal simpático.

Para descomponer los agregados de esferoides grandes en esferoides más pequeños, agregue no más de un mililitro de medio por pocillo y pipetee los esferoides de cinco a 10 veces antes de dividirlos.

Y retire el exceso de fibronectina laminina de placas de 24 pocillos previamente preparadas. Divida la placa un mililitro de esferoides de cada pocillo en la placa de cultivo de esferoides de 24 pocillos entre cuatro pocillos separados de la placa de 24 pocillos recién recubierta. Agregue 250 microlitros de medio neuronal simpático fresco a cada pocillo y coloque la placa en la incubadora de cultivo celular. A la mañana siguiente, reemplace el medio en cada pocillo con un mililitro de medio de neurona simpática suplementado con ácido retinoico micromolar 0.125 y devuelva la placa a la incubadora de cultivo celular. Después del día 35, alimente las neuronas reemplazando cuidadosamente solo la mitad del medio existente en cada pocillo con medio fresco.