Conversión de células madre pluripotentes inducidas por humanos (IPSC) en neuronas motoras craneales y espinales funcionales usando vectores PiggyBac

La posibilidad de generar diferentes subtipos de neuronas motoras es particularmente relevante para modelar enfermedades modernas de las neuronas motoras como la esclerosis lateral amiotrófica. Este método permite la adquisición de poblaciones celulares que son altamente rígidas para las neuronas motoras con una identidad espinal o craneal en un corto período de tiempo y sin el paso de purificación. La generación de neuronas motoras humanas a partir de células madre pluripotentes inducidas o iPSC bajo una condición de cultivo simplificada puede facilitar la detección de fármacos para enfermedades de las neuronas motoras.

La expresión inducible del factor de transcripción de programación se puede utilizar para generar otros tipos de células como neuronal, músculo esquelético y células gliales desde un repositorio iPSC. Para la generación de líneas iPSC NIL y NIP, enjuague el cultivo humano de iPSC con PBS libre de calcio y magnesio antes de tratar las células con reactivo de disociación celular durante cinco a 10 minutos a 37 grados centígrados. Cuando las células hayan comenzado a desprenderse del recipiente de cultivo, utilice una pipeta P1000 para disociar manualmente las células de tres a cuatro veces.

Transfiera las células a un tubo de 15 mililitros y lleve el volumen final hasta 10 mililitros con PBS fresco sin calcio y magnesio para el recuento. Recoger una por 10 a las sextas células por centrifugación y resuspend el pellet en 100 microlitros de buffer R del kit de electroporación. Añadir 4,5 microgramos de ADN plasmático vectorial transponible y 0,5 microgramos del ADN plasmático de la transposasa piggyBac para la transfección.

Transfect con el sistema de electroporación celular de acuerdo con las instrucciones del fabricante con los parámetros indicados. Luego, siembra las células en el medio iPSC humano complementado con 10 inhibidores de ROCK micromolares Y-27632 en un plato recubierto de matriz de seis milímetros. Dos días después de la transfección, añadir 5 microgramos por mililitro de blasticidina al medio de cultivo manteniendo las células en el antibiótico durante al menos siete a 10 días para contraseleccionar las células que no han integrado los transgenes.

Al final de la incubación, mantener las células trans infectadas estables como una población mixta compuesta de células con diferentes números de transgenes y diferentes sitios de integración o aislar clones individuales. Preparar un plato adicional para permitir que la expresión efectiva de los transgenes sobre un microgramo por mililitro de inducción de doxiciclina sea evaluada por RT-PCR con imprimaciones específicas de transgenes para neurogenina-2 como se describió anteriormente. En esta etapa, las existencias de las nuevas líneas NIL y NIP iPSC también deben congelarse en medio de congelación para iPSC humanos.

Para la diferenciación de neuronas motoras, disociar los cultivos celulares trans infectados estables con reactivo de disociación como se demostró para permitir que las células se recojan en un tubo de 15 mililitros que contenga cinco volúmenes de DMEM/F12 medio. Después de la centrifugación, resuspender las células en medio iPSC humano complementado con inhibidor de ROCK micromolar para el recuento. Siembra las células en platos recubiertos con matriz a una densidad 6.25 por 10 las cuartas células por centímetro cuadrado.

Durante los próximos dos días, sustituya los sobrenadantes por un medio de diferenciación fresco complementado con doxiciclina. En el segundo día, cambiar el medio a medio neurobasal B27 suplementado con inhibidor de la gamma de la secretasa, inhibidor del receptor del factor de crecimiento endotelial vascular, y doxiciclina. En el quinto día, disociar las células como se demostró y resuspender las células separadas en cuatro mililitros de DMEM/F12 medio para el conteo.

El pipeteo es importante para una disociación completa de las células. Congelar una alícuota de los progenitores de la neurona motora en el medio de congelación celular de acuerdo con las instrucciones del fabricante y recoger el resto de las células por centrifugación. Resuspender el pellet en medio neuronal complementado con 10 inhibidores de ROCK micromolar.

Sembrar las células en soportes de microdesprendimiento recubiertos de poliornitina laminina con cubierta de polímero se desliza a una vez 10 a las quintas células por centímetro de densidad cuadrada. En el sexto día, reemplace cuidadosamente el medio con medio neuronal fresco sin inhibidor para el cultivo hasta el análisis aguas abajo sin separar las células de la superficie de soporte. Una expresión uniforme del factor de transcripción de unión a octamer del marcador de pluripotencia cuatro o OTC4 se puede observar en cultivos celulares diferenciadores en el día cero en ausencia de marcador neuronal pan clase específica de la neurona tres positividad beta-tubuulin TUJ1.

En el tercer día, una fuerte disminución en el número de células OCT4 positivas es evidente. Esto se refleja mediante la expresión de TUJ1 en un subconjunto de iPSC diferenciadores. En el día cinco, no se observa ninguna expresión de OCT4 en la población que muestra una expresión consistente de TUJ1 y una morfología neuronal adquirida.

Análisis de inmunomanchas siete días después de la replata de las células progenitoras de la neurona motora revela una expresión uniforme de TUJ1 y el marcador de neurona motora madura colina acetiltransferasa. Las neuronas derivadas de iPSC NIL muestran con éxito corrientes de sodio dependientes del voltaje y corrientes de potasio dependientes del voltaje. El 80% de las neuronas motoras derivadas de iPSC NIL sujetas en la modalidad de abrazadera actual son capaces de activar los trenes de pico cuando se inyectan con un pulso de corriente de más 60 picoamps o más.

La corriente mínima necesaria para provocar la cocción repetitiva en más del 50% de las células registradas es más de 40 picoamps con un umbral de pico de aproximadamente menos menos 38 milivoltios y una frecuencia de disparo promedio en más 40 picoamps de alrededor de ocho hercios, lo que sugiere que las neuronas del motor espinal derivadas de iPSC NIL exhiben propiedades funcionales típicas de las neuronas maduras. Las neuronas motoras espinales y craneales pueden derivarse de iPSC controlados o iPSC que llevan mutaciones patológicas y que estas células se pueden utilizar como modelos de tesis o para la detección de fármacos. Nuestro método se puede utilizar para ayudar a entender por qué diferentes unidades de neurona motora se ven afectadas diferencialmente por ELA.