Name: Etiquetado de las células madre con Ferumoxytol, uno de nanopartículas de hierro aprobada por la FDA de óxido (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 5 s
Description: Aprende a etiquetar células madre con ferumoxytol, nanopartículas de óxido de hierro aprobadas por la FDA, para visualización mediante resonancia magnética. Este método permite el seguimiento no invasivo de injertos celulares in vivo.

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Este trabajo fue apoyado por una subvención del Instituto Nacional de Artritis y Enfermedades Musculoesqueléticas y de la piel: 3R01AR054458-02S2.

1. Día 1 1) Las células Plate <ol><li> Placa hMSC en un matraz T75 en una confluencia del 80% por lo menos 18-24 horas antes de la etiqueta. Consulte la Tabla 1 para la instrucción de las embarcaciones alternativa. </li></ol> 2. Día 2 2) Prepare una solución de etiquetado. Esta preparación etiqueta de un (1) T75 matraz a 80% de confluencia con una concentración de 400 mg Fe / ml. Consulte la Tabla 1 para la instrucción de las embarcaciones alternativa. <ol><li> Crear una solución (solución 1) mediante la mezcla de 1 ml de medio libre de suero y 93,1 l de ferumoxytol (stock: 30 mg / ml) en un tubo cónico de 15 ml. </li><li> Crear una segunda solución (solución 2) mediante la mezcla de 1 ml de medio libre de suero y 7 l de sulfato de protamina (stock: 10 mg / ml) en un tubo de 15 ml segunda cónica. </li><li> Permita que cada solución reposar por 5 minutos. </li><li> Agregar las soluciones 1 y 2 juntos. Mezclar cuidadosamente la solución de un nuevo etiquetado. Permita que la solución reposar por 5 minutos para permitir USPIO pro-complejos de sulfato de histamina a la forma. </li><li> Añadir 5 ml de medio libre de suero a la mezcla de 2 ml de SPIO / solución de sulfato de protamina para un volumen final de 7 ml. </li></ol> 3) Preparación de las células de etiquetado <ol><li> Aspirar los medios de comunicación de las células. </li><li> Lave suavemente las células una vez con 3.2 ml de pre-calentado Mg / Ca libre de D-PBS o medio libre de suero para limpiarla de las proteínas del suero residual y otros medios de comunicación o de los componentes que puedan perjudicar la absorción del agente de contraste y etiquetado de eficiencia. Aspirar el líquido de enjuague. </li></ol> 4) las células de etiquetas <ol><li> Agregue el total de 7 ml de solución de etiquetado para las células. </li><li> Células de lugar en una incubadora (37 ° C / 5% CO 2) y permitir que las células se incuban en la solución de etiquetado durante 4 horas. </li><li> Añadir 700 l de FCS a la solución de etiquetado de las células para lograr una concentración final de suero de 10%. Suero se añade a restablecer el ambiente enriquecido de la que las células están acostumbrados, y para ayudar a minimizing muerte de las células que podrían resultar de un cambio abrupto a la exposición de 24 horas a un medio ambiente libre de suero. </li><li> Permitir que las células se incuban con la solución de etiquetado por un período adicional de 20 horas. </li></ol> 3. Día 3 5) Preparar las células marcadas <ol><li> Aspirar la solución de etiquetado de las células. </li><li> Enjuague suavemente las células con 2-3 ml de pre-calentado Mg / Ca libre de D-PBS. Aspirar el PBS. Es importante la utilización de Mg / Ca PBS libre como el Mg y Ca perjudicará a la eficiencia de la tripsina en el siguiente paso. </li><li> Añadir 2 ml de pre-calentado tripsina 0,05% a las células y la inclinación de la botella de ida y vuelta para asegurar toda la superficie del recipiente se cubre con una fina capa de tripsina. Colocar las células en una incubadora (37 ° C / 5% CO 2) y permitir que las células en reposo durante 5-7 minutos o hasta que las células comienzan a desprenderse de la placa. Puede que sea necesario para confirmar la separación bajo el microscopio. Golpee suavemente los lados del frasco si es necesario para facilitar el desprendimiento de la superficie celular. </li><li> Agregar 