Bilaminar Co-cultivo de neuronas de rata primaria cortical y la glía

El objetivo de este procedimiento es cultivar neuronas primarias en presencia de una capa de glía que apoya su crecimiento. Estas neuronas pueden ser posteriormente aisladas como una población pura de neuronas para su análisis. Esto se logra cultivando primero las células gliales primarias.

El segundo paso es subcultivar las células gliales en una superficie, que se opondrá a las neuronas cultivadas. A continuación, las capas de células gliales neuronales se combinan en un sistema de cocultivo estable. En última instancia, el análisis citoquímico muestra el desarrollo de una capa pura de neuronas maduras.

Hola, mi nombre es Anna T y soy estudiante en el laboratorio Dr.Olympia Muci de la Universidad de Drexel. Aquí demostraremos cómo cultivar neuronas corticales en presencia de una capa de alimentación de glía. Esta es una técnica que fue desarrollada originalmente por Gary Banker y sus colegas y aprendida por el Dr. Muci y el laboratorio de Richard Miller en la Universidad de Chicago, que luego hemos adaptado a nuestras necesidades experimentales.

La principal ventaja de esta técnica sobre el cultivo neuronal puro es que los factores trofeo liberados por la glía apoyan el crecimiento y la diferenciación neuronal. Mientras que las neuronas pueden ser posteriormente aisladas como una población pura. Para prepararse para la disección, coloque herramientas estériles en etanol al 70%, agregue cuatro mililitros de disección fría, platos medianos a 60 milímetros, luego descongele los viajes al 2,5% y el ADN en hielo.

Después de decapitar a los cachorros de dos a cuatro días de edad, coloque las cabezas en un plato estéril de 100 milímetros para cada cabeza. Haz un corte en la línea media a través de la piel y tira de la piel hacia atrás para exponer el cráneo. Luego, use un par de tijeras curvas para hacer un corte en la línea media y dos cortes laterales a través del cráneo sin dañar el tejido cerebral que se encuentra debajo.

Después de esto, retire la parte superior del cráneo para exponer el cerebro, luego extraiga el cerebro y colóquelo en el plato de 60 milímetros con cuatro mililitros de disección fría, medio preparado anteriormente bajo un microscopio estereoscópico. Separe los hemisferios, retire el mesencéfalo y despegue las meninges. Recoja todas las cortezas cerebrales disecadas en un plato nuevo de 60 milímetros con medio de disección fresco y frío.

A continuación, pica el pañuelo con unas tijeras curvas. Posteriormente, transfiera el tejido de carne picada a un tubo estéril de 15 mililitros. Lleve el volumen a 4,5 mililitros con medio de disección frío y agregue 500 microlitros de 2,5% de entrada.

A continuación, envuelva el tubo en film y colóquelo en un baño de agua a 37 grados centígrados durante 15 minutos. Mientras tanto, mézclalo invirtiendo el tubo cada cinco minutos. A continuación, transfiera el tejido a un nuevo tubo de 15 mililitros y trate de minimizar el medio de disección que contiene tripesí que se transfiere al tubo.

Ahora lleve el volumen final a 4,8 mililitros con medio de disección fresco y agregue 200 microlitros de ADN hasta una concentración final de 60 microgramos por mililitro. A continuación, triture suavemente con una pipeta estéril de cinco mililitros unas 20 veces y añada 10 mililitros de medio de glioplacado. Espere de cuatro a cinco minutos para que los trozos grandes de tejido se asienten en el fondo.

Después de eso, transfiera el 80% superior de la suspensión de la celda a un tubo de 50 mililitros. A continuación, repita la duración del tejido con dos o tres mililitros adicionales de recubrimiento GL. Medio. Nuevamente, deje que el pañuelo se asiente.

Transfiera el 80% superior a la colección anterior posteriormente. Lleva el volumen total a 20 mililitros. A continuación, centrifugue durante 15 minutos a 280 veces G. Después de eso, aspire el supinato y vuelva a suspender la paleta de células en cinco a siete mililitros de medio de recubrimiento ggl.

A continuación, añada un plato adicional, medio a 10 mililitros por cada cerebro diseccionado y mezcle bien las células. Placa de 10 mililitros de suspensión de celdas en cada matraz cuadrado de 75 centímetros. A continuación, incubar el matraz de cultivo a 37 grados centígrados.

Cambie el medio de cultivo después de 24 a 48 horas, luego cada tres o cuatro días para preparar los cubreobjetos Therman. Los cubreobjetos de plástico utilizaron un cultivo secundario ggl y añadieron tres pequeñas gotas de cera derretida para plast alrededor de la circunferencia de cada thermadox lavado y autoclave. Las celdas se colocarán en este lado del thermadox.

Nuestro termon son insertos reutilizables de 60 milímetros hechos a mano con orificios perforados de unos 52 milímetros. Aunque también se pueden utilizar insertos de pocillos de cultivo disponibles en el mercado. El siguiente paso es lavar el ggl primario con PBS dos veces.

Agite cada matraz vigorosamente para eliminar las células sueltas. Cada matraz con ggl primario confluente proporcionará aproximadamente 10 millones de astroglia. Por lo tanto, a menudo usamos de dos a cuatro matraces por experimento.

