Name: Identificación y caracterización de la glicosilación de proteínas específicas de uso de endo-y exoglicosidasas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-12-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 54 s
Description: Aprende a identificar glicosilación en proteínas usando endo- y exoglicosidasas con HCG beta como modelo. Este método enzimático permite analizar glucanos N- y O-unidos mediante SDS-PAGE y tinciones específicas.

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<html> 1. Deglicosilación enzimática <ol><li> Use tubos de PCR para minimizar la pérdida de agua por evaporación. Etiqueta de un conjunto de tubos de 1 a 7. </li><li> Descongele el tampón 10X G7, el buffer de la glicoproteína 10 veces desnaturalización, y el 10% de NP-40 y golpee suavemente los tubos para mezclar el contenido. Mantener a temperatura ambiente. </li><li> Colocar los viales que contienen enzimas en el hielo. Trate de minimizar el deshielo / congelación de los ciclos. </li><li> Disolver el contenido del vial hCGβ (150 mg) en 600 l de dH 2 O y mantener en hielo. </li><li> Prepare 1 ml de 1X buffer del G-7 mediante la dilución de las acciones 10 veces en dH 2 O. </li><li> Diluir 0,5 l de PNGase F en 25 l de amortiguación del G7 1X y mantener en hielo. </li><li> Prepare la mezcla exoglycosidase (mezcla de EG) mediante la combinación de 2 l cada uno de α-N-acetilgalactosaminidasa, fucosidasa α1-2, galactosidasa β1-3, y α1-3, 6 galactosidasa. </li><li> Establecer los tubos de PCR, como se indica: </li></ol>ak &quot;&gt; <table border="1"><tbody><tr><td> Tubo / de la muestra # </td><td> 1 </td><td> 2 </td><td> 3 </td><td> 4 </td><td> 5 </td><td> 6 </td><td> 7 </td></tr><tr><td> hCGβ (0.25mg/ml) </td><td> 9μl </td><td> 9μl </td><td> 9μl </td><td> 9μl </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> Inhibidores de la glucoproteína 10X Buffer desnaturalización </td><td> 1μl </td><td> 1μl </td><td> 1μl </td><td> 1μl </td><td> 1μl </td><td> 1μl </td><td> 1μl </td></tr><tr><td> dH 2 O </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> 9μl </td><td> 9μl </td><td> 9μl </td></tr></tbody></table><ol start="9"><li> Tape los tubos, mezclar suavemente y colocar en eltermociclador, cierre la tapa y desnaturalizar las proteínas mediante la incubación de 10 minutos a 94 ° C, seguido de un 4 º C mantener (con tubos de PCR en un termociclador en gran medida evita la evaporación en las muestras de pequeño volumen). </li><li> Retire los tubos del termociclador y se centrifuga para eliminar la condensación visible. </li><li> Añadir los siguientes reactivos como se indica: </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td> Muestra # </td><td> 1 </td><td> 2 </td><td> 3 </td><td> 4 </td><td> 5 </td><td> 6 </td><td> 7 </td></tr><tr><td> 10% de NP-40 </td><td> 2.5μl </td><td> 2.5μl </td><td> 2.5μl </td><td> 2.5μl </td><td> 2.5μl </td><td> 2.5μl </td><td> 2.5μl </td></tr><tr><td> Buffer 10X G7 </td><td> 2.5μl </td><td> 2.5μl </td><td> 2.5μl </td><td> 2.5μl </td><td> 2.5μl </td><td> 2,5 y mu; L </td><td> 2.5μl </td></tr><tr><td> PNGase F 1:50 dil. </td><td> - </td><td> 2μl </td><td> - </td><td> - </td><td> 2μl </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> Deglicosilación Mix </td><td> - </td><td> - </td><td> 2μl </td><td> 2μl </td><td> - </td><td> 2μl </td><td> 2μl </td></tr><tr><td> Mezcla de EG </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> 2μl </td><td> - </td><td> - </td><td> 2μl </td></tr><tr><td> dH 2 O </td><td> 10μl </td><td> 8μl </td><td> 8μl </td><td> 6μl </td><td> 8μl </td><td> 8μl </td><td> 6μl </td></tr><tr><td> Vol total de reacción. </td><td> 25 μ l </td><td> 25 μ l </td><td> 25 μ l </td><td> 25 μ l &lt;/ Td&gt; <td> 25 μ l </td><td> 25 μ l </td><td> 25 μ l </td></tr></tbody></table><ol start="12"><li> Cerrar los tubos de PCR con tapas nuevas (deseche las que se utilizan, ya que no se ajustan correctamente después de un ciclo de incubación). </li><li> Mezcle los tubos golpeando suavemente 4 veces y luego girar el contenido hacia abajo. </li><li> Colocar los tubos en el termociclador e incubar a 37 ° C durante 4 horas y enfriar las muestras a 4 ° C. </li></ol> 2. SDS-PAGE de las muestras deglicosilada <ol><li> Prepare 130 l nuevo 3X tampón de carga SDS reducir mediante la adición de 4 l de 1,25 M de TDT. </li><li> Añadir 12,5 l de la preparada 3X tampón de carga SDS reduciendo a cada muestra. </li><li> Cerrar los tubos con tapones nuevos y golpee suavemente los tubos para mezclar. </li><li> Incubar los tubos en un termociclador a 94 ° C durante 5 minutos y dejar enfriar a 4 ° C. </li><li> Carga de 30 l de cada muestra y de 10 l de la proteína marcadora en un 10-20% de Tris-Glicina gel. Guarde el resto de la muestra de la parte 3.1. Cargar 10μl del marcador ColorPlus proteína prestained. </li><li> La electroforesis en gel a 130 voltios a temperatura ambiente hasta que el frente tinte en la parte inferior del gel. </li><li> Cuando el gel se haya terminado de ejecutarse, quitar el gel de los actores y el lugar en una pequeña caja de plástico con suficiente azul Coomasie mancha para cubrir el gel. </li><li> Manchar el gel durante 1 hora con agitación suave. </li><li> Lavar el gel tres veces durante 30 minutos en 50 ml de solución destain. </li><li> Grabar las imágenes utilizando un transiluminador de luz blanca o un escáner. Por otra parte, el gel se puede