ההפרדה של ה-DNA חד גדילי, פעמיים תקועים DNA ו-RNA מהקהילה ויראלי הסביבה באמצעות כרומטוגרפיה hydroxyapatite

סרטון זה מדגים פרוצדורה להפרדה של אשמורות ויראליות מעורבות על בסיס הרכב חומצות הגרעין שלהן. דבר זה מאפשר את חקר הגיוון הטקסונומי והפוטנציאל התפקודי של אשמורות ויראליות מורכבות. כאן נעשה שימוש בהידרוקסיאפטיט, צורה גבישית של פוספט סידן, להפרדה של חומצות גרעין.

ראשית, אורזים ומאזנים עמודת Hydroxyapatite, ולאחר מכן מעבירים דרכה חומצות גרעין ויראליות מופקות. האינטראקציה החשמלית בין יוני הסידן בעלי המטען החיובי של ה-hydroxyapatite לבין שלד הפוספט בעל המטען השלילי של תתי-הסוגים של חומצות הגרעין קושרת את חומצות הגרעין לעמודה. לאחר מכן, מועברים באופן רצופי DNA ו-RNA חד-גדיליים ו-DNA דו-גדילי באמצעות ריכוזים שונים של בופר פוספט. חומצות הגרעין שהתקבלו עוברות לאחר מכן להסמכה (desalting) וריכוז כהכנה לוויזואליזציה, כימות וזיהוי באמצעות ריצוף DNA. אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז מאשרת כי ניתן להפריד בין מיני חומצות הגרעין עם פחות מ-9% carryover.

כך, שיטה זו מאפשרת להעריך את הגיוון ואת הקיבולת התפקודית של קהילות ויראליות. שלום, שמי דג פרו, ואני עובד כעוזר מחקר במעבדתה של ד"ר שנון ויליאמסון במכון j Craig Venture. היום אציג בפניכם פרוצדורה להפרדת DNA גדיליเดียว, DNA גדיליים ו-RNA מתוך אוסף ויראלי סביבתי.

לשיטה זו ישנם יתרונות על פני שיטות קיימות, כגון טיפול בגרעין, המתמקד ב-DNA או ב-RNA. לכרומטוגרפיית הידרוקסיאפטיט יש את היכולת ללכוד את קהילת הנגיפים כולה. שיטה זו מאפשרת לנו לענות על מספר שאלות בתחום האקולוגיה של נגיפים.

לדוגמה, מהו המשלים הגנטי הכולל או המגוון של הקהילה הנגיפית? חשבנו על שיטה זו לראשונה כאשר רצינו לחקור את כל מקבצי הפלנקטון בנהר Rio ממפרץ צ'ספייק מבלי להקריב תת-קבוצה של החתימה הגנטית. את התמיסות הדרושות לניסוי זה יש להכין מראש בהתאם להוראות בפרוטוקול הכתוב המצורף, והן כוללות phosphate buffer בריכוז 0.12 molar, phosphate buffer בריכוז 0.20 molar, phosphate buffer בריכוז 0.40 molar, ופתרון פוספט בריכוז one molar.

בכל שלב ב-pH 6.8, וביום הניסוי, יש להביא את כל תשבילי הפוספט ואת ההידרוקסיאפטיט המהודר לשיווי משקל על ידי הנחתם באמבט מים בטמפרטורה של 60 °C. יש להתחיל את הפרוצדורה בהכנת עמודת ה-econo שתשמש להפרדת חומצות גרעין ויראליות. חברו ברז (stopcock) לקצה עמודת ה-econo וודאו שהוא סגור.

באמצעות פיפט, הוסיפו מים דה-יוניים לעמוד, לאחר מכן הצמידו את הפקק לחלקו העליון של העמוד והפכו אותו מספר פעמים כדי לשטוף אותו. שפכו את המים וחזרו על פעולת השטיפה הזו מספר פעמים. לאחר מכן, הסירו את הברז מהעמוד הכלכלי ועקרו אותו באוטוקלאב.

אין לעקר את ברז המעבר (stop cock) באוטוקלייב מכיוון שהוא עלול להימס. שטפו את ברז המעבר במים דה-יוניזציה, ולאחר מכן שוב באתנול 70%, והניחו לו להתייבש באוויר לאחר העיקור. החזירו את ברז המעבר למקומו וסגרו אותו.

בשלב הבא, בעבודה תחת מנדף, הוסיפו מיליליטר אחד של sigma coat לעמודה וכסו את זכוכית העמודה על ידי היפוכה בתנועה מסובבת כפי שמוצג כאן. ציפוי באמצעות sigma coat ימזער את היצמדותן של חומצות הגרעין לפני השטח של הזכוכית. במהלך ההפרדה, משטחי זכוכית בעלי מלח אחד כבר כוסו.

