Músculo Esquelético dimorfismo de género de Proteómica

El objetivo general de este procedimiento es determinar la especificidad de género de las diferencias en los perfiles del proteoma del músculo esquelético. Esto se logra primero picando y homogeneizando completamente los tejidos oculares del bíceps braquial de ratones machos y hembras para extraer la mayoría de las proteínas. A continuación, se aplica la muestra a una tira de gel IEF, y se separan las proteínas en función de su punto isoeléctrico, seguido de una página SDS, separación en la segunda dimensión según el tamaño, tras la tinción y la imagen de los geles, se comparan los perfiles proteómicos de las muestras de músculo masculino y femenino y se extirpan las manchas con diferencias significativas de abundancia entre los dos sexos.

Finalmente, las proteínas de los tapones de gel se digieren con tripsina. Los péptidos resultantes se extraen del gel y se someten a cromatografía nanolíquida, análisis de espectrometría de masas para su identificación. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestren la expresión diferencial de proteínas en dos o más condiciones experimentales a través de electroforesis en gel bidimensional y proteómica basada en espectrometría de masas.

Aunque este método puede proporcionar información sobre la especificidad del género muscular, también se puede aplicar a otras células, tejidos, órganos o fluidos en diferentes estados fisiológicos. La Dra. Kalina Diva, directora técnica del Centro de Proteómica del Smith College, demostrará el procedimiento. Después de aislar, limpiar y picar el músculo esquelético del ratón a 45 microlitros de extracción, pergrama tampón de tejido, consulte el protocolo escrito para esta y todas las demás recetas de tampón usando un mortero motorizado, homogeneice el tejido siete veces durante 15 segundos cada una a cuatro grados centígrados con dos minutos de enfriamiento en hielo entre cada homogeneización.

Centrifugar las muestras a 15.800 Gs durante 30 minutos a cuatro grados centígrados. Guarde el supernat y mida su volumen. Deseche el pellet para precipitar las proteínas en tres volúmenes de hielo.

Acetona de grado reactivo frío por volumen de sobrenadante. Agite los tubos durante 15 segundos, luego centrifugue a 15, 800 Gs durante 10 segundos para formar gránulos. Deseche el supernat y vuelva a suspender los gránulos y el tampón de extracción con el mortero motorizado y las varillas agitadoras de polipropileno precipiten las proteínas por segunda vez agregando tres volúmenes adicionales de acetona.

Después de volver a suspender el pellet y el tampón de extracción, determine la concentración de proteína y/o almacene las muestras a menos 20 grados centígrados. Para realizar el enfoque isoeléctrico de las proteínas, retire una tira IPG lista del congelador a menos 20 grados centígrados y deje que se equilibre a temperatura ambiente durante 10 a 15 minutos. Agite la muestra y pipetee de 600 a 800 microgramos de proteína en línea recta en el borde posterior de un canal en la bandeja de rehidratación de muestras, dejando aproximadamente un centímetro en cada extremo.

Con unas pinzas, retire la cubierta de plástico de la tira de IPG, asegurándose de manipular solo los extremos de la tira y evitando cualquier contacto con el gel. Observe el extremo marcado positivamente de la tira y colóquelo en el lado izquierdo de la bandeja. Coloque la tira de gel de IPG hacia abajo encima de la muestra.

Evita atrapar burbujas debajo. Deja que se rehidrate durante una hora. Superponga la tira con 2,5 mililitros de aceite mineral.

Cubra la bandeja con una tapa y deje que se rehidrate durante la noche. Al día siguiente, a temperatura ambiente, coloque una mecha de papel en ambos extremos del canal comercial de enfoque y humedezca cada uno con 10 microlitros de agua miliporosa. Retire la tira de IPG y sujétela verticalmente durante unos 10 segundos.

Para drenar el aceite, seca el respaldo de plástico con una toallita Kim. Coloque la tira de gel de IPG con el extremo básico hacia la izquierda. En la bandeja de enfoque, cubra la tira con 2,5 mililitros de aceite mineral.

Coloque la bandeja en la celda IEF proteica y programe un protocolo de tres pasos a una temperatura de celda predeterminada de 20 grados Celsius, una corriente máxima de 50 microamperios por tira y sin tiempo de rehidratación. Una vez completado el programa, transfiera el sitio de gel de la tira a una bandeja de equilibrio de 11 centímetros. Agregue cuatro mililitros de tampón de reducción al canal y equilibre la tira durante 10 minutos con una agitación suave.

Retire el tampón de reducción y agregue cuatro mililitros de tampón de alquilación al canal y equilibre la tira agitando durante 10 minutos más. Enjuague la tira de IPG sumergiéndola brevemente en un búfer en ejecución XSDS. A continuación, coloque la tira con el lado del gel hacia arriba sobre la placa posterior de un criterio de 11 centímetros.

