Diferenciación de células madre embrionarias de ratón en precursores corticales interneurona

El objetivo general de este procedimiento es generar progenitores de interneuronas corticales en precursores de interneuronas postmitóticas para células madre embrionarias de ratón utilizando un método de cuerpo embrioide modificado a monocapa. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la neurociencia, como la forma en que los subtipos de interneuronas corticales logran sus destinos individuales durante el desarrollo. La principal ventaja de esta técnica es que permite la generación eficiente de progenitores de interneuronas que expresan Nkx2.1, así como métodos para enriquecer para los subgrupos de interneuronas de parvalbúmina o somatostatina.

Para comenzar este procedimiento, coloque placas en las células alimentadoras de MEF mitóticamente inactivas en medios MEF en placas tratadas con cultivo de tejidos. Espere al menos 12 horas para que se asienten en una incubadora de cultivo celular a 37 grados centígrados antes de sembrar las mESC. Si no se utiliza inmediatamente, reemplace el medio MEF cada tres días.

A continuación, agregue mESC que contienen el factor inhibidor de la leucemia de ratón a las placas MEF. Incubar las células a 37 grados centígrados en dióxido de carbono al 5%. Pase las mESC utilizando tripsina-EDTA una vez que la placa se vuelva 70 a 80% confluente, y mantenga las mESC en una capa alimentadora de MEF en medios mESC para mantener la pluripotencia.

Antes de comenzar la diferenciación, pase las células al menos una vez a placas recubiertas de gelatina sin MEF para diluirlas. Para ello, prepare placas recubiertas de gelatina añadiendo un 0,1% de gelatina y PBS con calcio y magnesio a una placa tratada con cultivo de tejidos e incube a 37 grados centígrados durante al menos 1 hora. Coloque la placa de 1,5 a dos veces 10 a la sexta celda en cada placa de diez centímetros y permita que se expandan durante dos días antes de comenzar la diferenciación.

En DD0, después de que las mESC hayan crecido en las placas recubiertas de gelatina durante dos días, aspire el medio y lave las células una vez con PBS sin calcio y magnesio. A continuación, añada suficiente tripsina-EDTA para cubrir la superficie de las placas. Y vuelva a colocar las células en la incubadora a 37 grados centígrados durante cuatro minutos.

Después de cuatro minutos, apague la tripsina-EDTA usando dos veces su volumen de medios mESC. Transfiera las células a un tubo de centrífuga del tamaño adecuado y centrifugue las células a 200 veces g durante cinco minutos. A continuación, retire el tubo y aspire el medio sin alterar el pellet.

Vuelva a suspender el pellet en un milímetro de medio KSR-N2. Posteriormente, mida la concentración de células con un hemocitómetro o un contador de células automatizado. Comience a cultivar las células como cuerpos embrioides agregando 75.000 células por mililitro en medios KSR-N2 en las placas de cultivo de tejidos no adherentes.

E incubarlos a 37 grados centígrados. En DD1, prepárese para el aterrizaje celular cubriendo las placas tratadas con poli-L-lisina en cultivo de tejidos durante al menos una hora o toda la noche a 37 grados centígrados. En DD2, aspire la poli-L-lisina y cubra las placas con laminina durante la noche a 37 grados centígrados.

En DD3, antes de comenzar la disociación de EB, aspire laminina y deje que las placas se sequen completamente en una campana de cultivo de tejidos. Luego, transfiera los EB con el medio a un tubo de 15 mililitros y centrifugue durante tres o cuatro minutos a 15 veces g o hasta que los EB se hayan granulado. Aspire el medio y agregue tres mililitros de solución de desprendimiento de células que contenga DNasa.

Luego, incube la muestra a 37 grados centígrados durante 15 minutos. Golpee suavemente el tubo cada tres minutos para ayudar en la disociación de la EB. Una vez que los EB ya no sean visibles, o hayan transcurrido 15 minutos, agregue seis mililitros de KSR-N2 que contenga DNasa y centrifugue durante cinco minutos a 200 veces g.

