Identificación y caracterización de la glicosilación de proteínas específicas de uso de endo-y exoglicosidasas

El objetivo general del siguiente experimento es ilustrar el uso del glicosato para la desglicosilación enzimática y el análisis de la glicosilación ligada a N y O en una glicoproteína modelo. Esto se logra tratando una glicoproteína con PGA's F o con la mezcla de desglicosilación de proteínas. Además, la mezcla de desglicosilación de proteínas se complementó con una mezcla de exo glicomasa adicional, que a veces ayuda a eliminar azúcares que de otro modo serían resistentes.

Ilustramos este método utilizando un modelo de gonadotropina coriónica humana recombinante de glicoproteína beta, o HCG beta, seguido de una tinción con azul de Kumasi y un método de tinción específico de azúcar. Pro Q Emerald 300 se utilizan para analizar el D glicosilado. Se obtienen los resultados de la muestra de HCG beta, que muestran que HCG beta está heterogéneamente glicosilada y contiene múltiples formas de glico, basándose en las diferencias en la migración de proteínas con y sin tratamiento con glicosato y la disminución de la señal en la tinción de ProQ a medida que los glicanos se eliminan sucesivamente.

La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como el análisis por espectrometría de masas, es que es sencilla, utiliza equipos de laboratorio comunes y es buena para el biólogo glicológico novato. Este método puede responder preguntas clave en el campo de la gliconucleosis, como por ejemplo si mi proteína glicosilada. Para comenzar la desglicosilación enzimática, descongele los tampones suministrados del kit de desglicosilación de proteínas.

Mezcle bien los tubos y manténgalos a temperatura ambiente. Coloque los viales que contienen enzima en hielo, disuelva el contenido del vial de HCG beta en 600 microlitros de agua destilada y manténgalo en hielo. Después de preparar un mililitro de un tampón XG siete diluyendo el caldo 10 x en agua destilada, use 25 microlitros para diluir 0,5 microlitros de PGA's f.

Prepare la mezcla de exo glicosato combinando dos microlitros, cada uno de los cuatro exo glicoenfermedades. A continuación, agregue HCG beta y 10 x tampón desnaturalizante de glicoproteínas a siete tubos de PCR numerados como se indica en el protocolo escrito, tape los tubos y mezcle suavemente la desnaturalización de las proteínas en el termociclador incubando 10 minutos a 94 grados Celsius, seguido de una retención de cuatro grados Celsius Después de quitar los tubos de la centrífuga del termociclador para eliminar cualquier condensación visible en cada tubo de reacción, Agregue los reactivos restantes de acuerdo con el protocolo escrito. Cierre los tubos de PCR con tapones nuevos.

Luego mezcle los tubos golpeando suavemente cuatro veces después de girar el contenido, coloque los tubos en el termociclador e incube a 37 grados centígrados durante cuatro horas. A continuación, enfríe las muestras a cuatro grados centígrados. Para configurar la página SDS, prepare un búfer de carga de SDS nuevo tres veces menor.

Con DTT, agregue 12.5 microlitros del tampón de carga SDS reductor preparado de tres x a cada muestra, cierre los tubos con tapas nuevas y golpee suavemente los tubos para mezclar. Incubar los tubos en un termociclador a 94 grados centígrados durante cinco minutos, y luego enfriar a cuatro grados centígrados Después de la carga de incubación, 30 microlitros de cada muestra y 10 microlitros del marcador de proteínas en un gel de triglicina al 10 al 20%. Guardando el resto de cada muestra.

Electro el gel a 130 voltios hasta que el frente D esté cerca de la parte inferior del gel. Cuando el gel haya terminado de correr, retira el gel del yeso y colócalo en una pequeña caja de plástico con suficiente tinte azul kumasi para cubrir la mancha de gel. El gel durante una hora con agitación suave Después de que el gel se manche.

Lavar tres veces durante 30 minutos. En 50 mililitros de solución de retención, grabe las imágenes con un transluminador de luz blanca o un escáner. Alternativamente, el gel se puede secar entre láminas de celofán.

