Name: Çoklu Floresan Inter-kromozomal Kararlı sapmaları Algılama In Situ Hibridizasyon (mFISH) ve ışınlanmış Farelerde Spektral Karyotipik (SKY) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 14 s
Description: Öğrenin, fare kemik iliği hücrelerinde mFISH ve SKY teknikleriyle radyasyon kaynaklı interkromozomal kararlı sapmaları nasıl tespit edeceğinizi. Bu yöntem, genetik hasarın görselleştirilmesi için değerli bir araçtır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma Ulusal Havacılık ve Uzay Dairesi aracılığıyla Arkansas Uzay Grant Konsorsiyumu ve Ulusal Uzay Biyomedikal Araştırma Enstitüsü tarafından desteklenen, hibe NNX15AK32A (RP) ve RE03701 (MH-J), ve P20 GM109005 (MH-J) ve US Veterans Administration ( MH-J). Biz yazının hazırlanmasında editoryal yardım için Christopher Fettes, Arkansas Tıbbi Bilimler Üniversitesi Çevre ve İş Sağlığı Bölümü Program Koordinatörü, teşekkür ederim.

Tüm hayvan çalışmaları Ulusal Sağlık Enstitüleri Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanım Kılavuzu önerileri ile tam uyum içinde gerçekleştirilmiştir. hayvan protokolü Arkansas Tıbbi Bilimler Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylandı. temiz hava ve standart kemirgen yiyecek ve suya serbest erişim 15 saatlik döngüler - Bütün hayvanlar 10 ile 20 ± 2 ° C&#39;de standart klimalı hayvan tesis altında tutuldular. Girişte, fareler 1 hafta karantinada tutulan ve sertifikalı kemirgen yemi verilmiştir. 1.Radiation Pozlama ve Metafaz Hücreler Vivo Arrest olarak <ol><li> Açığa bir ışınlama odasında 2 Gy tüm vücut radyasyona fareler un-anestezi. ışınlama sırasında, iyi havalandırılan bir tutma odasında yer fareler serbestçe hareket ve düzgün bir doz almıyorsunuz emin olmak için. </li><li> % 0.05 kolşisin solüsyonu 100 mcL enjekte edilir (ckalsiyum ve magnezyum serbest PBS içinde çözülmüş olchicine toz) karın içinden 1 ml tek kullanımlık şırınga ile eklenmiş 25 G iğne kullanılarak. herhangi bir organ doğrudan enjeksiyon kaçının. </li><li> kemik iliği hücre hasat önce 2 saat için hücre hayvan bırakın. ağrı veya sıkıntı herhangi bir işaret için hayvan gözlemleyin. </li></ol> 2. kemik iliği hücre hasat ve yoğunluk dereceli santrifüj ile kemik iliği Mononükleer Hücreleri İzolasyon <ol><li> CO 2 boğulma fare Euthanize. </li><li> dorsal ve ventral tarafta% 70 etanol püskürtün. </li><li> keskin bir makas ile karın derisi üzerinde 2 cm kesi olun. künt cımbız ile kesi her iki tarafında cilt tutun ve yavaşça karın kasları çekerek açın. </li><li> makasla her iki arka bacaklarını kesti ve hemen% 4 FBS ile önceden soğutulmuş PBS koyun. </li><li> Dikkatle keskin bir jilet ve pamuk gazlı bez bandaj ile arka bacak bağlı tüm kasları temizleyin. </li><li> femur tibia ayırın. Bir traş bıçağı ile her kemiğin her iki ipuçları Trim. </li><li> 3 ml&#39;lik bir şınngaya bağlanmış bir 23 G iğne kullanılarak (% 4 FBS), 3 ml PBS ile kemik iliği muhtevasını temizlemek ve 15 ml santrifüj tüpüne içerik toplamak. tek bir hücre süspansiyonu yapmak için iğne ile hücre süspansiyonu en az 10 kez geçmek. </li><li> Dikkatle hücre süspansiyonu ve lenfosit ayırma ortamı arasındaki arayüzü bozmadan lenfosit ayırma ortamı (3 mL) ve eşit hacimde hücre süspansiyonu kaplar. Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca 400 x g&#39;de santrifüjleyin. </li><li> yeni bir 15 ml santrifüj tüpüne diğer katmanları ve transfer bozmadan dikkatlice buffy coat toplayın. </li></ol> Metafaz Hücre Spread 3. hazırlanması <ol><li> ince beyaz tabakayı içeren bir tüpe 10 ml PBS ilave edin. </li><li> Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 400 x g&#39;de santrifüjleyin. </li><li> Dikkatle süpernatant kaldırmak. Sonra t break upo nazik dokunarak ile pelet hücre ve 10 ml PBS ekleyin. </li><li> Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 400 x g&#39;de santrifüjleyin. </li><li> Hücre pelletini bozmadan süpernatantı pelet kırmak ve önceden ısıtılmış hipotonik 0.075 M potasyum klorür çözeltisi 4 ml. Nazik sabit sallayarak damla hipotonik solüsyon damla ekleyin. </li><li> Bir su banyosu içinde 37 ° C&#39;de 20 dakika boyunca inkübe hücreleri. </li><li> (: Buzlu asetik asit, 3: metanol 1 h / h) hipotonik tedaviden sonra, sabitleyici eşit hacimde (4 mL) ekleyin 15 ml bir tüp içinde ve tersini tüp yavaşça karıştırın. </li><li> Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 400 x g&#39;de santrifüj ve supernatant atın. </li><li> bir kaç saniye için hafifçe girdap ardından kılavuz çekme ile hücre pelletini parçalamak ve sabit şekilde çalkalanarak damla sabitleyici çözeltisi damla 3 ml. </li><li> Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübe edin ve daha sonra 5 dakika boyunca 400 x g&#39;de santrifüj. </li><li> Süpernatantı gent ile hücre pelet kırmakle dokunarak ve 3 ml taze fiksatif ekleyin. </li><li> Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 400 x g&#39;de santrifüj ve supernatant çıkarın. nazik dokunarak hücre pelet kadar Break ve taze 3 ml fiksatif ekleyin. </li><li> Adımı yineleyin 3.12 kez daha fazla. </li><li> Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 400 x g&#39;de santrifüj ve hücre topağı bozmadan supernatant çıkarın. Ardından 600 uL fiksatif ile 400 ekleyebilir ve pipetleme ile iyice karıştırın. </li><li> 45 ° açıyla eğimli ön temizlenir ve ıslak slaytlar üzerine 30 ul sabit hücrelerin damla ve tamamen bir gecede havada kurumaya slaytlar izin verir. </li></ol> mFISH tarafından 4. Fare Kromozom Boyama <ol><li> kromozom denatürasyonu <ol><li> Oda sıcaklığında 2 dakika için 2X SSC metafaz hücre yayılır içeren slayt yerleştirin. </li><li> % 70 2 dakika her biri,% 80 ve% 100, seri etanol yıkanarak slayt kurutmak. 