La diferenciación eficiente de las células madre embrionarias de ratón en neuronas motoras

El objetivo general de este procedimiento es diferenciar las células madre embrionarias de ratón en neuronas motoras. Primer cultivo de ratón, células madre embrionarias en fibroblastos embrionarios primarios de ratón y suplemento con factor inhibidor de la leucemia. Luego, mejore el proceso de normalización agregando noggin BFG F y FGF ocho para inducir la especificación de las neuronas motoras mediante incubación con ácido retinoico y agonista suavizado, a la que sigue la elongación de los axones y la maduración de las neuronas motoras.

Por último, el uso de la microscopía de inmunofluorescencia para examinar las células MES diferenciadas que expresan una fuerte fluorescencia GFP La generación de grandes cantidades de neuronas motoras facilitó la investigación en enfermedades de las neuronas motoras en comparación con los protocolos existentes actuales. Este enfoque de diferenciar células madre embrionarias de ratón en neuronas motoras es más eficiente. Este método puede proporcionar información sobre la atrofia muscular espinal.

También se puede aplicar a otras enfermedades de las neuronas motoras como la esclerosis lateral amiotrófica Para colocar fibroblastos de ratón embrionarios primarios en placa, recubren cuatro placas de cultivo de tejidos de 100 milímetros con ocho mililitros de solución de gelatina al 0,1%. Después de 30 minutos a temperatura ambiente, deseche el exceso de líquido. Ahora diluya un vial de mitomicina C en PMEF activado en 40 mililitros de placa de medios PMEF en las cuatro placas y cultive durante un máximo de una semana.

A continuación, descongele un vial de células MES en un baño de agua a 37 grados. Lave las células con cinco mililitros de medio E ES en un tubo de 15 mililitros. Después de centrifugar a 800 RPM durante cinco minutos.

Aspire el sobrenadante y resuspenda las células MES en 20 mililitros de medio ES con factor inhibidor de la leucemia recién añadido. Proceda a retirar los medios de 10 mililitros de los cultivos de PMEF y sustitúyalos por 10 mililitros de la suspensión de tres células ES de HBG. Monitoree la progresión de las células MES a lo largo del tiempo desde pequeñas colonias a las 24 horas hasta colonias de aproximadamente 100 micrómetros de diámetro a las 72 horas después de la siembra.

Reemplace los medios diariamente para mantener la proliferación de células para la inducción de células MES. Diferenciación en neuronas motoras. Las células madre embrionarias de ratón deben separarse primero de las células alimentadoras de PMEF y luego cultivarse en un entorno de suspensión el día de la inducción.

Por cada cultivo de 100 milímetros de ES, prepare un matraz T one 50 recubierto con gelatina al 0,1% Después de 30 minutos a temperatura ambiente, retire el exceso de gelatina y lave tres veces con PBS. Continúe aspirando cuidadosamente los medios de la cultura ES, asegurándose de no desalojar las colonias poco adheridas. A continuación, lavar una vez con 10 mililitros de PBS.

Ahora, para separar las células MES de PMEF, agregue tres mililitros de EDTA al 0,25% de tripsina e incube durante tres a cinco minutos. A 37 grados centígrados, verifique que las células madre y el PMEF se hayan desprendido de la placa. A continuación, añada 15 mililitros de medio ES fresco y altere las colonias mediante el pipeteo.

Transfiera la suspensión celular al matraz T one 50 recubierto de gelatina preparado, incube durante 30 minutos a 37 grados Celsius para que PFS se adhiera a la superficie gelatinizada. Ahora coseche las células MES flotantes en un tubo de 50 mililitros y granule por centrifugación. Resuspender las células en 10 mililitros de diferenciación neuronal.

El medio enumera usando un hemocitómetro y luego la placa en una placa de cultivo en suspensión de 100 milímetros en la diferenciación. El primer día, verifique por microscopía que las células MES han formado pequeños agregados flotantes llamados cuerpos embrionarios. Dado que cualquier PMEF remanente se adhiere al plato, transfiera las celdas y los medios de suspensión ES a un tubo de 15 mililitros, luego centrifugue a 500 RPM durante tres minutos.