secar entre las hojas de papel de celofán en un marco. </li></ol> 3. Pro-Q Esmeralda 300 para la detección de proteínas glicosiladas en geles SDS-PAGE <ol><li> En paralelo con el gel de 2.1), carga el resto de las muestras en un 10-20% de Tris-Glicina gel. Carga de 10 y mu; L marcador de proteína ColorPlus prestained. </li><li> Mientras que el gel está ejecutando disolver el reactivo Pro-Q Esmeralda con DMF y preparar la revisión de valores, lavado y oxidantes soluciones para la Esmeralda Pro-Q 300 mancha siguiendo el manual de producto incluida con el kit. </li><li> Cuando la electroforesis, retire el gel de fundición y lo coloca en una caja de plástico. </li><li> Fijar el gel mediante la adición de 100 ml de la solución de Fix y dejarlo toda la noche a temperatura ambiente con agitación suave. </li><li> Lavar el gel con 100 ml de la solución de lavado de 10 a 20 minutos a temperatura ambiente con agitación gentil. Repetir el lavado con solución de lavado fresca. </li><li> Oxidar los hidratos de carbono mediante la incubación del gel con agitación suave durante 30 minutos en 25 ml de solución de oxidantes. </li><li> Lavar el gel como se describe en el paso 3.5. </li><li> Mientras que el gel es el lavado de preparar dulce Pro-Q Esmeralda 300 mancha añadiendo 500 l de la solución Pro-Q Esmeralda 300 reactivo disuelto en el paso 3.2 a 25 ml detinción de amortiguación en el kit. </li><li> Tinción del gel mediante la adición de 25 ml de la mancha preparado en el paso 3.8 e incubar en la oscuridad con agitación suave durante 90 a 120 minutos. </li><li> Repita los dos pasos de lavado descrito en el paso 3.5. </li><li> Grabar las imágenes con un transiluminador UV a 300nm. Use el marcador de 80 kDa, que está marcado con Pro-Q verde esmeralda, a la superposición de la imagen UV a una imagen de luz blanca del gel que muestra la escala prestained. </li><li> Compare las imágenes del gel Coomasie manchado en el paso 2.10 con el gel Pro-Q esmeralda teñidas de paso 3.11. </li></ol> 4. Los resultados representativos Los cambios en la migración de las proteínas después de deglicosilación enzimática se muestran en la Figura 2. Comparar la muestra de control (panel A, carril 1) con el tratamiento F PNGase (eliminación de N-glicanos, carril 2), y Mix deglicosilación (PNGase F, además de endo-y exoglicosidasas para eliminar O-glicanos, carril 3). Una reducción adicionalen el tamaño se ve después de digestión con glicosidasas adicional (calle 4). Además de un cambio en la masa, las bandas se agudizan como glicanos son removidos. Una banda ejecuta en el marcador de 17 kDa (asterisco) representa la totalidad deglicosilada hCGβ polipéptido (MW: 16 kDa). Otras bandas pudieran derivarse de deglicosilación incompleta o de las proteínas múltiples identificados en la muestra hCGβ (ver carril 1). Calles 5 a 7 (controles) muestran las bandas correspondientes a las glicosidasas. La tinción de la glicoproteína de verde esmeralda se muestra en el panel B. Este reactivo se oxida y manchas de todos los glicanos presentes en una molécula de proteína. Por lo tanto la intensidad de la señal disminuye a medida que hCGβ es enzimáticamente deglicosilada (calle 1 a calle 4). La señal residual en los carriles 3 y 4 indican la presencia de motivos glicanos, que son resistentes a las enzimas utilizadas. Las glicosidasas adicional que se utiliza en el carril 4 quitar unos pocos residuos adicionales de azúcar: la migración de las proteínas es el mismo, perouna ligera reducción en la intensidad de la tinción se puede ver. Fracciones resistentes al azúcar no estaban presentes en todas las especies de proteínas: algunas bandas no fueron detectados por el verde esmeralda (ausente en la imagen de los rayos UV, entre paréntesis), lo que indica que se deglicosilada ampliamente. Datos adicionales de apoyo a la conclusión de que hCGβ es heterogénea glicosilada. La banda inferior en la pista 2 (flecha) es débil en la imagen verde esmeralda, mientras que la banda superior en la pista 2 es brillante, lo que indica que los grupos de glicanos muchos todavía están presentes. Estos datos apoyan la conclusión de que hCGβ recombinantes expresadas en células de ratón contiene múltiples glicoformas 9. Estos glicoformas diferentes debido a la heterogeneidad inherente de la glicosilación en algunos polipéptidos no reciben un glicano en cada sitio de consenso y / o glicanos algunos se extienden, mientras que otros, incluso en la misma proteína que no lo son. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3749/3749fig1.jpg" /> Figura 1.Los patrones típicos de glicosilación de las glicoproteínas secretadas o de la superficie celular. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3749/3749fig2.jpg" /> Figura 2. Geles SDS-PAGE mostrando deglicosilación enzimática de hCGβ. El panel A muestra una coloración azul Coomasie mientras que el panel B se muestran los resultados de la Pro-Q Esmeralda 300 para la visualización de las proteínas glicosiladas. Número de la muestra: 1, el control hCGβ, 2, F PNGase digestión; 3, la digestión deglicosilación Mix, 4, Mix deglicosilación más exoglicosidasas digestión, las muestras de 5 a 7 son los controles de reactivos (O-Glyc, O-glucosidasa, GNA, β-N -acetilglucosaminidasa; fucosidasa Gal / FUC, β1-3 galactosidasa, α1-3, galactosidasa 6, y α1-2; GalNA, α-N-Acetylglalactosaminidase, Neu, la neuraminidasa; PNGase; F PNGase)