65 ° C&#39;de 60 dakika boyunca inkübe edin. </li><li> Ön ısıtma 40 ml denatürasyon çözeltisi (% 70 formamid / 2 x SS° C; 30 dakika boyunca, bir cam kavanoz içinde Coplin 70 ° C (± 2 ° C), pH 7.0). 1.5 dakika - 1 için önceden ısıtılmış denatürasyon çözeltisi slayt inkübe edilerek kromozom denatüre. </li><li> 2 dakikalık denatürasyon işlemini durdurmak için hem de yeniden tavlama ile ilgili denatüre kromozom önlemek için buz soğukluğunda% 70 etanol içinde hemen slayt söndürün. Daha sonra 2 dakika süreyle% 80 etanol ile yıkanarak dihidrat. 2 dakika boyunca% 100 etanol ile etanol yıkama tekrarlayın. Tamamen oda sıcaklığında slayt kurulayın. </li></ol></li><li> Denatürasyon ve Probe Karışımı Hibridizasyon <ol><li> Kısaca, üretici tarafından sağlanan prob karışımı santrifüj, 7 dakika boyunca bir su banyosu içinde 80 ° C (± 2 ° C) inkübe edilerek kap santrifüj tüpü ek 500 mcL prob karışımı 10 ul transfer ve denatüre. </li><li> 10 dakika boyunca 37 ° C&#39;de bir su banyosu içinde prob karışımı ile santrifüj tüpü yerleştirin. </li><li> denatüre chromoso ile slayt üzerine denatüre prob karışımı uygulayınmes. </li><li> Dikkatle 18 mm x 18 mm cam kapak slip ile alanı kapsayacak ve çok yavaşça kaymasına kapak kayma basarak herhangi bir görünür hava kabarcıklarını ortadan kaldırır. Kauçuk çimento ile kapak kayma dört tarafı kapatın ve hibridizasyon için nemli bir oda içinde 37 ° C&#39;de karanlıkta, 16 saat, 12 saat süre ile inkübe edilir. </li></ol></li><li> Mesaj Hibridizasyon Yıkama ve Algılama <ol><li> Dikkatle kauçuk çimento ve kapak kayma çıkarın. </li><li> 5 dakika boyunca 74 ° C (± 2 ° C) önceden ısıtılmış 0.4x SSC yeri slayt. </li><li> 2 dakika boyunca yıkama çözeltisi II (4x SSC /% 0.1 Tween-20) yıkayın kayar. </li><li> DAPI karşıt (1.5 ug / mL) ile anti-solmaya montaj orta 20 mcL ve bir cam kapak ile kaplayın. hafifçe laboratuvar dokusu ile lamel basın hava kabarcıkları ve aşırı montaj çözüm kaldırmak için. oje ile lamel kenarları mühür. </li><li> uygun filtreler ile donatılmış bir floresan mikroskop kullanılarak Görünüm slaytlar. </li></ol></li&gt; </ol> 5. Spektral Karyotipleme Fare Kromozomlar (SKY) <ol><li> Kromozom ve Probe denatürasyonu <ol><li> çalkalamadan, 2 dakika süre ile, oda sıcaklığında 2 x SSC, slayt dengelenmesi. </li><li> Oda sıcaklığında 2 dakika her biri için, bir etanol seri slayt (% 70,% 80 ve% 100 etanol) kurutmak. Tamamen etanolü çıkarmak için slayt hava-kurutun. </li><li> Sıcak 40 ml denatürasyon çözeltisi (% 70 formamid / 2 x SSC, pH 7.0), 30 dakika için bir cam Coplin kavanoz. </li><li> 1 ila 1.5 dakika süreyle önceden ısıtılmış denatürasyon çözeltisi slayt inkübe edin. </li><li> 2 dk denatürasyon işlemini durdurmak için hem de yeniden tavlama gelen denatüre kromozom önlemek için hemen buz gibi soğuk% 70 etanol içine slayt batırmayın. </li><li> Oda sıcaklığında 2 dakika boyunca% 100 etanol içinde, daha sonra 2 dakika süreyle% 80 etanol içine yerleştirerek ve slayt kurutmak. </li><li> 80 ° C (± 2 ° C) ayarlanmış bir su banyosu içinde sky prob (üretici tarafından sağlanan flakon # 1) denatüre7 dakika boyunca, ve sonra hemen, 10 dakika boyunca 37 ° C&#39;ye kadar, farklı bir su banyosuna yerleştirin. </li></ol></li><li> Probe Melezleme <ol><li> denatüre kromozomlar üzerine denatüre SKY probu 10 mcL ekleyin. </li><li> hava kabarcıkları lamel altında sıkışıp böylece dikkatle SKY prob üzerine 18 mm x 18 mm cam lamel yerleştirin. </li><li> lastik çimento ile lamel kenarları mühür. </li><li> nemli bir ışık geçirmeyen bölme slayt yerleştirin ve 36 saat, 24 saat boyunca 37 ° C&#39;de karanlıkta inkübe edilir. </li></ol></li><li> Sonrası hibridizasyon yıkama ve floresans saptama <ol><li> lamel bozmadan çok dikkatli kauçuk çimento çıkarın. </li><li> sabit şekilde çalkalanarak 5 dakika boyunca 72 ° C (± 2 ° C) önceden ısıtılmış, hızlı yıkama çözeltisi (0.4x SSC) içinde slayt yerleştirin. Yıkama çözeltisi III (4x SSC /% 0.1 Tween 20) içine slayt daldırın ve çalkalanarak 1 dakika inkübe edilir. </li><li> İsteğe bağlı: engelleme reaktif 80 uL ekleyinmelezleşme alanı üzerine (üretici tarafından sağlanan flakon # 2), 24 mm x 60 mm plastik lamel ve nemlendirilmiş odacıkta 30 dakika boyunca 37 ° C&#39;de karanlıkta inkübe edilir. </li><li> Yavaşça plastik lamel kaldırmak ve 5 dakika boyunca önceden ısıtılmış (45 ºC) yıkama solüsyonu III slayt yıkayın. </li><li> 80 uL Cy5 boyama reaktif (üretici tarafından sağlanan flakon # 3) uygulanır, 24 mm x 60 mm plastik lamel ve nemlendirilmiş bir odada 40 dakika süreyle karanlıkta 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> içeren bir cam Coplin kavanoza slayt Dip önceden ısıtılmış (45 ° C) yıkama çözeltisi III (4x SSC /% 0.1 Tween 20) ile çalkalanarak 2 dakika için bir su banyosu içinde 45 ° C&#39;de inkübe edin. Bu yıkama adımı 3 kez tekrarlayın. </li><li> 80 uL Cy5.5 boyanması reaktifi (üretici tarafından sağlanan flakon # 4) uygulanır, 24 mm x 60 mm plastik lamel ve nemlendirilmiş bir odada 40 dakika süreyle karanlıkta 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> (Önceden ısıtılmış ile slayt 3 kere yıkayın45 ºC) yıkama solüsyonu III. </li><li> Fazla sıvıyı boşaltmak için bir kağıt havlu karşı eğik pozisyonda slayt tutun. 20 uL, anti-solmaya DAPI ayıracı (üretici tarafından sağlanan flakon # 5) ekleyin ve dikkatlice hava kabarcıklarını tanıtan olmadan 24 mm x 60 mm cam lamel yerleştirin. oje ile lamel kenarları mühür ve SKY görüntüleri yakalamak için donatılmış bir Epifloresans mikroskop ile gözlemlemek. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Kodama, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+chromosome+aberrations+in+atomic+bomb+survivors%3A+results+from+25+years+of+investigation%5BTitle%5D)+AND+%22Radiat+Res%22%5BJournal%5D)">Stable chromosome aberrations in atomic bomb survivors: results from 25 years of investigation.</a> Radiat Res. 156, 337-346 (2001).</li>