Para recolectar los cuerpos embrionarios, aspire fuera del medio, agregue cuidadosamente 10 mililitros de diferenciación neuronal fresca, medio a los ebs granulados, y luego coloque las células en una nueva placa bacteriana de cultivo durante 24 horas en la diferenciación. El segundo día, agite la placa de cultivo y transfiera el medio y el EBS a un tubo de 15 mililitros. Deje que el EBS se asiente por gravedad, luego aspire el medio con cuidado y vuelva a suspender el EBS y 10 mililitros de diferenciación de la neurona motora.

Medio de cultivo de EBS en una nueva placa bacteriana durante cinco días en la diferenciación. Día siete, verifique que los EBS tengan aproximadamente de 150 a 200 micrómetros de diámetro y expresen fuertes señales de GFP en la diferenciación. El quinto día, dos días antes de disociar el EBS, coloque cubreobjetos redondos de 12 milímetros en el fondo de una placa de 24 pocillos.

Luego agregue 0,5 mililitros de 100 microgramos por mililitro, poli DL ornitina e incube a cuatro grados centígrados durante la noche. Aspire las placas de secado al aire de poly DL ornitina y cubra los deslizamientos en una campana de cultivo de tejidos. Enjuague los pozos de los platos con agua destilada doble tres veces.

Deje secar al aire para cubrir los cubreobjetos. Hacer una nueva dilución de dos microgramos por mililitro de laminina de ratón en cinco mililitros de un XPBS helado y frío. Agregue 0,5 mililitros por pocillo e incube a cuatro grados centígrados durante la noche.

Lavar dos veces con PBS en la diferenciación. Día siete, recoja el EBS en un tubo de 15 mililitros y deje que el EBS se asiente por gravedad. Después de cuatro lavados con PBS, agregue un mililitro de ACU max al EBS, mezcle e incube suavemente durante cinco minutos a temperatura ambiente, luego aspire el exceso de ACU max cubriendo el ebs.

Ahora agregue tres mililitros de medio MND y disocie EBS pipeteando aproximadamente 20 veces con una micropipeta einor de un mililitro, luego incube durante dos minutos a temperatura ambiente, pase la suspensión celular a través de una tapa de entrenador celular a un tubo de 12 por 75 milímetros. Repita este paso de disociación con los grumos y celdas restantes retenidos por el filtro para enriquecer el rendimiento de las celdas individuales en una suspensión final de una sola celda de seis mililitros. Mezcle suavemente la suspensión de una sola célula y cuente las células con un hemocitómetro, diluya las células en un medio MND completo a una densidad de dos veces 10 a la quinta célula por placa de mililitro.

Suspensión de celda de 0,5 mililitros por pocillo de las placas de 24 pocillos preparadas que contienen deslizamientos de cubierta recubiertos de poli DL ornitina laminina. Las células diferenciadas extienden neuritas largas después de dos días. En cultivo, HBG three es una línea celular ES derivada de un ratón transgénico que expresa EGFP bajo el control de un promotor específico de neurona motora HB nine con un protocolo de diferenciación definido.

Las células MES se pueden utilizar para derivar neuronas motoras. Las células MES indiferenciadas forman colonias redondas en la parte superior de una capa alimentadora de fibroblasto. Tienen una expresión débil de GFP.

Estas células MES se separaron de las ponedoras alimentadoras y se cultivaron en placas de baja fijación para formar cuerpos embrionarios. Las células MES diferenciadas expresaron una fuerte fluorescencia de GFP después del séptimo día. Los EBS de diferenciación se disociaron y se platearon en placas recubiertas de poli DL ornitina laminina.

Las células diferenciadas extienden neuritas largas desde los cuerpos celulares de las células plateadas después de dos días en cultivo, las neuronas motoras derivadas de células MES se pueden caracterizar mediante tinción de inmunofluorescencia. Estas células GFP positivas expresan el marcador panneuronal neurofilamento y los dos marcadores específicos de la neurona motora. El párpado uno y la colina acetiltransferasa DPI tiñen los núcleos tomados en conjunto.

Nuestro protocolo de diferenciación de dos pasos proporciona una forma eficiente de diferenciar las células MES en neuronas motoras espinales. Después de ver este video, debería comprender cómo diferenciar de manera eficiente las células madre embrionarias de ratón en neuronas motoras. En conclusión, recuerde que una alta calidad de las células madre embrionarias de ratón es el parámetro más crítico para generar neuronas motoras de manera eficiente.