Gel de poliacrilamida prefabricado 10,5 a 14%tris H-C-L-S-D-S y empuje suavemente para que entre en contacto completo con el gel SDS. Asegúrese de que no haya burbujas atrapadas entre las dos superficies de gel. Superponga la tira de IPG con un mililitro de solución agro fundida y deje que se solidifique durante cinco minutos.

A continuación, cargue cinco microlitros de marcador de proteína en el sencillo. Bien haga funcionar el gel en el tampón SDS a 200 voltios a temperatura ambiente, o a cuatro grados centígrados. Cuando el frente del tinte llegue al fondo del gel, retíralo del molde de plástico y tíñelo toda la noche agitándolo suavemente en Kumasi Brilliant blue.

Agite el gel en una solución dos veces durante tres horas cada una y retenga dos durante la noche. Guarde el gel en ácido acético al 7% para su análisis. Después de obtener imágenes del gel, realizar un análisis comparativo de los patrones de manchas entre los geles y cortar las manchas de interés a 200 microlitros de solución de retención en el vórtice de los tapones de gel, e incubar las muestras a temperatura ambiente durante 30 minutos con agitación.

A continuación, retire y deseche con cuidado la solución y repita. Añadir 30 microlitros de tampón reductor recién preparado a los tubos que contienen los tapones de gel e incubar a 60 grados centígrados durante 10 minutos. Deje que las muestras se enfríen.

A continuación, retire y deseche el tampón. Agregue 30 microlitros de tampón de alquilación e incube las muestras en la oscuridad a temperatura ambiente Durante una hora, retire y deseche el tampón de alquilación. Lave los tapones de gel añadiendo 200 microlitros de solución de retención a cada tubo e incube las muestras a 37 grados centígrados durante 15 minutos.

Retire y deseche la solución de retención y repita el lavado. A continuación, añade 50 microlitros de aceto nitrilo a los tapones de gel e incuba durante 10 minutos a temperatura ambiente para que se sequen. A continuación, retire con cuidado el aceto nitrilo y repita los trozos de gel.

Debe verse blanco y pequeño. Deje que las piezas de gel se sequen en un concentrador durante 10 minutos. Hinche las piezas de gel añadiendo 10 microlitros de solución de tripin activada.

Incubar a temperatura ambiente durante 15 minutos. Agregue 25 microlitros de tampón de digestión a los tubos. Incubar las muestras a temperatura ambiente durante la noche con agitación, sonicar las muestras durante 10 minutos y girarlas antes de transferir el sobrenadante a un tubo nuevo.

Para extraer aún más los péptidos, agregue 10 microlitros de ácido fórmico al 0,1% a los tapones e incube durante cinco minutos a temperatura ambiente con agitación sonicada las muestras durante 10 minutos. Recoge el sobrenadante y combínalo con el sobrenadante previamente guardado. A continuación, las proteínas pueden desalinizarse y prepararse para la espectrometría de masas acoplada a HPLC, se extrajo el músculo esquelético masculino y femenino sin ejercitar y se separó en un mapa bidimensional.

Una vez visualizado el primer nivel del proteoma comparativo muscular mediante imágenes digitales de alta resolución, se detectaron alrededor de 800 puntos de proteínas en cada uno, como se ve aquí. Utilizando el mapa del proteoma masculino como línea de base, está claro que hay numerosas manchas que cambian en abundancia en el proteoma femenino: las manchas que aumentaron más o igual a dos veces en las hembras están marcadas en rojo, y las que disminuyeron más o igual a dos veces están marcadas en azul. Las identidades de las manchas de proteínas que cambian más del doble hacia arriba o hacia abajo y son estadísticamente significativas con un N de cinco ratones se determinan mediante análisis de secuencia de aminoácidos utilizando cromatografía líquida por espectrometría de masas acoplada.

En este gráfico, el eje x representa a los ratones hembra antes del ejercicio, y el eje Y representa un solo grupo de punto de tiempo de cero horas. Los resultados muestran que las mujeres muestran una disminución abundante en el metabolismo energético del azúcar, las enzimas, y en las isoformas de la enzima creatina quinasa, un sistema de suministro de energía diferente en los músculos. Tanto los humanos como los animales muestran niveles más altos de CK sérica masculina en reposo y después del ejercicio, pero los niveles séricos de CK no se correlacionan necesariamente con la cantidad de miofibrilar.

Este dimorfismo de género en la abundancia celular de CK en el músculo bíceps braquial es un hallazgo novedoso y puede responder a los niveles séricos de CK fisiológicamente diferentes. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como la inmunotransferencia cuantitativa para verificar los resultados. Después de ver este video, deberíamos tener una buena comprensión de cómo preparar y separar muestras para el perfil diferencial del proteoma.