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<li>Zachara, N. E., Vosseller, K., Hart, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+analysis+of+proteins+modified+by+O-linked+N-acetylglucosamine%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Detection and analysis of proteins modified by O-linked N-acetylglucosamine.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 95, 17-17 (2011).</li>
<li>Varki, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aVarki%2C+A+%22Essentials+of+Glycobiology%22">Essentials of Glycobiology</a>. , 2nd Ed, Clod Spring Harbor Laboratory Press. (2008).</li>
</ol>

Los autores son empleados de New England Biolabs, que produce muchos de los reactivos utilizados en este artículo.

El método descrito aquí usando deglicosilación enzimática y SDS-PAGE puede proporcionar información valiosa sobre el estado de glicosilación de una proteína de interés, mientras que glicano reactivos específicos para facilitar la interpretación de los datos. Este protocolo está pensado para los estudios iniciales de la glicosilación de proteínas y es especialmente adecuado para secretora y las glicoproteínas de membrana de las células de mamíferos: las enzimas elegido en este caso concreto se eliminarán todos los N-glicanos, y N-glicanos o más y los azúcares más comunes la ampliación y que forman el núcleo de O-glicanos. Glicosidasas tienen la ventaja adicional de ser leve, en comparación con los métodos deglicosilación química, preservando la integridad de azúcares y de columna de la proteína. Para dilucidar la tasa de ocupación (que los aminoácidos son glicosilada), el grado de glicosilación, o para determinar la estructura fina de los glicanos, las técnicas más sofisticadas, tales como mespectrometría de culo, la cromatografía líquida o la RMN son obligatorios. Debido a su simplicidad, varios pasos en este protocolo se puede ajustar, sustituir y / o combinados para adaptarse a las distintas necesidades experimentales. Sin embargo, con el fin de obtener resultados que puedan interpretarse claramente que es importante para entender sus fortalezas y limitaciones. En primer lugar, la especificidad y la pureza de las glicosidasas son cruciales: sólo las enzimas bien caracterizadas evaluados para estar libres de las proteasas y otras actividades contaminantes deben ser utilizados. Desafortunadamente, no existe una definición estándar para la unidad de enzima glicosidasas, el usuario deberá determinar la sustitución adecuada de acuerdo a las especificaciones del fabricante. En segundo lugar, una cuidadosa selección de detección es necesario: a los reactivos de la proteína) tinción son útiles sólo si los resultados deglicosilación en un cambio significativo de la masa molecular. Como un resultado claro, como se muestra aquí no siempre se consigue. En otros casos, hemos visto mi anormalesintegración después de deglicosilación (lejos del peso molecular predicho, o la migración aún más lento). Este fenómeno no se entiende bien, pero se puede decir que cualquier cambio en la migración es evidencia de que la proteína se ha deglicosilada. B) la detección de azúcar con los anticuerpos presenta desafíos únicos que limitan su aplicabilidad. Ha sido muy difícil generar general anti-glicano anticuerpos, por lo general son planteadas contra un complejo objetivo de glicanos, lo que limita su uso. Por otra parte, varios anticuerpos monoclonales anti-glicanos anticuerpos mostrar reactividad cruzada no deseados 10. C) Las lectinas (proteínas con afinidad intrínseca de azúcar) son muy adecuadas para la detección de azúcar, además de que dan idea de la estructura de glicano. Sin embargo, no todos ellos tienen una especificidad estrecha, y muchos son sólo parcialmente caracterizado (lo que significa que podría tener afinidades desconocido). Como consecuencia, una tinción positiva lectina proporciona una indicación, no una prueba, de la presencia de un giVen azúcar. d) equipos de etiquetado de productos químicos (basado en la oxidación de peryodato de azúcares) son el método de elección para teñir todas las glicoproteínas, y por lo tanto muy adecuado para