<li>Lucas, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytogenetic+signature+for+ionizing+radiation%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Radiat+Biol%22%5BJournal%5D)">Cytogenetic signature for ionizing radiation.</a> Int J Radiat Biol. 73, 15-20 (1998).</li>
<li>Zaccaria, A., Barbieri, E., Mantovani, W., Tura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome+radiation-induced+aberrations+in+patients+with+Hodgkin%27s+disease.+Possible+correlation+with+second+malignancy%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Boll.+Ist.+Sieroter.+Milan%22%5BJournal%5D)">Chromosome radiation-induced aberrations in patients with Hodgkin's disease. Possible correlation with second malignancy?</a> Boll. Ist. Sieroter. Milan. 57, 76-83 (1978).</li>
<li>Fisher, N. L., Starr, E. D., Greene, T., Hoehn, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utility+and+limitations+of+chromosome+banding+in+pre-+and+postnatal+service+cytogenetics%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Med+Genet%22%5BJournal%5D)">Utility and limitations of chromosome banding in pre- and postnatal service cytogenetics.</a> Am J Med Genet. 5, 285-294 (1980).</li>
<li>Hande, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complex+chromosome+aberrations+persist+in+individuals+many+years+after+occupational+exposure+to+densely+ionizing+radiation%3A+an+mFISH+study%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Chromosomes.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Complex chromosome aberrations persist in individuals many years after occupational exposure to densely ionizing radiation: an mFISH study.</a> Genes Chromosomes. Cancer. 44, 1-9 (2005).</li>
<li>Gall, J. G., Pardue, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+and+detection+of+RNA-DNA+hybrid+molecules+in+cytological+preparations%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Formation and detection of RNA-DNA hybrid molecules in cytological preparations.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 63, 378-383 (1969).</li>
<li>Bauman, J. G., Wiegant, J., Borst, P., van, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+method+for+fluorescence+microscopical+localization+of+specific+DNA+sequences+by+in+situ+hybridization+of+fluorochromelabelled+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">A new method for fluorescence microscopical localization of specific DNA sequences by in situ hybridization of fluorochromelabelled RNA.</a> Exp Cell Res. 128, 485-490 (1980).</li>
<li>Hopman, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bi-color+detection+of+two+target+DNAs+by+non-radioactive+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry%22%5BJournal%5D)">Bi-color detection of two target DNAs by non-radioactive in situ hybridization.</a> Histochemistry. 85, 1-4 (1986).</li>
<li>Nederlof, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-color+fluorescence+in+situ+hybridization+for+the+simultaneous+detection+of+multiple+nucleic+acid+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Three-color fluorescence in situ hybridization for the simultaneous detection of multiple nucleic acid sequences.</a> Cytometry. 10, 20-27 (1989).</li>
<li>Nederlof, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+fluorescence+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Multiple fluorescence in situ hybridization.</a> Cytometry. 11, 126-131 (1990).</li>
<li>Szeles, A., Joussineau, S., Lewensohn, R., Lagercrantz, S., Larsson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+spectral+karyotyping+%28SKY%29+in+biodosimetry+for+the+triage+situation+following+gamma+irradiation%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Radiat+Biol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of spectral karyotyping (SKY) in biodosimetry for the triage situation following gamma irradiation.</a> Int J Radiat Biol. 82, 87-96 (2006).</li>
<li>Camparoto, M. L., Ramalho, A. T., Natarajan, A. T., Curado, M. P., Sakamoto-Hojo, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translocation+analysis+by+the+FISH-painting+method+for+retrospective+dose+reconstruction+in+individuals+exposed+to+ionizing+radiation+10+years+after+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat.+Res%22%5BJournal%5D)">Translocation analysis by the FISH-painting method for retrospective dose reconstruction in individuals exposed to ionizing radiation 10 years after exposure.</a> Mutat. Res. 530, 1-7 (2003).</li>
<li>Edwards, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+critique+of+%27Collaborative+exercise+on+the+use+of+FISH+chromosome+painting+for+retrospective+biodosimetry+of+Mayak+nuclear-industrial+personnel%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Radiat+Biol%22%5BJournal%5D)">A critique of 'Collaborative exercise on the use of FISH chromosome painting for retrospective biodosimetry of Mayak nuclear-industrial personnel.</a> Int J Radiat Biol. 78, 867-871 (2002).</li>
<li>Bauchinger, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collaborative+exercise+on+the+use+of+FISH+chromosome+painting+for+retrospective+biodosimetry+of+Mayak+nuclear-industrial+personnel%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Radiat+Biol%22%5BJournal%5D)">Collaborative exercise on the use of FISH chromosome painting for retrospective biodosimetry of Mayak nuclear-industrial personnel.</a> Int J Radiat Biol. 77, 259-267 (2001).</li>
