Polikistik Böbrek Hastalığı Olan İnsanlar ve Fareler kromozom anomalileri Eğitim Spektral Karyotipik

Bu prosedürün amacı, farelerde ve polikistik böbrek hastalığı olan insanlarda kromozom anormalliklerini ve ayrışma kusurlarını tanımlamak için kromozomları boya probları ile etiketlemektir. Bu, önce farelerde insanlardan hücrelerin toplanması ve smid ile muamele edilmesi, ardından cam slaytlar üzerinde metafaz yayılımlarının sabitlenmesi ve hazırlanmasıyla gerçekleştirilir. Daha sonra, slayt, hibridizasyona müdahale edebilecek ekstra RNA ve sitoplazmayı çıkarmak için ön işleme tabi tutulur.

Bu, sırasıyla RNA'lar ve pepsin ile sindirim yoluyla yapılır. Daha sonra kromozom ve prob denatürasyonu gerçekleştirilir, ardından kromozomları etiketlemek için hibridizasyon yapılır. Son adım, probun floresan boyalarla algılanmasıdır.

Sonuç olarak, floresan, mikroskopi ve Skyview yazılımı ile görüntü yakalama ve analiz yoluyla kromozom sayısal ve yapısal anormallikleri gösteren sonuçlar elde edilebilir. Bu tekniğin klasik GİM bükme teknikleri gibi mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, klasik bükme teknikleriyle karakterize edilemeyen kromozomal translokasyonlar ve karmaşık kromozomal yeniden düzenleme gibi karmaşık kromozomal anormallikler hakkında ek bilgi sağlamasıdır. Bu yöntem, kistik böbrek oluşumunun mekanizması gibi polikistik böbrek hastalığı alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.

Prosedürü gösteren Dr.Wiam Abu, laboratuvarımızdan yetenekli bir kıdemli postdoc'a izin verecek DMEM'de %10 ila 15 fetal sığır serumu ve %1 penisilin streptomisin içeren al endotel hücrelerine 37 santigrat derecede ve hücreler %70 ila 80 birleşime ulaşana kadar %5 karbondioksit başlatacaktır. Daha sonra hücreleri, önce hücreleri hasat etmek için hasattan önce 37 santigrat derecede 30 ila 60 dakika boyunca mililitre başına 0.05 miligramlık bir nihai konsantrasyonda Cole çözeltisi ile muamele edin, 50 mililitrede yüzen hücreleri içeren ortamı toplayın. Steril fo santrifüj tüpleri.

Bir ila iki dakika steril gezilerle inkübe ettikten sonra plaka üzerindeki hücreleri bir kez steril PBS ile durulayın, kalan hücreleri aynı tüpe toplayın ve toplayın. Hücreleri beş dakika boyunca dakikada 1000 dönüşte santrifüjleme ile peletledikten sonra, peletin üzerinde yaklaşık 0,5 mililitre bırakarak tüpten sate'nin çoğunu aspire edin. Tüpü hafifçe vurarak hücre peletini gevşetin.

Daha sonra, pelet boyutuna bağlı olarak, damıtılmış suya beş ila 10 mililitre %0.56 potasyum klorür içeren bir hipertonik çözelti ekleyin ve süspansiyonu 30 ila 45 dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. İnkübasyonun ardından, bir mililitre hipertonik hücre süspansiyonu başına bir damla buz gibi fiksatif solüsyon eklemek için bir mililitrelik küçük bir pipet kullanın. Daha sonra, hücreleri dakikada 1.200 dönüş hızında beş dakika santrifüjledikten sonra karıştırmak için tüpü hafifçe ters çevirin.

Supinate'i daha önce olduğu gibi aspire edin. Ardından, peleti hafifçe vururken yavaşça bir mililitre taze fiksatif solüsyon ekleyin. Ardından, tüpün duvarına yavaşça dört mililitre daha sabitleyici ekleyin.

Bu prosedür, metafaz yayılımlarının hücre kümeleri içinde sıkışıp kalmamasını sağlamak için kritik öneme sahiptir. Santrifüjleme adımını tekrarladıktan ve süpernatanı aspire ettikten sonra, fiksatifi tüpün duvarlarından yavaşça pipetleyerek beş ila 10 mililitre fiksatifi değiştirin. Bu aşamada, hücreler kısa süreli için eksi 20 santigrat derecede veya uzun süreli depolama için eksi 80 santigrat derecede sıkılaştırılmış ve sızdırmaz bir tüpte devam etmeye hazır olana kadar saklanabilir.