seguir deglicosilación. Cuando se procesa una muestra desconocida, es una buena práctica incluir los controles de la glicoproteína. Fetuina es un N disponible - y O-glicoproteína, la gonadotropina coriónica (dos subunidades) es también una buena opción. Albúmina de suero bovino (BSA) se puede utilizar como control negativo. Sin embargo, cabe señalar que algunas proteínas no glicosilada reaccionar ligeramente con la Esmeralda del Pro-Q 300, especialmente cuando se utiliza en altas concentraciones. No glicosilada estándares de peso molecular, tales como el marcador de la proteína prestained utilizados en este protocolo, tienen la ventaja de mostrar bandas nítidas. Sólo por casualidad, es una de estas proteínas (80 kDa) reactiva a Pro-Q Esmeralda 300. Por lo tanto, el usuario podría querer ejecutar una escala estándar de la glicoproteína en su lugar, como el caramelo de la caña de Invitrogen. Finalmente, simple en gel de detección de las glicoproteínas nucleocytosolic (que se modifican con una sola O-GlcNAc) es posible con el uso de un anticuerpo monoclonal, a lo largo de β-N-acetilglucosaminidasa para el control de especificidad 11. La descripción de esta técnica está más allá de la alcance de este artículo, pero debe ser mencionado como glicosidasas son herramientas útiles para el estudio de muchas otras glicoproteínas y glicoconjugados presentes en las células. Un tratamiento integral de todas las formas conocidas de la glicosilación se puede encontrar en la segunda edición de los &quot;Fundamentos de la Glicobiología&quot;, disponible gratuitamente en la biblioteca NCBI (ID estantería: NBK1908; PMID: 20301239) 12.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> Β de gonadotropina coriónica humana </td><td> Sigma Aldrich </td><td> C6572 </td><td></td></tr><tr><td> Tubos para PCR </td><td> VWR </td><td> 20170-004 </td><td></td></tr><tr><td> Termociclador PCR </td><td> Applied Biosystems </td><td> 4359659 </td><td></td></tr><tr><td> PNGase F </td><td> New England Biolabs </td><td> P0704 </td><td> Se suministra con tampones </td></tr><tr><td> Mezclar proteínas deglicosilación </td><td> New England Biolabs </td><td> P6039 </td><td> Se suministra con tampones </td></tr><tr><td> α-N-Acetylglalactosaminidase </td><td> New England Biolabs </td><td> P0734 </td><td> Se suministra con buffer </td></tr><tr><td> α1-2 fucosidasa </td><td> New England Biolabs </td><td> P0724 </td><td> Se suministra con buffer </td></tr><tr><td> α1-3, 6 galactosidasa </td><td> New England Biolabs </td><td> P0731 </td><td> Se suministra con buffer </td></tr><tr><td> β1-3 galactosidasa </td><td> New England Biolabs </td><td> P0726 </td><td> Se suministra con buffer </td></tr><tr><td> Buffer 10X G7 (500 mM de fosfato sódico) </td><td> New England Biolabs </td><td> --- </td><td> Se suministra con PNGaseF o Mix Degl </td></tr><tr><td> Buffer 10X glicoproteína desnaturalización (5% SDS, 400 mM DTT) </td><td> New England Biolabs </td><td> --- </td><td> Se suministra con PNGaseF o Mix Degl </td></tr><tr><td> 10% de NP-40 </td><td> New England Biolabs </td><td> --- </td><td> Se suministra con PNGaseF o Mix Degl </td></tr><tr><td> 3X tampón de carga SDS (187,5 mM Tris-HCl pH 6,8, 6% SDS, 30% de glicerol, 0,03% bromophenol azul) </td><td> New England Biolabs </td><td> B7703 </td><td> Se suministra con 1,25 M de TDT </td></tr><tr><td> ColorPlus prestained marcador de la proteína </td><td> New England Biolabs </td><td> P7709 </td><td></td></tr><tr><td> 10-20% de Tris-Glicina Multigel </td><td> Cosmo Bio Co. </td><td> DCB-414893 </td><td></td></tr><tr><td> Cassette unidad de electroforesis </td><td> Cosmo Bio Co. </td><td> DCB-303111 </td><td></td></tr><tr><td> Electroforesis EPS de alimentación 301 </td><td> GE Healthcare </td><td> 18-1130-01 </td><td></td></tr><tr><td> Pro-Q Esmeralda 300 inhibidores de la glucoproteína manchas Kit </td><td> Invitrogen </td><td> P-21857 </td><td></td></tr><tr><td> Brilliant Blue R </td><td> Sigma Aldrich </td><td> B0149 </td><td></td></tr><tr><td> AlphaImager HP System </td><td> Celular Biociencias </td><td> 92-13823-00 </td><td></td></tr></tbody></table>