<li>Hieber, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosomal+rearrangements+in+post-Chernobyl+papillary+thyroid+carcinomas%3A+evaluation+by+spectral+karyotyping+and+automated+interphase+FISH%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Chromosomal rearrangements in post-Chernobyl papillary thyroid carcinomas: evaluation by spectral karyotyping and automated interphase FISH.</a> J Biomed. Biotechnol. 2011, 693691(2011).</li>
<li>Cohen, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((detection+of+chromosome+rearrangements+in+two+cases+of+tMDS+with+a+complex+karyotype%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Genet+Cytogenet%22%5BJournal%5D)">detection of chromosome rearrangements in two cases of tMDS with a complex karyotype.</a> Cancer Genet Cytogenet. 138, 128-132 (2002).</li>
<li>Pathak, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Vitamin+E+Analog+Gamma-Tocotrienol+%28GT3%29+Suppresses+Radiation-Induced+Cytogenetic+Damage%5BTitle%5D)+AND+%22Pharm+Res%22%5BJournal%5D)">The Vitamin E Analog Gamma-Tocotrienol (GT3) Suppresses Radiation-Induced Cytogenetic Damage.</a> Pharm Res. , (2016).</li>
<li>Spurbeck, J. L., Zinsmeister, A. R., Meyer, K. J., Jalal, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+chromosome+spreading%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Med+Genet%22%5BJournal%5D)">Dynamics of chromosome spreading.</a> Am J Med Genet. 61, 387-393 (1996).</li>
<li>Deng, W., Tsao, S. W., Lucas, J. N., Leung, C. S., Cheung, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+method+for+improving+metaphase+chromosome+spreading%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">A new method for improving metaphase chromosome spreading.</a> Cytometry A. 51, 46-51 (2003).</li>
<li>Hande, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Past+exposure+to+densely+ionizing+radiation+leaves+a+unique+permanent+signature+in+the+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">Past exposure to densely ionizing radiation leaves a unique permanent signature in the genome.</a> Am J Hum Genet. 72, 1162-1170 (2003).</li>
<li>Tug, E., Kayhan, G., Kan, D., Guntekin, S., Ergun, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evaluation+of+long-term+effects+of+ionizing+radiation+through+measurement+of+current+sister+chromatid+exchange+%28SCE%29+rates+in+radiology+technologists%2C+compared+with+previous+SCE+values%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat.+Res%22%5BJournal%5D)">The evaluation of long-term effects of ionizing radiation through measurement of current sister chromatid exchange (SCE) rates in radiology technologists, compared with previous SCE values.</a> Mutat. Res. 757, 28-30 (2013).</li>
<li>Kanda, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-fluorescent+chromosome+painting+using+the+peroxidase%2Fdiaminobenzidine+%28DAB%29+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Radiat+Biol%22%5BJournal%5D)">Non-fluorescent chromosome painting using the peroxidase/diaminobenzidine (DAB) reaction.</a> Int J Radiat Biol. 73, 529-533 (1998).</li>
<li>Kakazu, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+spectral+colour+banding+in+cytogenetic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Development of spectral colour banding in cytogenetic analysis.</a> Lancet. 357, 529-530 (2001).</li>
<li>Rithidech, K. N., Honikel, L., Whorton, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mFISH+analysis+of+chromosomal+damage+in+bone+marrow+cells+collected+from+CBA%2FCaJ+mice+following+whole+body+exposure+to+heavy+ions+%2856Fe+ions%29%5BTitle%5D)+AND+%22Radiat+Environ+Biophys%22%5BJournal%5D)">mFISH analysis of chromosomal damage in bone marrow cells collected from CBA/CaJ mice following whole body exposure to heavy ions (56Fe ions).</a> Radiat Environ Biophys. 46, 137-145 (2007).</li>
<li>Abrahams, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metaphase+FISHing+of+transgenic+mice+recommended%3A+FISH+and+SKY+define+BAC-mediated+balanced+translocation%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Metaphase FISHing of transgenic mice recommended: FISH and SKY define BAC-mediated balanced translocation.</a> Genesis. 36, 134-141 (2003).</li>
<li>Savage, J. R., Simpson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+scoring+of+FISH-%26%2334%3Bpainted%26%2334%3B+chromosome-type+exchange+aberrations%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat.+Res%22%5BJournal%5D)">On the scoring of FISH-&#34;painted&#34; chromosome-type exchange aberrations.</a> Mutat. Res. 307, 345-353 (1994).</li>
<li>Savage, J. R., Simpson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FISH+%22painting%22+patterns+resulting+from+complex+exchanges%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat.+Res%22%5BJournal%5D)">FISH "painting" patterns resulting from complex exchanges.</a> Mutat. Res. 312, 51-60 (1994).</li>
<li>Tucker, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PAINT%3A+a+proposed+nomenclature+for+structural+aberrations+detected+by+whole+chromosome+painting%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat.+Res%22%5BJournal%5D)">PAINT: a proposed nomenclature for structural aberrations detected by whole chromosome painting.</a> Mutat. Res. 347, 21-24 (1995).</li>
