Aislamiento de microglía de lesiones desmielinizantes del cerebro de ratón mediante clasificación de células activadas magnéticamente

Diseccionar lesiones desmielinizantes teñidas del cuerpo calloso de un cerebro de ratón.

Estas lesiones contienen microglía residente en el cerebro que expresa la integrina CD11b de la superficie celular.

Recoja el tejido y agregue una solución que contenga una enzima proteolítica y ADNasa.

La enzima degrada la matriz extracelular, mientras que la ADNasa degrada el ADN libre.

Agregue un tampón frío y filtre la suspensión a través de un colador para eliminar los grumos celulares.

Centrifugar, desechar el sobrenadante y volver a suspender las células granuladas en un medio de gradiente de densidad.

Cubra con tampón y centrífuga para recoger los desechos restantes en las capas superiores; las células intactas se asientan en la parte inferior.

Retire los residuos y vuelva a suspender las celdas en un tampón.

Agregue perlas magnéticas anti-CD11b para etiquetar la microglía.

Cargue las celdas en una columna que contenga esferas ferromagnéticas colocadas en el campo magnético del separador magnético.

Bajo el campo magnético externo, la microglía unida a las perlas se retiene en la columna mientras que las células no unidas fluyen.

Retire la columna del campo magnético. Agregue un tampón para eluir la microglía.

Comience microdiseccionando las lesiones marcadas con un tinte neutro alrededor del cuerpo calloso bajo un microscopio estereoscópico. Centrifugar el tejido disecado a 300 x g durante 30 segundos para recoger la muestra en el fondo del tubo. Precaliente la mezcla de enzimas 1 y la mezcla de enzimas 2 a 37 grados Celsius en una incubadora. Luego, agregue 1,950 microlitros de mezcla de enzimas precalentadas 1 a una muestra y digiera en una incubadora a 37 grados centígrados durante 5 minutos. Agregue 30 microlitros de mezcla de enzimas precalentada 2 y mezcle suavemente.

Después de la digestión, agregue 4 mililitros de PBS frío al tubo y agite suavemente. Centrifugar las muestras de tejido a 300 x g durante 10 minutos a 4 grados centígrados y aspirar el sobrenadante lenta y completamente. Vuelva a suspender el sedimento celular suavemente con 1.550 microlitros de PBS frío. Agregue 450 microlitros de la solución fría para eliminar los escombros y mézclelos bien.

Utilice una pipeta de 1000 microlitros para superponer la mezcla muy lenta y suavemente, con 2 mililitros de PBS frío. Centrifuga la mezcla y luego busca las 3 capas. Utilice una pipeta de 1000 microlitros para aspirar completamente las 2 capas superiores y llene el tubo hasta 5 mililitros con tampón de carga en frío. Invierta suavemente el tubo 3 veces.

A continuación, después de la centrifugación y aspiración del sobrenadante, vuelva a suspender el sedimento celular con 90 microlitros de tampón de carga y agregue 10 microlitros de perlas de CD11b. Mezclar bien e incubar durante 15 minutos a 4 grados centígrados. Después de la incubación, agregue 1 mililitro del tampón de carga y lave las células pipeteando suavemente el líquido hacia arriba y hacia abajo con una pipeta de 1000 microlitros.

Centrifugar las células a 300 x g durante 10 minutos a 4:00 grados centígrados y aspirar el sobrenadante por completo para eliminar las perlas sueltas. Vuelva a suspender las celdas en 500 microlitros del tampón de carga y coloque la columna MS con su separador para la selección positiva en el campo magnético. Enjuague la columna con 500 microlitros del tampón de carga para proteger las celdas y garantizar la eficiencia de la clasificación magnética según el protocolo del fabricante.

Aplique la suspensión celular en la columna MS y deseche el flujo que contiene las celdas sin etiquetar. Agregue 500 microlitros del tampón de carga para lavar la columna y retírelo del separador. Coloque la columna en un tubo de centrífuga de 15 mililitros y agregue 1 mililitro del tampón de carga en la columna. Finalmente, empuje el émbolo hacia la parte inferior de la columna para eliminar las celdas marcadas magnéticamente.