Devam etmeye hazır olduğunuzda, hücre hazırlığındaki metafaz kromozomlarının sayısını kontrol edin. Slaytı mutlak etanol içinde temizleyin. Daha sonra, sürgünün yüzeyinde bir su kılıfı oluşturmak için sürgüyü yaklaşık 10 kez damıtılmış suya batırın, slaytı bir cam plakaya yerleştirin ve sürgünün 10 inç yukarısından 15 ila 20 mikrolitre hücre süspansiyonu bırakın.

Slaytı bir ila iki dakika boyunca 65 ila 70 santigrat dereceye ayarlanmış bir su banyosuna yerleştirin ve kurumasını bekleyin, 10 kez ve 40 kez kuru hedefleri kullanarak slaytı ışık mikroskobu altında kontrol edin. Metafaz kromozomları olduğundan ve yayılmaların eşit aralıklarla yerleştirildiğinden emin olun. Kromozomları çevreleyen sitoplazmayı kontrol edin.

Burada görüldüğü gibi sitoplazma varsa, slayt ön tedavisine devam edin. Sitoplazma yoksa ve kromozomlar iyi bir morfolojiye sahipse, mililitre başına 20 miligramlık taze hazırlanmış bir ila 200 çözeltinin 120 mikrolitresinde slayt ön işlemine gerek yoktur. RNA çözeltisi, 24 milimetreye 60 milimetrelik bir kapak camına iki kez SSC'de çözülür.

Metafaz sürgüsünü kapak camı üzerinde yüzü aşağı bakacak şekilde ters çevirin. Ardından metafaz sürgüsünü yüzü yukarı bakacak şekilde yavaşça ters çevirin. Slaytı nemlendirilmiş bir odanın içine yerleştirin ve 45 dakika boyunca 37 santigrat derece inkübe edin.

Kuluçka süresi geçtikten sonra, sürgüyü çizmeden ve iki kez yıkamadan, SSC tamponunu bir kaplin kavanozunda üç kez, her biri çalkalanarak beş kez dikkatlice çıkarın. Bu arada, damıtılmış suda mililitre başına beş ila 15 mikrolitre 100 miligram pepin ekleyin ve ardından 37 santigrat dereceye kadar 100 mililitre 0.01 molar hidroklorik asit ön ısıtma ekleyin. PEP'leri önce temiz behere eklemek önemlidir, aksi takdirde çözülmez.

Bu çözeltiyi bir coplan kavanozuna aktarın. Yıkama sürgüsünü, sindirimden sonra üç ila beş dakikadan daha uzun süre bağlantı kavanozunda 37 santigrat derecede inkübe edin. Slaytı, bir XPBS içeren bir copin kavanozunda, her biri çalkalanarak beş dakika boyunca iki kez yıkayın.

Bunu, magnezyum klorür ile takviye edilmiş PBS içeren bir copin kavanozunda beş dakikalık bir yıkama ile takip edin. Daha sonra% 1 formaldehit içeren bir copin kavanozunda 10 dakikalık bir inkübasyon, ardından beş dakika boyunca bir XPBS içeren bir cochin kavanozunda son bir yıkama. Ardından, her biri iki dakika boyunca %70, %80 ve %100'lük bir dizi etanol içeren kayar cochin kavanozlarını kurutun ve ardından havayla kurutun.

Slaytların düzgün bir şekilde sedildiğinden, sitoplazma bulunmadığından ve kromozom morfolojisinin korunduğundan emin olmak için slaytı 40 kez kuru bir lens kullanarak ışık mikroskobu altında gözlemleyin. Son olarak, elmas kalem kullanarak hibridizasyon için bir alan seçin. Denatüre edici solüsyonu taze olarak hazırladıktan sonra, bir copin kavanozuna koyun ve bir su banyosunda 70 santigrat dereceye

Daha sonra slaytı, Prewarm denatüre edici solüsyonu içeren cochin kavanozuna, 70 santigrat derecede bir su banyosunda 30 saniye ila bir dakika boyunca yerleştirin. İnkübasyonun ardından slaytı hemen buz gibi, üç dakika boyunca %70 etanole, ardından her biri üç dakika boyunca %80 ve %100 etanole koyun ve ardından havayla kurutun. Kromozom morfolojisi, yüzünde açık veya parlak görünmeyen koyu kromozomların görünümü için slaydı inceleyin.

İyi kromozom veya morfolojiyi belirtir. Gök boyasını ısıtın. 20 dakika çalkalayarak 37 santigrat derecede araştırın.