<li>Knehr, S., Zitzelsberger, H., Bauchinger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FISH-based+analysis+of+radiation-induced+chromosomal+aberrations+using+different+nomenclature+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Radiat+Biol%22%5BJournal%5D)">FISH-based analysis of radiation-induced chromosomal aberrations using different nomenclature systems.</a> Int J Radiat Biol. 73, 135-141 (1998).</li>
<li>Lucas, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+translocation+frequency+analysis+in+humans+decades+after+exposure+to+ionizing+radiation%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Radiat+Biol%22%5BJournal%5D)">Rapid translocation frequency analysis in humans decades after exposure to ionizing radiation.</a> Int J Radiat Biol. 62, 53-63 (1992).</li>
<li>Braselmann, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SKY+and+FISH+analysis+of+radiation-induced+chromosome+aberrations%3A+a+comparison+of+whole+and+partial+genome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat.+Res%22%5BJournal%5D)">SKY and FISH analysis of radiation-induced chromosome aberrations: a comparison of whole and partial genome analysis.</a> Mutat. Res. 578, 124-133 (2005).</li>
<li>Sokolova, I. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+a+multitarget%2C+multicolor+fluorescence+in+situ+hybridization+assay+for+the+detection+of+urothelial+carcinoma+in+urine%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Diagn%22%5BJournal%5D)">The development of a multitarget, multicolor fluorescence in situ hybridization assay for the detection of urothelial carcinoma in urine.</a> J Mol Diagn. 2, 116-123 (2000).</li>
<li>Lindholm, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biodosimetry+after+accidental+radiation+exposure+by+conventional+chromosome+analysis+and+FISH%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Radiat+Biol%22%5BJournal%5D)">Biodosimetry after accidental radiation exposure by conventional chromosome analysis and FISH.</a> Int J Radiat Biol. 70, 647-656 (1996).</li>
</ol>

Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

Birkaç kritik adımlar mFISH ve SKY başarısını belirler. İlk ve en önemli adım kemik iliği mononükleer hücrelerin in vivo mitotik tutuklama kolşisin tedavisi optimize etmektir. kolşisin konsantrasyonu ve tedavi süresi ayrı ayrı ya da konser etkili kromozom boyama mitotik indeksi yanı sıra kromozom yoğunlaşma iki önemli önkoşul belirler. Yüksek Kolşisin konsantrasyonu veya daha uzun tedavi süresi uygun denatürasyon ve hibridizasyon için uyumsuz son derece yoğun kromozom yol açar. Ayrıca, yoğunlaştırılmış kromozom...

Radyasyona bağlı kromozomal arası kararlı sapmaları tanımlamanın en güvenilir iki yöntemi, iki veya daha fazla kromozomun aynı anda boyanmasına izin veren çoklu floresan in situ hibridizasyon (mFISH) ve genomdaki her homolog kromozom çiftine farklı bir renk veren spektral karyotiplemedir (SKY). Kararsız sapmaların aksine, kararlı sapmalar doğası gereği kalıcıdır ve ışınlanmış popülasyonlarda1 birkaç nesil boyunca yayılabilir ve radyasyonun neden olduğu sitogenetik lezyonların2 kritik moleküler "imzaları" olarak kabul edilir. Çeşitli gruplar tarafından yapılan çalışmalar, stabil anormalliklerin kanser de dahil olmak üzere bir dizi hastalığın patogenezi ve gelişimi ile ilişkili olduğunu göstermiştir3. Kromozom boyama (moleküler sitogenetik olarak da adlandırılır) çağından önce, geleneksel G-bantlama tekniği, kararlı kromozomal sapmaları tespit etmek için tek yöntemdi. Bununla birlikte, kromozom bantlama sitogenetikçiler için bir zorluktur, çünkü çözünürlük sınırlıdır, tekrarlanabilirlik belirsizdir, emek yoğun bir prosedürdür ve güvenilir veri yorumlaması için çok yetenekli ve deneyimli sitogenetikçiler gerektirir4. Ayrıca, klasik bantlama tekniği, radyasyon hasarının ortak bir sonucu olan iki veya daha fazla kromozom arasında dağılmış üç veya daha fazla kırılmanın etkileşimini içeren karmaşık kromozomal yeniden düzenlemelerin saptanmasına izin vermez. Karmaşık anormallikler, radyasyona maruz kaldıktan yıllar sonra bireylerde devam edebilir ve bu da onları retrospektif biyodozimetri5 için yararlı kılar. Bu nedenle, stabil kromozomal yeniden düzenlemeleri tespit etmek için geleneksel bantlama tekniklerinin sınırlamalarının üstesinden gelmek için alternatif bir yaklaşım gerekliydi. 
1960'ların sonlarında, Gall ve Pardue'nun (1969) radyoaktif malzeme ile etiketlenmiş nükleik asit probları kullanılarak moleküler hibridizasyon üzerine öncü çalışması, kromozomlar6 üzerinde spesifik bir DNA dizisinin saptanmasına izin veren sitogenetik alanında yeni bir çağ başlattı. Bununla birlikte, moleküler hibridizasyon için radyoaktif probların kullanılmasının birkaç dezavantajı vardı: radyoaktif problar nispeten kararsızdır, prob aktivitesi kullanılan izotopun radyoaktif bozunmasına bağlıdır, hibridizasyon daha uzun sürer, çözünürlük sınırlıdır, problar nispeten maliyetlidir ve radyoaktif maddeler sağlık açısından tehlikelidir. Bu nedenle, radyoaktif olmayan probların geliştirilmesi ve tasarlanması gerekli hale geldi. 1980'lerde ve 1990'larda floresan etiketli nükleik asit problarının piyasaya sürülmesi, radyoaktif probların sınırlamalarının üstesinden geldi ve hibridizasyon tekniğinin7-10'un güvenliğini, hassasiyetini ve özgüllüğünü büyük ölçüde artırdı. Floresan problar, uygun uyarma ve emisyon filtreleri ile donatılmış floresan mikroskopları altında gözlemlendiğinde son derece parlak sinyallere yol açar. Floresan işaretli kromozomun veya kromozomun bir kısmının herhangi bir kaybı, kazanımı veya yeniden düzenlenmesi bu FISH tekniği ile kolayca tanımlanabilir.