פתחו את הברז וסננו את הנוזל למבחנה קונית. לאחר מכן, כדי לחבר את העמוד למסבוב מים, השתמשו בשני תפסנים כדי להצמיד את העמוד למעמד מעגלי. חברו צינור סיליקון ממסבוב המים, כך שזרימת המים ממסבוב המים תהיה מלמטה למעלה.

כוון את הטמפרטורה ל-60 °C והפעל את הסירקולציה. למרות שבפועל, העמודה והצינורות יעטפו בחומר בידוד, כגון נייר אלומיניום או בידוד ספוגי לצינורות, שלב זה אינו מוצג כאן על מנת למזער את אובדן החום.

על מנת להמחיש את הפרוצדורה בצורה טובה יותר, סגרו את הברז. בעזרת פיפטור, הוסיפו 10 milliliters של מים סטריליים נקיים מ-RNA. פתחו את הברז ואפשרו למים להתנקז.

לאחר מכן, שטפו שוב לפי הוראות השטיפה השנייה. שטפו פעמיים עם 10 milliliters של בופר פוספט 0.12 molar סטרילי נטול RNA, ורוקנו את הנוזלים בין השטיפות. העמודה מוכנה כעת לכרומטוגרפיית הידרוקסיאפטיט.

וודאו שברז המעבר של עמודת ה-econ סגור. לאחר מכן, באמצעות פיפט סרולוגית סטרילית של 2 mL, הוסיפו לאט 2 mL של הידרוקסיאפטיט רהידרטרי שהוכן וסוספנדו לתחתית העמודה. החזירו את מכסה העמודה.

יש להמתין 30 דקות עד שההידרוקסיאפטיט ישקער תחת כוח הגרביטציה. שיטה זו דורשת תשומת לב לפרטים. עמודת ההידרוקסיאפטיט מעבדת את הדגימה בקצב של 0.25 עד 0.5 mils לדקה.

לכן חשוב מאוד להשגיח מקרוב על העמודה כדי למנוע את התייבשותה. לאחר 30 דקות, פתחו את הברז כדי לנקז את הבאפר למכל פסולת. סגרו את הברז והשליכו את נוזל הזרימה (flow through).

שלבו חומצות גרעיניות עם בופר פוספט 0.12 molar בנפח סופי של 500 µL והדגירו את התערובת בטמפרטורה של 60 °C למשך 10 דקות. פעולה זו תשיווי את החומצות הגרעיניות לטמפרטורה של העמוד ותשפר את ההפרדה בין סוגי החומצות הגרעיניות השונים על ידי הסרת מבנים שניוניים שעשויים להיות נוכחים. באמצעות פיפט סרולוגית של 2 mL, העבירו במהירות את תמיסת החומצה הגרעינית אל ה-hydroxy appetite, תוך הקפדה על אי-הפרעה לעמוד.

לאחר שכל 500 µL זרמו אל תוך העמודה, ניתן להוסיף כמות קטנה של phosphate buffer בריכוז 0.12 M לחלק העליון של העמודה כדי למנוע את התייבשותה. יש לאפשר לחומצות הגרעיניות להיקשר ל-hydroxy appetite למשך 30 דקות. לאחר דגירת ההיקשור, יש להציב מבחנה קונית של 15 mL תחת העמודה.

לאחר מכן, פתחו את הברז ואספו את דגימה הראשונית של 500 µL, המכילה DNA גולמי בשרשרת אחת. לאחר איסוף 500 µL, סגרו את הברז. לאחר מכן, הוסיפו שישה מיליליטר של phosphate buffer בריכוז 0.12 M להידרוקסיאפטיט, תוך הקפדה שלא להפריע לעמודה.

לאחר מכן, פתח את הברז והמשך לאסוף את התוצר העובר (flow through) המכיל DNA גדיל יחיד לאותו שפופרת של 15 מיליליטר מהשלב הקודם. לאחר איסוף של כשישה מיליליטרים, סגור את הברז. הוסף לשפופרת נפח שווה של תמיסת פנול כלורופורם איזואמיל אלכוהול, ערבב בעוצמה באמצעות וורטקס, ולאחר מכן סבב בצנטריפוגה ב-3,500 ×g למשך 15 דקות.

בעקבות הצנטריפוגציה, השפופרת תכיל שני שכבות. העבירו את השכבה המימית העליונה, המכילה את גדיל ה-DNA הבודד, לשפופרת חדשה של 15 milliliter, ואחסנו את הדגימה בטמפרטורת החדר. כדי להפיק ולטהר RNA מהעמודה, הוסיפו שש milliliters של phosphate buffer בריכוז 0.20 molar ואספו את נוזלי הזרימה (flow throughs) לתוך שפופרת חדשה של 15 milliliter. לאחר מכן, בצעו מיצוי פנול-כלורופורם.