Daha sonra dakikalar boyunca 1000 dönüşte kısaca girdap ve santrifüj edin. Birkaç saniye boyunca, probu beş dakika boyunca 85 santigrat derecede bir termosiklatör içinde denatüre edin, ardından 37 santigrat derecede inkübe edin. Bir saat boyunca, hibridizasyon alanına 10 mikrolitre denatüre prob uygulayın ve 22 milimetreye 40 milimetrelik bir kapak camı ile örtün.

Hava kabarcıklarını hapsetmediğinizden emin olarak, kapak camının kenarlarını kauçuk çimento ile kapatın, ardından nemlendirilmiş bir odada 37 santigrat derecede 48 ila 72 saat inkübe edin. Kapak camını dikkatlice çıkarın ve sürgüyü, savaş öncesi 45 santigrat dereceye kadar ısıtılmış taze hazırlanmış yıkama solüsyonu içeren bir bağlantı kavanozuna yerleştirin. Dakikada 45 devirde çalkalanan bir su banyosunda 45 santigrat derecede üç kez beş dakika yıkayın.

Daha sonra slaytları iki kez yıkama solüsyonunda, ikisi 45 santigrat derecede, her biri beş dakika çalkalanarak, ardından beş dakika yıkama solüsyonunda, 45 santigrat derecenin üçü çalkalanarak yıkayın. Ardından, 80 mikrolitre bloke edici reaktif uygulayın. Ardından bir kapak camı ve inkübatörü 30 dakika boyunca 37 santigrat derece yerleştirin.

Kapak camını çıkarın ve sıvının boşalmasına izin verin. 80 mikrolitre bilim kurgu boyama reaktifi uygulayın. Bir kapak camı ve inkübatörü 40 dakika boyunca 37 santigrat derece uygulayın İnkübasyondan sonra, slaytı üç kez çalkalayarak üç kez 45 santigrat derece yıkama solüsyonu ile beş dakika yıkayın.

Ardından, 80 mikrolitre PS 5.5 boyama reaktifi uygulayın. İnkübasyondan sonra 40 dakika boyunca 37 santigrat derece bir kapak camı ve inkübatör yerleştirin, üç kez yıkama solüsyonu ile yıkayın, daha önce olduğu gibi. Son olarak, sürgüyü eğin ve sıvının boşalmasına izin verin.

20 mikrolitre Antifa dappy reaktifi uygulayın ve 24 milimetreye 60 milimetrelik bir mikroskop yerleştirin. Camı örtün, slaytlar oluşturmuş olabilecek hava kabarcıklarını dikkatlice çıkarın, hemen görüntülenebilir veya karanlıkta dört santigrat derecede bir haftadan fazla saklanamaz. Yabani tip bir fareden yayılan normal bir metafazın bu gökyüzü görüntüsü, 60 kez yağa daldırma lensi ile donatılmış bir Olympus mikroskobu kullanılarak yakalandı.

Spektral küp olarak bilinen özel olarak tasarlanmış üç bantlı geçiren bir filtre, şık bir filtre ve CCD kameralı bir kese interferometre modülü. Spektral karyotipler skyview yazılımı kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Sol üst panel, etiketli metafaz yayılımını gösterir ve sağ üst panel, formanın parlak alan görüntüsünü gösterir.

Alt panel, skyview yazılımı kullanılarak artan düzende sıralanmış kromozomu gösterir. Bir pkd tek homozigot nakavt fareden yayılan bir metafazın bu gökyüzü görüntüsü, 40 yerine 68 kromozomun bulunduğu anormal kromozom sayısını gösterir. Ayrıca, kromozom sekizinin silinmesi ve kromozom veya translokasyonlar gibi kromozom anormallikleri veya kromozomlar beş ile 16 arasındaki kromozomlar ve ayrıca kromozomlar 11 ve 19 arasındaki kromozomlar da görülebilir.

A-D-P-K-D olmayan bir hastanın vasküler dokusundan insan kromozomlarının metafaz yayılımının bu gökyüzü görüntüsü, 44 otozom ve iki XXX kromozomunun normal kadın karyotipine sahiptir. Bu son gökyüzü görüntüsü, 88 otozom ve dört XXXX cinsiyet kromozomundan oluşan anormal bir karyotipe sahip bir A-D-P-K-D hastasının vasküler dokusundan yayılan bir metafazı göstermektedir. Bir usta.

Bu teknik, uygun şekilde uygulandığı takdirde beş gün içinde yapılabilir.