Kromozomal sapmaların FISH boyama ile analizi, yıllar içinde sitogenetik araştırmalarda belirgin ilerlemeye yol açmıştır. Lokusa özgü problardan tüm kromozom boyama problarına kadar değişen özel uygulamalar için floresan etiketli probların tasarlanması, alanı önemli ölçüde ilerletmiştir; Bu aynı zamanda, geleneksel kromozom bantlaması ile mümkün olmayan submikroskobik ("kriptik") yeniden düzenlemenin tespitini de kolaylaştırmıştır. mFISH ve SKY ile yapılan kromozom boyamanın, basit ve karmaşık kromozomal yeniden düzenlemelerin tanımlanması için değerli araçlar olduğu kanıtlanmıştır. Her iki teknik için de temel prensipler benzerdir, ancak in situ hibridizasyondan sonra floresan sinyalin tespiti ve ayırt edilmesi yöntemi ve görüntü elde etme süreci farklıdır. mFISH'te, dört florokromun her birinin ayrı görüntüleri, dar bant geçiren mikroskop filtreleri kullanılarak yakalanır; Daha sonra görüntüleri birleştirmek için özel yazılım kullanılır. SKY'da ise görüntü elde etme, epifloresan mikroskobu, yük bağlantılı cihaz görüntüleme ve tüm görüntü noktalarında tek bir pozlama ile tüm emisyon spektrumunun ölçülmesine izin veren Fourier spektroskopisinin bir kombinasyonuna dayanır. Hem mFISH hem de SKY'da, tek renkli görüntüler bağımsız olarak yakalanır, daha sonra birleştirilir ve son olarak, her bir florokrom probuna bağlı spesifik boyaya dayalı olarak monokromatik görüntülerdeki kromozomlara benzersiz sahte renkler atanır.
mFISH ve SKY analizinin radyasyon biyolojisi alanındaki katkısı, özellikle insanların IR'ye (radyasyon biyodozimetrisi)11-14 maruz kalmasının retrospektif doz tahmini, radyasyon karsinogenezi risk değerlendirmesi15 ve radyoterapiye bağlı ikincil kanserin tespiti ve risk tahmini16 için dikkate değerdir. Fareler üzerinde yakın zamanda yapılan bir çalışma, FISH bazlı bir kromozom boyama tekniğinin de radyasyon karşı önlemi17'nin etkinliğini değerlendirmek için önemli bir araç olduğunu göstermiştir. Bu çalışmada, toplam vücut radyasyonuna maruz kalmanın farelerin kemik iliği hücrelerinde stabil kromozomal anormalliklerin indüksiyonu üzerindeki etkisi mFISH ve SKY teknikleri kullanılarak gösterilmiştir.

<table><tbody><tr><td>Formamid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221198-100ML</td><td></td></tr><tr><td>SSC Tamponu 20 kez; Fare</td> Uygulamalı Spektral Görüntüleme için Konsantre <td>Sigma-Aldrich</td><td>S6639-1L</td><td></td></tr><tr><td>SKY Laboratuvar Reaktifi</td><td></td><td>FPRPR0030/M40</td><td></td></tr><tr><td>CAD - Konsantre Antikor Tespit</td><td>Kiti Uygulamalı Spektral Görüntüleme</td><td>FPRPR0033</td><td></td></tr><tr><td>Tek Boyalar Özelleştirilmiş - 3 Renk; Fare kromozomu 1: Kırmızı, Fare kromozomu 2: Yeşil, Fare kromozomu 3: Aqua</td><td>Uygulamalı Spektral Görüntüleme</td><td>FPRPR0182/10</td><td></td></tr><tr><td>Cam lameller</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545B</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP337-100</td><td></td></tr><tr><td>Hidroklorik asit, %37, Acros Organics</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC45055-0025&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Cam Boyama Tabakları&nbsp; Vidalı Kapaklı</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-816</td><td></td></tr><tr><td>KaryoMAX Potasyum Klorür Çözeltisi&nbsp;</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>10575-090</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Superfrost Plus Mikroskop Slaytları</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Colcemid tozu</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-464-757&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Histopak-1083&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10831</td><td></td></tr><tr><td>Çoban Mark I, model 25 137Cs ışınlayıcı</td><td>JL Çoban & İştirakler</td><td>Model 484B</td><td></td></tr><tr><td>Şırınga 1 mL</td><td>BD Biosciences</td><td>647911</td><td></td></tr><tr><td>Etil Alkol, 200 Proof</td><td>Fisher Scientific</td><td>MEX02761</td><td></td></tr><tr><td>PBS, (1x PBS Sıvı), Kalsiyum ve Magnezyum Fisher</td><td>Scientific</td><td>ICN1860454</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-437-010</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A454SK-4</td><td></td></tr><tr><td>Buzlu asetik asit</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC295320010</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Mikroskop</td><td>Zeiss</td><td>AXIO Imager.Z2</td><td></td></tr></tbody></table>

Çoklu floresan inter-kromozomal kararlı sapmaları algılama<em&gt; in situ</em&gt; hibridizasyon (mfish) ve ışınlanmış farelerde spektral karyotipik (sky)

Detection of Inter-chromosomal Stable Aberrations by Multiple Fluorescence In Situ Hybridization (mFISH) and Spectral Karyotyping (SKY) in Irradiated Mice

İyonlaştırıcı radyasyon (IR) çok sayıda kararlı ve kararsız kromozomal sapmalara neden olur. Kromozom morfolojisinin önemli ölçüde tehlikeye girdiği kararsız sapmalar, geleneksel kromozom boyama teknikleriyle kolayca tanımlanabilir. Bununla birlikte, kromozom morfolojisinde önemli bir değişiklik olmaksızın genetik materyallerin değişimini veya translokasyonunu içeren kararlı sapmaların tespiti, floresan etiketli DNA problarının yerinde hibridizasyonuna dayanan karmaşık kromozom boyama teknikleri gerektirir, bu da popüler olarak floresan in situ floresan olarak bilinen bir kromozom boyama tekniği hibridizasyon (FISH). FISH probları, tüm kromozom/lar için spesifik olabilir veya kromozom/lar üzerindeki hassas alt bölge olabilir. Yöntem sadece kararlı sapmaların görselleştirilmesine izin vermekle kalmaz, aynı zamanda belirli bir sapma oluşumunda yer alan kromozomun/bozuklukların veya spesifik DNA dizisinin/dizilerinin saptanmasına da izin verebilir. Sitogenetikte çeşitli kromozom boyama teknikleri mevcuttur; burada, toplam vücut ışınlamasına maruz kaldıktan sonra farelerin kemik iliği hücrelerinde oluşan kromozomal stabil anormallikleri tanımlamak için çoklu floresan in situ hibridizasyon (mFISH) ve spektral karyotipleme (SKY) olmak üzere oldukça hassas iki yöntem tartışılmaktadır. Her iki teknik de floresan etiketli DNA problarına dayansa da, floresan sinyallerin tespit yöntemi ve görüntü elde etme süreci farklıdır. Bu iki teknik, radyasyon biyolojisi, kanser sitogenetiği, retrospektif radyasyon biyodozimetrisi, klinik sitogenetik, evrimsel sitogenetik ve karşılaştırmalı sitogenetik gibi çeşitli araştırma alanlarında kullanılmıştır.

