Registros electrofisiológicos de neuronas reprogramadas en un corte de cerebro de ratón

Tome un corte coronal de ratón modificado genéticamente inmovilizado en una cámara de registro perfundida con tampón oxigenado.

El corte contiene la región estriatal, que tiene interneuronas reprogramadas a partir de células precursoras de oligodendrocitos marcadas por un marcador de interneuronas y expresión de proteínas fluorescentes.

Ensamble una pipeta de registro que consta de un electrodo sumergido en una solución intracelular.

Identifique microscópicamente una interneurona fluorescente.

Mantenga una presión positiva en la pipeta y hágala avanzar hacia la interneurona objetivo, en contacto con la membrana.

Aplique presión negativa para formar un sello de alta resistencia.

Aplique pulsos de presión negativa para romper la membrana, estableciendo una configuración de toda la célula.

Mantener el potencial de membrana de la interneurona en un valor negativo constante.

Aplique breves corrientes incrementales, abriendo los canales iónicos y cambiando el potencial de membrana, desencadenando un potencial de acción.

Eventualmente, la membrana vuelve al potencial de reposo.

Observe estos cambios en el potencial de membrana en respuesta a la inyección actual, lo que indica una maduración neuronal y una reprogramación exitosa.

Después de transferir una sección de tejido a una cámara de registro para electrofisiología, monte la pipeta de vidrio en el electrodo de registro y bájela en la solución. Vuelva a verificar la resistencia del electrodo. Luego, acérquese lentamente a la celda reprogramada con la pipeta, manteniendo una ligera presión positiva en el electrodo para evitar obstruir la punta, y verifique que la celda sea GFP positiva antes de parchear.

Cuando la celda esté parcheada, mantenga la celda en pinza de corriente de menos 60 a menos 70 milivoltios e inyecte corrientes de 500 milisegundos de menos 20 a más 90 picoamperios con incrementos de 10 picoamperios para inducir potenciales de acción. Esto es indicativo de una maduración neuronal y una reprogramación exitosa.