4 ml de pre-calentado medio completo en el matraz para neutralizar la tripsina. Enjuague suavemente el frasco con la pipeta la tripsina / media / solución de células de arriba a abajo varias veces. Recopilar toda la solución en un tubo cónico de 15 ml. Centrifugar la solución de células a 400 RCF durante 5 minutos. </li><li> Con cuidado aspirar el sobrenadante sin perturbar el sedimento celular. Resuspender las células en 5 ml de los medios de comunicación (que contiene suero o suero libre). Centrifugar la solución de células a 400 RCF durante 5 minutos. </li><li> Repita el lavado de células descritas en el paso 5.5. En total, las células se lavan tres veces para eliminar el agente residual, sin contraste en los medios de comunicación y en la superficie de las células. </li><li> Recuento de células en este punto para alcanzar el recuento de células más precisa, como las células se pierden durante el lavado anterior. Realizar una prueba de viabilidad de las células. Las células están listas para su posterior análisis y la aplicación o experimental. La RM puede llevarse a cabo con T1-W y T2-w parámetros, porque a pesar de ferumoxytol es un agente de contraste T2-w, ferumoxytol también exhibe efectos T1. Representante T2-w parámetros de resonancia magnética que se puede utilizar para la imagen ferumoxytol células marcadas son: secuencias FSE o SE_Multislice con un TR de 2000-2500 ms y un TE de 60 a 80 ms. Para adquirir una imagen T1-w, disminuya el valor de un TE o una secuencia FSE SE_Multislice o utilizar una secuencia GRE con una alta y baja TR TE. La figura 4 muestra un potencial de aplicación in vivo de imágenes etiquetadas de células madre. </li></ol> 4. Los resultados representativos: Células marcadas demostrar un efecto significativo contraste oscuro o negativo en la T2 de RM y un efecto de contraste brillo o positivo en la T1 de RM (Figura 2). Longitudinal de imágenes de RM y las pruebas de viabilidad a cabo 5 días después de etiquetado demostró que no había señal de RM y un impacto significativo sobre la viabilidad en comparación con los controles de etiqueta (datos no mostrados). jove_content "&gt; Etiquetada posteriormente las células madre pueden diferenciarse en varios tipos de células o inyectado por vía intravenosa en la investigación in vivo. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3482/3482fig1.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Esquema de la línea de tiempo para el etiquetado de las células madre con nanopartículas de óxido de hierro, ferumoxytol. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3482/3482fig2.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Imágenes de RM sagital de las secciones transversales tubos eppendorf thrrough con células de un pellet de células. A) Sin etiquetar los controles. B) Las células marcadas T2 demostrando un importante efecto negativo o agente de contraste en T2 FSE o SE_Multislice de imagen y un efecto del agente de contraste T1 o positivo en la secuencia T1 GRE. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3482/3482fig3.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Sagital secciones transversales de los tubos eppendorf con células en células pelpermite. Tan sólo 10.000 células ferumoxytol etiqueta se puede detectar a través de T2-w RM. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3482/3482fig4.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. RM de visualización ferumoxytol marcado con células madre inyectadas en murino ventrículos cerebrales. A) Axial, MR imagen de Barin murino sin la inyección de USPIO marcado con células madre. B) axial, C) coronal, y D) imágenes sagitales MR representa el efecto T2, contraste negativo de USPIO marcado con células madre (flechas blancas) se inyecta en el cerebro murino. <img alt="Tabla 1" src="/files/ftp_upload/3482/3482table1.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Tabla 1"> Tabla 1. Cantidad adaptaciones para el etiquetado de las células en los vasos alternativa.