identificación y caracterización de la glicosilación de proteínas específicas de uso de endo-y exoglicosidasas

Identification and Characterization of Protein Glycosylation using Specific Endo- and Exoglycosidases

Glicosilación, la adición de azúcares covalentemente, es una de las principales modificaciones post-traduccionales de proteínas que pueden afectar significativamente a los procesos como la adhesión celular, el tráfico molecular, la limpieza, y la transducción de señales 1.4. En los eucariotas, las modificaciones de la glicosilación más comunes en la vía secretora son adiciones a los residuos de asparagina consenso (N-linked), o en residuos de serina o treonina (O-vinculado) (Figura 1). Iniciación de la síntesis de N-glicanos está altamente conservada en eucariotas, mientras que los productos finales pueden variar mucho entre las diferentes especies, los tejidos o las proteínas. Algunos glicanos quedan sin modificar (&quot;alta manosa N-glicanos&quot;) o procesados ​​en el aparato de Golgi (&quot;complejo de N-glicanos&quot;). Mayor diversidad se encuentra a O-glicanos, que comienzan con un común N-acetilgalactosamina (GalNAc) de residuos en las células animales, pero difieren en los organismos inferiores 1. ent &quot;&gt; El análisis detallado de la glicosilación de las proteínas es un campo en sí mismo y requiere muchos recursos y experiencia para ejecutar correctamente. Sin embargo, una variedad de enzimas disponibles que eliminar los azúcares (glicosidasas) hace posible tener una idea general del estado de glicosilación . una proteína en un laboratorio estándar Aquí se ilustra el uso de glicosidasas para el análisis de una glicoproteína de modelo. coriónica humana recombinante beta gonadotropina (hCGβ), que lleva dos N-glicanos y cuatro O-glicanos 5 La técnica requiere sólo simples instrumentación y consumibles típica, y puede ser adaptado fácilmente para el análisis de las muestras de la glicoproteína múltiples. Varias enzimas se pueden utilizar en paralelo al estudio de una glicoproteína. PNGase F es capaz de eliminar casi todos los tipos de N-glicanos ligados 6,7. De O-glicanos, no hay enzimas disponibles que puede romper un oligosacárido intacto de the esqueleto de la proteína. En cambio, O-glicanos se recortan por exoglicosidasas a un corazón corto, que luego se elimina fácilmente por O-glucosidasa. La mezcla de proteínas contiene deglicosilación PNGase F, O-glucosidasa, la neuraminidasa (sialidasa), galactosidasa β1-4 y β-N-acetilglucosaminidasa. Se utiliza para eliminar simultáneamente N-glicanos y algunos glúcidos O-8. Finalmente, la mezcla deglicosilación se complementó con una mezcla de exoglicosidasas otros (α-N-acetilgalactosaminidasa, α1-2 fucosidasa, α1-3, 6 galactosidasa, y galactosidasa β1-3), que ayudan a eliminar los monosacáridos otra resistencia que podrían estar presentes en ciertas O-glicanos. SDS-PAGE/Coomasie azul se utiliza para visualizar las diferencias en la migración de las proteínas antes y después del tratamiento glucosidasa. Además, un azúcar específico de método de tinción, ProQ Esmeralda-300, muestra de la señal disminuye a medida que los glicanos son successively eliminado. Este protocolo está diseñado para el análisis de pequeñas cantidades de glicoproteína (0,5 a 2 mg), aunque deglicosilación enzimática puede ser ampliado para dar cabida a grandes cantidades de proteínas, según sea necesario.