A continuación, coloque las células en KSR-N2 que contienen LDN193189, XAV939, y el inhibidor de ROCK, Y27632, a 4,5 a cinco veces diez por la cuarta célula por centímetro cuadrado. En DD5, cambie el medio con KSR-N2 que contenga FGF2, IGF1 y SSH. A continuación, prepare las placas de cultivo de tejidos para el replanteo el día 8, siguiendo las instrucciones descritas en los procedimientos de DD1 y DD2.

En DD7, cambie el medio con KSR-N2 que contenga FGF2, IGF1 y SHH. En DD8, vuelva a colocar las células separándolas de las placas con tripsina-EDTA durante cinco minutos a 37 grados centígrados. Apague la tripsina-EDTA utilizando el doble de su volumen con KSR-N2.

Y centrifugar a 200 veces g durante cinco minutos. Filtre las células a través de un tubo de filtro de 40 micras para eliminar los grumos. A continuación, vuelva a colocar las células a 250.000 células por centímetro cuadrado en N2-KSR que contenga FGF2, IGF1 e Y27632 con SHH.

En DD10, cambie el medio con KSR-N2 que contenga SHH. Lave las células una vez con PBS sin calcio y magnesio, y agregue reactivo de disociación celular precalentado, que no contiene tripsina, que contiene DNasa a las células. Colóquelos en la incubadora a 37 grados centígrados durante 10 a 30 minutos, o hasta que las celdas se hayan desprendido.

Luego, golpee suavemente las placas cada cinco minutos para ayudar a la disociación. En DD5, cambie el medio con KSR-N2 que contenga FGF2 e IGF1. A continuación, prepare las placas de cultivo de tejidos para volver a colocar en DD8.

En DD7, cambie el medio con KSR-N2 que contenga FGF2 e IGF1. En DD8, replatee las células con un agonista suavizado y agregue un inhibidor de PKC atípico. En DD10, cambie el medio con KSR-N2 que contenga aPKCi.

En DD11, separe las celdas de las placas para FACS. Si las celdas no se separaron para FACS en DD11, cambie el medio en DD12 con KSR-N2 que contenga aPKCi. En DD14, cambie el medio con KSR-N2 que contenga aPKCi.

Y en DD16, cambie el medio con KSR-N2 que contenga aPKCi. A continuación, en DD17, recoja las células positivas Nkx-2.1:mCherry. A continuación se muestran las imágenes representativas de la inmunotinción para Nkx2.1, Nkx2.1:mCherry y Lhx6:GFP de un cultivo de día 12 de diferenciación.

Tenga en cuenta que estas imágenes son canales superpuestos desde el mismo campo de visión. Este gráfico muestra la cuantificación del porcentaje promedio de núcleos positivos para DAPI que expresan Nkx2.1 en DD12 en cultivo. Y este es un gráfico FACS representativo, que muestra las cuatro poblaciones celulares diferentes que se pueden aislar utilizando nuestra línea mESC reportera dual.

Tenga en cuenta que mCherry está en el eje x y GFP está en el eje y. Por lo tanto, el cuadro superior derecho representa las células que son mCherry-GFP doble positivo. Este es el curso temporal de la inducción de Nkx2.1:mCherry y Lhx6:GFP de DD6 a 16, expresado como el porcentaje de células en cultivo que solo expresan mCherry, solo expresan GFP o coexpresan mCherry-GFP.

Una vez dominado, este protocolo puede completarse en un plazo de 17 días desde el principio hasta el final, si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que siempre debe comenzar con células madre pleuripotentes, indiferenciadas y de apariencia saludable. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como el trasplante en neocorteza de ratón neonatal o adulto, con el fin de responder preguntas adicionales sobre la determinación del destino de las interneuronas o el efecto del trasplante de interneuronas en la función de los circuitos y el comportamiento de los animales.

Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la neurociencia del desarrollo exploraran los factores que impulsan la determinación del destino de las interneuronas en ratones y, por extensión, en pacientes afectados por trastornos relacionados con las neuronas. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo derivar progenitores que expresan Nkx2.1 y su progenie postmitótica a partir de células madre embrionarias de ratón. Gracias por mirar y buena suerte con tus experimentos.