En un cuadro, ejecute el resto de cada muestra y un marcador de proteína en un gel de triglicina del 10 al 20% mientras el gel está funcionando. Disuelva el reactivo esmeralda ProQ con DMF y prepare las soluciones de fijación, lavado y oxidación para la mancha siguiendo el manual del producto proporcionado con el kit. Cuando se complete la electroforesis, retire el gel del yeso y colóquelo en una caja de plástico.

Fije el gel agregando 100 mililitros de la solución fija preparada. Deje el gel toda la noche a temperatura ambiente con una agitación suave al día siguiente. Lave el gel con 100 mililitros de la solución de lavado preparada durante 10 a 20 minutos a temperatura ambiente con agitación suave, repitiendo el lavado una segunda vez con solución de lavado fresca.

A continuación, oxidar los carbohidratos incubando el gel con agitación suave durante 30 minutos en 25 mililitros de la solución oxidante preparada, seguir la incubación con dos lavados adicionales mientras se lava el gel. Prepare una mancha fresca ProQ emerald 300 añadiendo 500 microlitros de la solución reactiva ProQ Emerald 300 a 25 mililitros de tampón para tinción provisto en el kit. Tiña el gel incubando en la mancha preparada en condiciones oscuras con una agitación suave durante 90 a 120 minutos después de la tinción con gel.

Repita los dos pasos de lavado como se describió anteriormente. A continuación, grabe las imágenes con un iluminador trans UV a 300 nanómetros. Como paso final, compara las imágenes del gel teñido kumasi con el gel tinte esmeralda ProQ.

Los cambios en la migración de proteínas después de la desglicosilación enzimática se pueden ver cuando se compara la muestra de control con el tratamiento F de PGA. Para eliminar los n glicanos y con el tratamiento de mezcla de desglicosilación para eliminar los glicanos n y O, no se observa una mayor reducción del tamaño después de la digestión con glicosado adicional. Además de un cambio en la masa, las bandas se vuelven más afiladas a medida que se eliminan los glicanos.

Una banda que corre por debajo del marcador de 17 kilodalton probablemente representa el polipéptido beta HCG completamente desglicosilado. Los carriles cinco a siete muestran las bandas correspondientes al Glyco. Otras bandas pueden derivar de una desglicosilación incompleta o de múltiples proteínas no identificadas presentes en la muestra de HCG beta.

El reactivo verde esmeralda oxida y tiñe todos los glicanos presentes en una molécula de proteína. Por lo tanto, la intensidad de la señal disminuye a medida que la HCG beta se glicosila enzimáticamente. La señal residual en los carriles tres y cuatro indica la presencia de motivos de glicanos, que son resistentes a las enzimas utilizadas.

El glicosato adicional se utiliza en el carril cuatro. Retira algunos residuos de azúcar adicionales. La migración de proteínas es la misma, pero se puede observar una ligera reducción de la intensidad en la tinción.

Los restos de azúcar resistentes no estaban presentes en todas las especies de proteínas. Algunas bandas no fueron detectadas por el verde esmeralda, lo que indica que estaban ampliamente desglicosiladas. Los datos adicionales apoyan la conclusión de que la HCG beta está glicosilada heterogéneamente. La banda inferior en el carril dos es tenue en la imagen verde esmeralda.

Si bien la banda superior en el carril dos es brillante, lo que indica que muchos grupos GLYCAN todavía están presentes, estos datos respaldan la conclusión de que la HCG beta recombinante expresada en células de ratón contiene múltiples formas de glico, debido a la heterogeneidad inherente de la glicosilación. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la espectrometría de masas, para responder a preguntas adicionales como, ¿cuál es la tasa de ocupación? ¿Cuál es el grado de glicosilación o cuál es la estructura fina de los glicanos?

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo usar el glicosilato para la desglicosilación enzimática y el análisis de los glicanos ligados a NNO. Sobre las glicoproteínas. La elección de la detección puede ser difícil porque las regiones de tinción de proteínas solo son útiles si la desglicosilación da lugar a un cambio significativo en la masa molecular de otras proteínas.

Hemos visto migraciones anormales después de la desglicosilación y hemos encontrado que cualquier cambio en la migración es evidencia de que la proteína ha sido desglicosilada.