Usando glicosidasas específicas para eliminar los azúcares de las glicoproteínas seguido de SDS-PAGE es un método útil para detectar las modificaciones de glicanos de las muestras de proteínas y es una buena opción para los estudios de glicobiología inicial. Siguientes cambios deglicosilación pueden ser detectados como cambios en la movilidad en gel o por tinción con glicano reactivos sensibles.

Identificación y caracterización de la glicosilación de proteínas específicas de uso de endo-y exoglicosidasas

La glicosilación, la adición de azúcares unidos covalentemente, es una modificación postraduccional fundamental de las proteínas que puede afectar significativamente los procesos...

El objetivo general del siguiente experimento es ilustrar el uso de glicosidasa para la desglicosilación enzimática y el análisis de la glicosilación N y O enlazada en una glicoproteína modelo. Esto se logra tratando una glicoproteína con PGA's F o con la mezcla de desglicosilación de proteínas. Además, la mezcla de desglicosilación de proteínas se complementó con una mezcla de exoglicosidas adicionales, que en ocasiones ayudan a eliminar azúcares que de otro modo serían resistentes.Ilustramos este método utilizando un modelo de glicoproteína, la gonadotropina coriónica humana recombinante beta o HCG beta, seguido de SDS-PAGE, tinción con azul de Kumasi y un método de tinción específico para azúcares. Se utiliza Pro Q Emerald 300 para analizar la glicosilación D. Se obtienen resultados de la muestra de HCG beta, que muestran que la HCG beta está heterogéneamente glicosilada y contiene múltiples glicoformas, basado en las diferencias en la migración proteica con y sin tratamiento glicosilado y en la señal disminuida en la tinción con ProQ a medida que los glicanos se eliminan sucesivamente.La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes, como el análisis por espectrometría de masas, es que es sencilla, utiliza equipos de laboratorio comunes y es adecuada para el biólogo novel en glicobiología. Este método puede responder preguntas clave en el campo de la glicobiología, como por ejemplo si mi proteína está glicosilada. Para comenzar la desglicosilación enzimática, descongele los tampones suministrados en el kit de desglicosilación de proteínas.Mezcle los tubos completamente y manténgalos a temperatura ambiente. Coloque los viales que contienen la enzima en hielo, disuelva el contenido del vial de beta HCG en 600 microlitros de agua destilada y manténgalos en hielo. Después de preparar un mililitro de tampón 1X G7 diluyendo el stock 10X en agua destilada, use 25 microlitros para diluir 0,5 microlitros de PGA's f.Prepare la mezcla de exoglicósidos combinando dos microlitros de cada uno de los cuatro exoglicósidos. A continuación, agregue HCG beta y tampón desnaturalizante 10 x para glicoproteínas a siete tubos PCR numerados según se indica en el protocolo escrito, tape los tubos y mezcle suavemente. Desnaturalice las proteínas en el termociclador incubando durante 10 minutos a 94 grados Celsius, seguido de una permanencia a cuatro grados Celsius. Después de retirar los tubos del termociclador, centrifugue para eliminar cualquier condensación visible. A cada tubo de reacción, agregue los reactivos restantes según lo indicado en el protocolo escrito. Cierre los tubos PCR utilizando nuevas tapas.Luego, mezcle los tubos golpeando suavemente cuatro veces tras centrifugar los contenidos, coloque los tubos en el termociclador e incube a 37 grados Celsius durante cuatro horas. A continuación, enfríe las muestras a cuatro grados Celsius. Para preparar la electroforesis SDS-PAGE, prepare un tampón de carga SDS reductor al 3 x fresco.Con DTT, agregue 12,5 microlitros del tampón de carga SDS reductor al 3x preparado a cada muestra, cierre los tubos con nuevas tapas y golpee suavemente los tubos para mezclar. Incube los tubos en un termociclador a 94 grados Celsius durante cinco minutos, luego enfríe a cuatro grados Celsius. Tras la incubación, cargue 30 microlitros de cada muestra y 10 microlitros del marcador de proteínas en un gel de tri-glicina del 10 al 20 %. Guarde el resto de cada muestra.Electroforesis en gel a 130 voltios hasta que el frente de D esté cerca de la parte inferior del gel. Cuando finalice la electroforesis, retire el gel del molde y colóquelo en una caja de plástico pequeña con suficiente tinción azul de kumasi para cubrir el gel. Incube el gel durante una hora con agitación suave después de teñirlo.Lave tres veces durante 30 minutos. En 50 mililitros de solución de retención, registre las imágenes utilizando un transiluminador de luz blanca o un escáner. Alternativamente, el gel puede secarse entre hojas de celofán.En un marco, corra el resto de cada muestra y un marcador de proteínas en un