A continuación, separe las celdas con 0.05%trips en EDTA. Combine las celdas de dos matraces en un tubo cónico de 50 mililitros y agregue una cantidad igual de medio de recubrimiento ggl, luego centrifugue durante 15 minutos a 280 veces la gravedad. Aspirar el supinato y disolver los gránulos de GL en unos pocos mililitros de recubrimiento GL. Medio.

Cuente las células con un hemocitómetro y diluya la suspensión celular según sea necesario. A continuación, coloque 500.000 células en placas de 60 milímetros o en cubreobjetos therman utilizando el medio de recubrimiento GL para la placa de termon. 600 microlitros de células en cada cubierta se deslizan gota a gota y, después de dos horas, voltee cada thermadox para sumergir las células en el medio de recubrimiento glial.

Si prepara placas de 60 milímetros de glía secundaria para los cubreobjetos neuronales, cambie el medio para que termine dos la noche anterior a la disección neuronal. En este procedimiento, para preparar los cubreobjetos de vidrio de 15 milímetros, agregue tres gotas pequeñas de para blasts derretidos. Cera alrededor de la circunferencia de cada cubreobjetos estériles para separar físicamente las capas de células y evitar que la capa se raspe.

La tapa desliza todos los platos de 60 milímetros con 0,5 miligramos por mililitro de polilisina durante dos horas o toda la noche. Luego lávelos con agua estéril dos o tres veces y déjelos secar por completo para preparar la disección neuronal. Eutanasia a una rata embarazada de 17 días.

Rocíelo con etanol al 70% y corte medialmente a través de la piel para exponer el útero. Después de eso, retire todos los fetos y colóquelos en un plato estéril de 100 milímetros. Después de diseccionar y decapitar rápidamente a cada feto, coloque cada cabeza en un plato de 60 milímetros con cuatro mililitros de medio de disección frío bajo el microscopio estereoscópico.

Use un par de pinzas para aislar las cortezas cerebrales tirando de la piel y el cráneo, extrayendo el cerebro, separando los hemisferios y extirpando el mesencéfalo y las meninges. Recoja todas las cortezas disecadas en un plato fresco de 60 milímetros con medio de disección frío. A continuación, pica el pañuelo con unas tijeras curvas en trozos de aproximadamente un milímetro.

Transfiera el pañuelo de carne picada a un tubo estéril de 15 mililitros. Lleve el volumen a 4,5 mililitros con medio de disección frío y agregue 500 microlitros de 2,5% en el tejido. A continuación.

Envuelva el tubo en una película y colóquelo en un baño de agua a 36 grados centígrados durante 15 minutos. Mientras tanto, mézclalo invirtiendo el tubo cada cinco minutos. Posteriormente, transfiera el tejido a un nuevo tubo de 50 mililitros y trate de minimizar los disparos, que contienen medio de disección, que se transfieren al tubo.

Lleve el volumen a 4,8 mililitros con medio de disección fresco y agregue 200 microlitros de D Ns a una concentración final de 60 microgramos por mililitro. A continuación, triturar unas 10 veces con una pipeta estéril de cinco o dos mililitros. Repita este paso según sea necesario.

Usando una pipeta de pasta pulida al fuego para disociar la mayor parte del tejido, deje que los trozos restantes de tejido se asienten en el fondo durante cuatro o cinco minutos. A continuación, retira la suspensión unicelular superior dejando atrás los trozos de tejido asentados. Transfiéralo a un nuevo tubo con un volumen igual de medio de recubrimiento neuronal y mézclelos suavemente.

A continuación, cuente las células con un hemocitómetro y colóquelas en cubrebocas de 15 milímetros como unas 35.000 células en 200 microlitros o en placas de 60 milímetros como aproximadamente 1 millón de células en tres mililitros. Incubar las células a 36,5 grados centígrados durante tres o cuatro horas después de la incubación. Combine la capa neuronal y el ggl secundario para las neuronas en placas de 60 milímetros.

Lave las células con DMEM tibio. Cambie el medio a cuatro mililitros de N dos medios y agregue un termon con ggl a cada plato. Con el GL mirando hacia las neuronas para los cubreobjetos neuronales, transfiera de tres a cinco cubreobjetos a cada placa de 60 milímetros de ggl secundario con las neuronas hacia abajo 24 horas después de la siembra de las neuronas, agregue 10 micromolares de citosina Beta D araba azi a cada placa para evitar la proliferación de la glía que se muestra aquí como ejemplo de neuronas de la neuroglía por cocultivo laminar.

Cinco horas después del enchapado, los procesos continúan alargándose en esta etapa. A continuación, se muestra un ejemplo de neuronas del cocultivo de neuroglia bi lanar 12 días después de la siembra. En esta etapa, los axones y nitas extendidos de las células son claramente visibles.

A medida que las neuronas maduran, los ABA dendríticos se vuelven más elaborados y desarrollan contactos sinápticos aproximadamente dos o tres semanas después de la colocación de placas. Muchas espinas dendríticas son visibles como se muestra en esta figura. Al realizar esta técnica, es importante trabajar con rapidez y mantener la esterilidad de cada reactivo es la falta de antibióticos en nuestro cultivo.

Los medios hacen que las células sean muy susceptibles a la contaminación.