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<li>Nedopil, A. J., Mandrussow, L. G., Daldrup-Link, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implantation+of+Ferumoxides+Labeled+Human+Mesenchymal+Stem+Cells+in+Cartilage+Defects%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Implantation of Ferumoxides Labeled Human Mesenchymal Stem Cells in Cartilage Defects.</a> J. Vis. Exp. (38), e1793-e1793 (2010).</li>
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<li>Babic, M., Horak, D., Trchova, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poly%28L-lysine%29-modified+iron+oxide+nanoparticles+for+stem+cell+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjug+Chem%22%5BJournal%5D)">Poly(L-lysine)-modified iron oxide nanoparticles for stem cell labeling.</a> Bioconjug Chem. 19, 740-750 (2008).</li>
<li>Golovko, D. M., T, H. enning, Bauer, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerated+stem+cell+labeling+with+ferucarbotran+and+protamine%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+Radiol%22%5BJournal%5D)">Accelerated stem cell labeling with ferucarbotran and protamine.</a> Eur. Radiol. 20, 640-648 (2010).</li>
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</ol>

Todos los colaboradores de este estudio no ofrece revelaciones.

La mejora de la eficacia de engraftments de células madre es fundamental para el avance de la medicina regenerativa. Una técnica de visualización no invasiva de las células madre in vivo aumenta considerablemente nuestra capacidad de entender los mecanismos que conducen a los resultados de éxito del injerto. Etiquetado magnética para la visualización de la RM, tales como el procedimiento que hemos demostrado, permite el seguimiento en vivo de las células madre con la RM. Marcadas magnéticamente las cél...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios (opcional) </td></tr><tr><td> D-MEM glucosa alta </td><td> Sigma </td><td> D5648 </td><td> O mediano plazo otra base para la línea deseada de células madre para ser utilizado </td></tr><tr><td> D-PBS (Ca + +, Mg + + libre) </td><td> GIBCO </td><td> 14190-144 </td><td></td></tr><tr><td> Tripsina-EDTA al 0,05% </td><td> Invitrogen </td><td> 25300-120 </td><td></td></tr><tr><td> De suero fetal bovino (FBS) </td><td> Hyclone </td><td> SH30071.03 </td><td></td></tr><tr><td> Ferumoxytol (Feraheme) </td><td> AMAG </td><td> 59338-0775-01 </td><td></td></tr><tr><td> Sulfato de protamina </td><td> APP Pharm. </td><td> 22930 </td><td></td></tr>
</tbody>
</table>

etiquetado de las células madre con ferumoxytol, uno de nanopartículas de hierro aprobada por la fda de óxido

Labeling Stem Cells with Ferumoxytol, an FDA-Approved Iron Oxide Nanoparticle

Terapias con células madre basado en ofrecer un potencial significativo para el campo de la medicina regenerativa. Sin embargo, aún queda mucho por entender sobre la cinética en vivo de las células trasplantadas. Un método no invasivo para monitorizar repetidamente trasplantado células madre in vivo que permiten a los investigadores a monitorear directamente los trasplantes de células madre y la identificación de los resultados del injerto con o sin éxito. Una amplia gama de células madre sigue siendo investigado por un sinnúmero de aplicaciones. Este protocolo se centra en tres poblaciones diferentes de células madre: embrionarias de riñón humano 293 (HEK293) las células, las células madre mesenquimales (hMSC) y células madre pluripotentes inducidas (iPS). HEK 293 células derivadas de células embrionarias de riñón en un cultivo con adenovirus 5 esquilada de ADN. Estas células se utilizan ampliamente en la investigación, ya que son de fácil cultivo, crecen rápido y son transfectadas con facilidad. hMSCs se encuentran en la médula ósea de adultos. Estas células can se replican como células indiferenciadas, manteniendo multipotencia o el potencial de diferenciarse en un número limitado de destinos celulares. hMSCs puede diferenciar a los linajes de tejidos mesenquimales, incluyendo los osteoblastos, adipocitos, condrocitos, tendones, músculos, y el estroma de médula ósea. Las células iPS se reprograman genéticamente células adultas que han sido modificadas para expresar los genes y factores similares a las propiedades de la definición de las células madre embrionarias. Estas células son pluripotentes, es decir tienen la capacidad de diferenciarse en todos los linajes de células 1. Ambos hMSCs y las células iPS han demostrado la capacidad regenerativa del tejido in vivo. La resonancia magnética (RM) junto con el uso de óxido de hierro superparamagnético (SPIO) etiquetas de nanopartículas de células han demostrado su eficacia en el seguimiento in vivo de células madre debido a la resolución anatómica microscópica cerca, un análisis de sangre mayor vida media que permite imágenes longitudinal y la alta SENSIBILIDADy para la detección de células proporcionada por imágenes de RM de las nanopartículas SPIO 2-4. Además, la RM con el uso de SPIOs es clínicamente traducible. SPIOs se componen de un núcleo de óxido de hierro con una capa superficial de dextrano, carboxidextrano o almidón que sirve para contener el núcleo de hierro biorreactivo de componentes del plasma. Estos agentes locales crear inhomogeneidades del campo magnético que conducen a una disminución de la señal en imágenes potenciadas en T2 MR 5. Por desgracia, SPIOs ya no se fabrican. De segunda generación, ultra SPIOs (USPIO), sin embargo, ofrecer una alternativa viable. Ferumoxytol (FerahemeTM) es un USPIO compone de un núcleo de magnetita no estequiométrica rodeado por una capa carboxymethylether sorbitol poliglucosa. El tamaño coloidal, las partículas de 17-30 nm ferumoxytol es determinado por la dispersión de luz. El peso molecular es de 750 kDa, y la capacidad de relajación constante en el campo 2T RM es 58,609 MM-1 seg-1 fuerza 4. Ferumoxytol fue recientemente aprobado por la FDA unas un suplemento de hierro para el tratamiento de la deficiencia de hierro en pacientes con insuficiencia renal 6. Nuestro grupo ha aplicado este agente en un &quot;off label&quot; uso para aplicaciones de etiquetado de la célula. Nuestra técnica demuestra el etiquetado eficiente de las células madre con ferumoxytol que conduce a importantes efectos de la señal de RM de las células marcadas en las imágenes de RM. Esta técnica puede ser aplicada para la monitorización no invasiva de las terapias de células madre en la configuración pre-clínicos y clínicos.