gel de Tri-glicina del 10 al 20 % mientras el gel está en marcha. Disuelva el reactivo ProQ Emerald en DMF y prepare las soluciones stock de fijación, lavado y oxidación para la tinción siguiendo el manual del producto proporcionado con el kit. Cuando la electroforesis esté completa, retire el gel del molde y colóquelo en una caja de plástico.Fije el gel añadiendo 100 mililitros de la solución fijadora preparada. Deje el gel durante la noche a temperatura ambiente con agitación suave al día siguiente. Lave el gel con 100 mililitros de la solución de lavado preparada durante 10 a 20 minutos a temperatura ambiente con agitación suave, repitiendo el lavado una segunda vez con solución de lavado fresca.A continuación, oxide los carbohidratos incubando el gel con agitación suave durante 30 minutos en 25 mililitros de la solución oxidante preparada, siga la incubación con dos lavados adicionales mientras el gel se está lavando. Prepare la tinción fresca con ProQ Emerald 300 añadiendo 500 microlitros de la solución del reactivo ProQ Emerald 300 a 25 mililitros del tampón de tinción proporcionado en el kit. Tiña el gel incubándolo en la tinción preparada en condiciones oscuras con agitación suave durante 90 a 120 minutos posteriores a la tinción del gel.Repita los dos pasos de lavado según se describió anteriormente. Luego registre las imágenes con un transiluminador UV a 300 nanómetros. Como paso final, compare las imágenes del gel teñido con kumasi con las del gel teñido con ProQ Emerald.Los cambios en la migración de proteínas tras la desglicosilación enzimática pueden observarse al comparar la muestra control con el tratamiento F de PGA. Para eliminar los glicanos N y mediante el tratamiento con la mezcla de desglicosilación para eliminar los glicanos N y O, no se observa una reducción adicional en el tamaño tras la digestión con glicosidasa adicional. Además de un cambio en la masa, las bandas se vuelven más nítidas a medida que se eliminan los glicanos.Una banda que se desplaza por debajo del marcador de 17 kilodalton probablemente representa el polipéptido beta de HCG completamente desglicosilado. Las calles cinco a siete muestran las bandas correspondientes a la forma glicosilada. Otras bandas podrían derivarse de una desglicosilación incompleta o de múltiples proteínas no identificadas presentes en la muestra del beta de HCG.El reactivo verde esmeralda oxida y tiñe todos los glicanos presentes en una molécula proteica. Por lo tanto, la intensidad de la señal disminuye a medida que la beta HCG se desglicosila enzimáticamente. La señal residual en los carriles tres y cuatro indica la presencia de motivos de glicanos resistentes a las enzimas utilizadas.Se utiliza el glucósido adicional en la banda cuatro. Elimine algunos residuos de azúcar adicionales. La migración de la proteína es la misma, pero se puede observar una ligera reducción en la intensidad de la tinción.Las moieties de azúcares resistentes no estaban presentes en todas las especies proteicas. Algunas bandas no fueron detectadas por Emerald Green, lo que indica que fueron extensamente desglicosiladas. Datos adicionales respaldan la conclusión de que la beta HCG está heterogéneamente glicosilada. La banda inferior en la calle dos es tenue en la imagen de Emerald Green.Aunque la banda superior en la segunda pista es brillante, lo que indica que aún están presentes muchos grupos GLYCAN, estos datos respaldan la conclusión de que la hCG beta recombinante expresada en células de ratón contiene múltiples formas glicósidas debido a la heterogeneidad inherente de la glicosilación. Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la espectrometría de masas, para responder preguntas adicionales, tales como: ¿cuál es la tasa de ocupación? ¿Cuál es el grado de glicosilación, o cuál es la estructura fina de los glicanos?Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo utilizar la glicosilación para la desglicosilación enzimática y el análisis de glicanos unidos a NNO en glicoproteínas. La elección del método de detección puede ser difícil porque las tinciones proteicas son útiles solo si la desglicosilación provoca un cambio significativo en la masa molecular de otras proteínas.Hemos observado migraciones anormales tras la desglicosilación y hemos encontrado que cualquier cambio en la migración es evidencia de que la proteína ha sido desglicosilada.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Se describe un método para el análisis de la alteración de la N-glicanos ligados a través de los primeros años de vida de las glicoproteínas después de su biosíntesis en células de mamíferos. Esto se logra mediante pulso-caza análisis de glicanos metabólicamente etiquetados, liberación enzimática de las glicoproteínas y análisis por HPLC.