עבור דגימת ה-DNA החד-גדילי, חזור על תהליך זה תוך שימוש ב-6 mL של בופר פוספיהרי 0.40 M כדי להשkia ולטהר DNA דו-גדילי מהעמודה. לבסוף, כדי להסיר מהעמודה כל שארית של DNA דו-גדילי, חזור על תהליך זה פעם נוספת.

בפעם זו השתמשו ב-6 mL של בופר פוספט 1.00 M כדי להסיר מלחים מדגימות החומצות הגרעיניות. העבירו 4 עד 5 mL מכל דגימה להתקן סינון צנטריפוגי Ultra 4 המצויד בממברנת אולטרה-סל עם סף חיתוך של 30,000 למשקל מולקולרי; רכזו את הדגימה לנפח של פחות מ-500 µL על ידי סיבוב ב-6,000 g בטמפרטורה של 30 °C למשך כחמש דקות ברוטור בזווית קבועה. לאחר השליכה של הנוזל שעבר את המסנן, הוסיפו את שארית הדגימות למסנן.

העלה את הנפח לארבעה עד חמישה מיליליטרים באמצעות RNAs free one XTE buffer. לאחר מכן, סבב שוב עד להשגת נפח מרוכז. כחמש דקות לאחר הסבב, הוסף ארבעה עד חמישה מיליליטרים של RNAs free one XTE buffer למסנן ורכז.

חזרו על שטיפה זו חמש פעמים נוספות כדי להסיר את המלחים לחלוטין מדגימות החומצות הגרעיניות. לאחר שהדגימות רוכזו והוסרו מהן המלחים לחלוטין, העבירו את שארית דגימות החומצות הגרעיניות לפראנל מיקרו-צנטריפוגה סטרילי בנפח 1.7 milliliter. השקיעו את החומצות הגרעיניות על ידי הוספה של sodium acetate בכמות של עשירית מהנפח, שני נפחים של 100%ethanol ומיקרוליטר אחד של glyco blue, תוך ערבוב טוב באמצעות vortexing centrifuge.

28,000 g בטמפרטורה של ארבעה מעלות צלזיוס למשך 60 דקות ב-Kent. יש לוודא שהמשקע אינו מופרע.

הוסיפו 300 µL של 70% ethanol, סובבו ב-28,000 ×g בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות, לאחר מכן ייבשו והמיסו מחדש כל פראקציה בנפח מתאים של TE buffer עבור RNA. ריכוזים שווים של חומצות גרעין נגיפיות: M 13 MP 18, single stranded DNA, MS2 single stranded RNA, F16 double stranded RNA ו-lambda double stranded DNA אוחדו, ולאחר מכן הופרדו באמצעות כרומטוגרפיה של hydroxyapatite כפי שמוצג בסרטון זה. ריכוזים שווים של M 13 MP 18, single stranded DNA, MS2 single stranded RNA, F16 double stranded RNA ו-lambda double stranded DNA אוחדו כפי שמוצג במסלול 6 והועלו לעמודת hydroxyapatite כפי שניתן לראות כאן.

DNA ו-RNA גדיליים בודדים ו-DNA דו-גדילי הופרשו באופן עצמאי מעמודת Hydroxyapatite באמצעות בופר פוספט בריכוזים של 0.12 molar, 0.18 molar, 0.40 molar ו-1.00 molar. סולם של 1 KB שימש לאישור גדלי הגנום. תוצאות אלו מעידות כי ניתן להשתמש בשיטה זו להפרדה מוצלחת של DNA גדילי בודד, DNA דו-גדילי ו-RNA, עם פחות מ-9% carryover משברים אחד לשני.

שיטה זו שימשה גם להפרדת חומצות גרעין שבודדו מקהילה ויראלית במפרץ צ'ספייק (Chesapeake Bay), כפי שמוצג כאן. DNA ו-RNA גדיליים בודדים ו-DNA דו-גדילי הופרדו באופן עצמאי באמצעות ריכוזי חוצץ פוספט של 0.12 molar, 0.20 molar ו-0.40 molar, או 1.00 molar בהתאמה. סולם DNA למסה גבוהה במסלול 1 וסולם 1 KB במסלול 2 שימשו לאישור חזותי של המשקל המולקולרי והמסה המקורבים של חומצות הגרעין, כפי שניתן לראות כאן; DNA דו-גדילי היה סוג חומצת הגרעין הדומיננטי שחולץ מהפלנקטון הוויראלי של מפרץ צ'ספייק. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיו בעלי הבנה טובה לגבי אופן הפרדת חומצות גרעין ממאסף ויראלי מעורב באמצעות כרומטוגרפיית הידרוקסיאפטיט.

שלב זה כולל את הכנת עמודת ההידרוקסאפטיט (Hydroxyapatite) וחומצות הגרעין, הפרדה ואלוציה של חומצות הגרעין באמצעות ריכוזים שונים של בופר פוספט והסמכה (desalting), וריכוז של חומצות הגרעין לאחר ההפרדה.