Total vücut ışınlaması ışınlanmış farelerde kemik iliği hücrelerinde çok sayıda kromozom sapmaları neden olur. Mevcut protokolü radyasyona maruz kaldıktan sonra, kemik iliği hücreleri, in vivo mitotic durmanın için optimize edilmiştir, yoğunluk gradyanlı santrifüj metafaz hücre mamullerin hazırlanmasında, ve daha sonra ışınlanmış farelerde, kemik iliği tek çekirdekli hücreleri tecrit arka ayakları arasında kemik iliği hücrelerinin hasat mFISH ve SKY teknikleri ile radyasyona bağ...

Mevcut protokol, toplam vücut ışınlamasına maruz kaldıktan sonra farelerin kemik iliği hücrelerindeki kromozomal stabil anormallikleri tanımlamada çoklu floresan in situ hibridizasyon (mFISH) ve spektral karyotiplemenin (SKY) yararlılığını açıklamaktadır.

Çoklu Floresan Inter-kromozomal Kararlı sapmaları Algılama<em&gt; In Situ</em&gt; Hibridizasyon (mFISH) ve ışınlanmış Farelerde Spektral Karyotipik (SKY)

Ionizing radiation (IR) induces numerous stable and unstable chromosomal aberrations. Unstable aberrations, where chromosome morphology is substantially ...

Bu moleküler sitogenetik yöntemin genel amacı, tüm vücut ışınlamasına maruz kalan farelerin kemik iliği hücrelerindeki kromozomlar arası stabil aberasyonları gözlemlemektir. Bu yöntem, tüm vücut radyasyonuna maruz kalan farelerin kemik iliği hücrelerinde stabil kromozomal aberasyonların indüklenme riski gibi radyasyon biyolojisi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, farelerin kemik iliği hücrelerinde radyasyonla indüklenen ve birçok hücre nesli boyunca aktarılabilen stabil genetik hasarların kılavuzlu görselleştirilmesine olanak tanımasıdır.Fare femur ve tibia kemiklerinden kemik iliğini izole edip metin protokolüne uygun olarak tek hücre süspansiyonu hazırladıktan sonra, hücre süspansiyonunu dikkatlice eşit hacimdeki kemik iliği mononükleer hücre ayırma ortamının üzerine ekleyin. Gradyanı oda sıcaklığında 30 dakika boyunca 400 ×g hızında santrifüjleyin. Ardından, kalan katmanları bozmadan buffy coat tabakasını dikkatlice toplayın ve çözeltiyi yeni bir 15 mL santrifüj tüpüne aktarın.Metafaz hücre yaymaları hazırlamak için, buffy coat içeren tüpe 10 mililitre PBS ekleyin. Ardından tüpü oda sıcaklığında 400 ×g hızda beş dakika boyunca santrifüj edin. Sonrasında, süpernatantı dikkatlice uzaklaştırın ve hücre peletini parçalamak için tüpe hafifçe vurun.Ardından 10 mililitre PBS ekleyin ve süspansiyonu tekrar santrifüjleyin. Hücre peletini bozmadan süpernatanı uzaklaştırın. Peleti dağıtın ve hafif, sabit bir çalkalama ile önceden ısıtılmış hipotonik 0,075 molar potasyum klorür çözeltisinden dört mililitreyi damla damla ekleyin.Hücre süspansiyonunu bir su banyosunda 37 °C'de 20 dakika boyunca inkübe edin. Ardından, tüpe eşit hacimde fiksatif ekleyin ve tüpü ters çevirerek nazikçe karıştırın. Tüpü santrifüjleyin ve süpernatantı uzaklaştırın.Ardından, hücre peletini parçalayın ve taze fiksatif ekleyin. Santrifüjleme ve fiksatif ekleme işlemini beş kez daha tekrarlayın. Hücreleri 400 ila 600 µL fiksatif içinde yeniden süspanse ettikten sonra, fikse edilmiş hücrelerden 30 µL'yi 45 derecelik açıyla eğilmiş, önceden temizlenmiş ve ıslak lamların üzerine damlatın ve lamların gece boyunca tamamen havada kurumasını sağlayın.mFISH ile fare kromozom boyaması gerçekleştirmek için, metafaz hücre yayılımlarını içeren lamı oda sıcaklığında iki dakika boyunca 2X SSC içine yerleştirin. Ardından, lamı sırasıyla %70, %80 ve %100'lük etanol ile her yıkama için iki dakika boyunca yıkayarakyelehidre edin. Bir cam coplin kavanozundaki 40 mililitre denatürasyon çözeltisini 70 °C'de 30 dakika boyunca önceden ısıtın.Ardından slaytı önceden ısıtılmış solüsyona aktarın ve kromozomları denatüre etmek için örneği 1 ila 1 1/2 dakika inkübe edin. Denatürasyon işlemini durdurmak ve denatüre olmuş kromozomların yeniden birleşmesini önlemek için slaytı hemen buz gibi soğuk %70 ethanol ile iki dakika boyunca söndürün. Daha sonra, %80 ethanol ile başlayan bir ethanol serisi kullanarak slaytı iki dakika boyuncaydehidre edin.Ardından, lamı iki dakika boyunca %100 ethanol içinde bekletin. Daha sonra lamı oda sıcaklığında tamamen kurutun. Probu denatüre etmek için, üretici tarafından sağlanan prob karışımını kısa süreliğine santrifüjleyin, ardından 10 µL'sini 500 µL'lik snap kapaklı bir santrifüj tüpüne aktarın ve tüpü 80 °C'deki bir su banyosunda yedi dakika inkübe edin.