Pulso-caza de análisis de cadenas de azúcares unidos a N de glicoproteínas en células de mamífero

Un método específico y sensible para profundizar en el perfil de expresión de los antígenos de glucoesfingolípidos en órganos y células inmunes se describe. El método se aprovecha de la espectrometría de masas de iones trampa permitiendo paso a paso fragmentación de las moléculas de glucoesfingolípidos para el análisis estructural, en comparación con los estándares de síntesis química.

Análisis espectrométrico de masas de Antígenos glicoesfingolípido

Con el fin de explorar exhaustivamente la diversidad de glicanos ligados a O, se aplica un nuevo procedimiento para la eliminación de β reductor en gel, combinado con permetilación y un método rápido de partición de fase, al análisis de glicanos ligados a O liberados directamente de glicoproteínas resueltas por SDS-PAGE y susceptibles de análisis glicómico posterior por espectrometría de masas.

Mejora En-gel β-eliminación para ligada al O y exhaustiva sulfo-glycomics reductoras de Espectrometría de Masas

Se desarrolló un protocolo de alto rendimiento para la purificación combinada de proteómica y glicómica y la cuantificación de LC-MS/MS en plasma. El análisis de desamidación de los motivos de glicosilación ligados a N fue específico para los sitios desglicosilados. La cuantificación precisa de N-glicanos se logró acoplando la separación de N-glicanos asistida por filtro a la normalización de la individualidad al marcar con la estrategia de etiquetas de hidrazida de glicano.

Un Glicómica cuantitativa y Proteómica estrategia de purificación combinada

Este documento describe una metodología para preparar muestras de tejido cardiovascular para el análisis de MS que permite (1) el análisis de composición de proteínas ECM, (2) la identificación de los sitios de glicosilación, y (3) la caracterización de la composición de formas de glicano. Esta metodología se puede aplicar, con modificaciones menores, para el estudio de la ECM en otros tejidos.

Glycoproteomics de la matriz extracelular: Un método para el análisis glucopéptidos Intacto El uso de la espectrometría de masas

La búsqueda abierta permite la identificación de glicopéptidos decorados con composiciones de glicanos previamente desconocidas. Dentro de este artículo, se presenta un enfoque simplificado para realizar búsquedas abiertas y posteriores búsquedas de glicopéptidos centrados en glicotecos para muestras bacterianas utilizando Acinetobacter baumannii como modelo.

La aplicación de enfoques abiertos basados en la búsqueda para la identificación de glicopéptidos ligados a O de Acinetobacter baumannii

Este protocolo detalla el método de glicoproteómica guiada por glucómicos, una tecnología ómica integrada que ofrece información completa sobre el glicoproteoma heterogéneo en microambientes tumorales complejos necesarios para comprender mejor la glicobiología de los cánceres.

La glicoproteómica guiada por glucómica facilita el perfil completo del glicoproteoma en microambientes tumorales complejos 

Aquí se describe una nueva técnica de proteómica cuantitativa para la identificación de complejos de proteínas en Saccharomyces cerevisiae. En este estudio, hemos utilizado el método de SILAC junto con la purificación de afinidad seguida de espectrometría de masas para identificar con una alta especificidad de la unión de compañeros de una proteína del RE, Scs2p.

Identificación de los complejos de proteínas con la proteómica cuantitativa en S. cerevisiae

Un protocolo corto para la tinción de proteínas con Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 en geles de poliacrilamida se describe sin el uso de disolventes orgánicos o en ácido acético como en los procedimientos clásicas de tinción con CBB.

Tinción de las proteínas en geles con Coomassie G-250, sin ácido disolvente orgánico y el acético

El video que acompaña describe el uso del sistema de fraccionamiento GELFREE 8100, las particiones que las muestras de proteínas complejas sobre la base del peso molecular y se recupera la fracción en fase líquida. El video describe cómo funciona la tecnología, cómo se utiliza, y proporciona los datos resultantes, con el análisis de electroforesis en gel de poliacrilamida de homogeneizado fraccionada hígado de bovino.

Utilizando el sistema de fraccionamiento GELFREE 8100 de peso molecular basado en Fraccionamiento con la recuperación de la fase líquida

Aprende a identificar glicosilación en proteínas usando endo- y exoglicosidasas con HCG beta como modelo. Este método enzimático permite analizar glucanos N- y O-unidos mediante SDS-PAGE y tinciones específicas.

Identificación y caracterización de la glicosilación de proteínas específicas de uso de endo-y exoglicosidasas

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