Se describe una técnica para el etiquetado y el seguimiento de las células madre aprobados por la FDA, superparamagnéticas de óxido de hierro (SPIO), ferumoxytol (Feraheme). Esta técnica de imagen celular que utiliza la resonancia magnética (RM) para la visualización, es fácilmente accesible para su seguimiento a largo plazo y el diagnóstico de engraftments células madre con o sin éxito en los pacientes.

Etiquetado de las células madre con Ferumoxytol, uno de nanopartículas de hierro aprobada por la FDA de óxido

Las terapias basadas en células madre ofrecen un potencial significativo para el campo de la medicina regenerativa. Sin embargo, aún queda mucho por comprender respecto al comportamiento in vivo...

En esta técnica, en ciencia traslacional las células se marcan utilizando un óxido de hierro superparamagnético ultrapequeño aprobado por la FDA llamado ferumoxitol. Comience con células madre mesenquimales humanas sembradas al 80 % de confluencia, luego transfecte el agente de contraste ferumoxitol en medio sin suero para marcar las células. A continuación, continúe con la recolección y enumeración de las CMMh marcadas para su uso experimental.En última instancia, los resultados de la imagen por resonancia magnética pueden mostrar un contraste negativo significativo o un efecto T2 proveniente de células marcadas con U-S-P-I-O. Bienvenido al laboratorio DDR link del Programa de Imagen Molecular de Stanford. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia el seguimiento in vivo de implantes de células madre mediante la visualización directa por imágenes por resonancia magnética no invasiva.La principal ventaja de esta técnica frente a técnicas existentes como la marcación con SPIOs es que el USPIO es la única nanopartícula de óxido de hierro aprobada por la FD que está disponible y que puede utilizarse para la marcación celular mediante un uso no autorizado. En un tubo cónico d

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Para la evaluación de nuevas terapias con células madre es importante no invasiva vía las células inyectadas en vivo. Este video le mostrará cómo etiquetar células madre mesenquimales humanas embrionarias y con los agentes de contraste basados ​​en óxido de hierro en vivo para su posterior RM en vivo.

Etiquetado y hESCs hMSCs con nanopartículas de óxido de hierro para no invasivo en el seguimiento in vivo mediante RM

Este video muestra las técnicas para el etiquetado de las células madre embrionarias y células madre mesenquimales con tintes fluorescentes. Esta técnica se puede utilizar para un seguimiento in vivo de las células madre trasplantadas con técnicas de imagen óptico y de las correlaciones histopatológico con microscopía de fluorescencia.

Etiquetado de las células madre con tintes fluorescentes para la detección no invasiva con imágenes ópticas

En este vídeo, se muestra como etiqueta de células madre embrionarias humanas (células madre) con cloruro de manganeso...

En el etiquetado in vitro de células estaminales embrionarias humanas de Resonancia Magnética

Objetivo de la presentación es mostrar un método altamente reproducible para generar la matriz asociada implantes de células madre en los defectos del cartílago, que puede ser visualizado con RM. Las células madre son etiquetados con aprobación de la FDA Ferumoxides, mezclado con agarosa, se implantan en los defectos del cartílago y la imagen con un escáner de MR 7T.

Implantación de Ferumoxides Etiquetada células madre mesenquimales humanas en los defectos del cartílago

En este artículo se describe una secuencia optimizada de eventos para obtener imágenes multimodal de los injertos celulares en el cerebro de los roedores por medio de: (i) en la bioluminiscencia in vivo y la resonancia magnética, y (ii) el análisis post mortem histológico. La combinación de estas modalidades de imágenes en un solo animal permite la evaluación del injerto celular con alta resolución, sensibilidad y especificidad.

Imagen multimodal de implante de células madre en el sistema nervioso central de ratones

La administración celular dirigida es útil en una variedad de aplicaciones biomédicas.  El objetivo de este protocolo es utilizar nanopartículas superparamagnéticas de óxido de hierro (SPION) para marcar células y, por lo tanto, permitir enfoques de orientación de células magnéticas para un alto grado de control sobre la entrega y localización de células.

Etiquetado Celular y Orientación con superparamagnético nanopartículas de óxido de hierro

Se presenta un protocolo para la síntesis y cationización de magnetoferritina dopada con cobalto, así como un método para magnetizar rápidamente células madre con magnetoferritina catiónica.

Síntesis de cationizada Magnetoferritin para la magnetización ultra-rápido de las células

Este manuscrito describe la entrega eficiente, no viral de miR a las células endoteliales por un vector de PEI / MNP y su magnetización. Por lo tanto, además de la modificación genética, este enfoque permite la orientación magnética de las células y de detección de MRI. La técnica se puede utilizar para mejorar las características de los productos de células terapéuticas.

Preparación y<em&gt; In Vitro</em&gt; Caracterización de Magnetized miR-modificado células endoteliales

Aquí se presenta un protocolo para la entrega y seguimiento de células madre mesenquimales no invasivas (MSC) en un modelo de ratón de lesión cerebral traumática. Las nanopartículas de óxido de hierro superparamagnético se emplean como una sonda de resonancia magnética (RM) para el etiquetado de MSC y el seguimiento in vivo no invasivo después de la administración intranasal mediante RMN en tiempo real.

Seguimiento de células madre mesenquimales con etiqueta de óxido de hierro superparamagnético mediante RMN después de la entrega intranasal en un modelo de murino de lesión cerebral traumática

Las nanopartículas de óxido de hierro se sintetizan a través de un procedimiento de gel sol noaqueoso y están recubiertas con moléculas cortas aniónicas o polímero. El uso de magnetometría para monitorear la incorporación y biotransformaciones de nanopartículas magnéticas dentro de células madre humanas se demuestra utilizando un magnetómetro de muestra vibratoria (VSM).

Uso de magnetometría para monitorear la incorporación celular y la posterior biodegradación de nanopartículas de óxido de hierro sintetizadas químicamente

El contenido de hidroperóxido lipídico representa el indicador más comúnmente utilizado de la muerte celular ferroptótica. Este artículo demuestra el análisis paso a paso de la citometría de flujo del contenido de hidroperóxido lipídico en las células tras la inducción de ferroptosis.

Revelando el fenotipo ferroptótico del meduloblastoma

Aprende a etiquetar células madre con ferumoxytol, nanopartículas de óxido de hierro aprobadas por la FDA, para visualización mediante resonancia magnética. Este método permite el seguimiento no invasivo de injertos celulares in vivo.

Etiquetado de las células madre con Ferumoxytol, uno de nanopartículas de hierro aprobada por la FDA de óxido

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