Şimdi, denatüre edilmiş probu içeren tüpü 37 °C sıcaklıktaki su banyosunda 10 dakika bekletin. Ardından prob karışımını, denatüre edilmiş kromozomların bulunduğu bir lama uygulayın. Bölgeyi 18 mm x 18 mm'lik bir lameliyle dikkatlice kapatın ve lamel üzerindeki görünür hava kabarcıklarını, lameli lama çok nazikçe bastırarak giderin.Lamelin dört yanını da sızdırmaz hale getirmek için kauçuk çimento kullanın. Ardından lamı, nemlendirilmiş bir bölmede, karanlıkta ve 37 degrees Celsius sıcaklıkta 12 ila 16 saat inkübe edin. Hibritizasyonun ardından, kauçuk çimentoyu ve lameli dikkatlice çıkarın ve lamı beş dakika boyunca 74 degrees Celsius sıcaklığa önceden ısıtılmış 0.4X SSC içine yerleştirin.Ardından lamı iki dakika boyunca üçüncü yıkama çözeltisine aktarın. Lamın üzerine DAPI karşı boyalı 20 µL antifade montaj medyumu ekleyin ve üzerini bir cam lamel ile kapatın. Hava kabarcıklarını ve fazla montaj çözeltüsünü gidermek için laboratuvar peçetesi kullanarak lamelin üzerine hafifçe bastırın.Ardından, lamelin kenarlarını mühürlemek için oje kullanın. Lamları, uygun filtrelerle donatılmış bir floresan mikroskop kullanarak inceleyin. Fare kromozomlarının spektral karyotiplendirmesi için, problar denatüre edilmiş kromozomlara hibritlendikten ve örnekler metin protokolüne göre yıkandıktan sonra, lama 80 µL SY5 boyama reaktifi uygulayın.Numunenin üzerine 24 by 60 milimetrelik plastik bir lamel yerleştirin ve 37 degrees Celsius sıcaklıktaki nemlendirilmiş bir bölmede, karanlıkta 40 dakika boyunca inkübe edin. Lamı, önceden ısıtılmış yıkama solüsyonu üç içeren cam bir coplin kavanozuna daldırın ve 45 degrees Celsius sıcaklıktaki su banyosunda, çalkalamalı olarak iki dakika boyunca inkübe edin. Yıkama işlemini üç kez tekrarlayın.Numuneye 80 µL SY5.5 boyama reaktifi uygulayın, üzerini 24 x 60 mm'lik plastik bir lamelle kapatın ve nemlendirilmiş bir oda içerisinde, karanlıkta, 37 °C'de 40 dakika boyunca inkübe edin. Lamı üç kez yıkamak için önceden ısıtılmış yıkama solüsyonu üç kullanın, ardından fazla sıvının süzülmesi için lamı bir kağıt havluya eğimli bir konumda tutun. Numuneye 20 µL antifade DAPI reaktifi ekleyin ve hava kabarcığı oluşmamasına dikkat ederek üzerine cam bir lamel yerleştirin.Kenarları mühürlemek için oje kullanın ve örneği, gökyüzü görüntüleri yakalamak için donatılmış bir epifloresan mikroskobu ile inceleyin. Bu şekil, normal ve aberan fare 1, 2 ve 3 numaralı kromozom çiftlerini içeren temsili metafaz hücre yayılımlarını göstermektedir. Burada, kromozom birin bir kısmının boyanmamış bir DAPI kromozomuna entegre olduğu, diğer bir kısmının ise asentrik bir fragman oluşturduğu, kromozom biri ile ilgili stabil bir aberasyon görülmektedir.Bu örnekte, ikinci kromozomun bir kısmı boyanmamış bir kromozoma entegre edilmiştir. Bu stabil aberasyon üçüncü kromozomu içermektedir. Bu metafaz yayılımında, boyanmış üç kromozomun tamamını kapsayan stabil aberasyonlar görülmektedir.Burada normal bir dişi fareye ait spektro karyotipleme örneği gösterilmektedir. Bu panel, 4 ve 12. kromozomları içeren stabil bir aberasyonu temsil etmektedir. Son olarak, bu paneldeki stabil kromozomal aberasyon, 7 ve 10. kromozomları içermektedir.Bu teknik üzerinde uzmanlaşıldığında, uygun şekilde uygulandığı takdirde 48 ila 72 saat içinde tamamlanabilir. Bu prosedür uygulanırken, yalnızca proliferasyon halindeki hücrelerin kullanılması gerektiğinin hatırlanması önemlidir. Bu prosedürün ve "in band" gibi diğer yöntemlerin uygulanmasıyla, ışınlanan hücrelerde interkromozomal stabil aberasyonların mevcut olup olmadığı gibi ek sorulara yanıt bulunabilir.Bu tekniğin geliştirilmesinin ardından, moleküler sitogenetik alanındaki araştırmacılar genetik aberasyonlar ile çeşitli hastalıklar arasındaki ilişkiyi inceleme imkanı bulmuşlardır. Bu videoyu izledikten sonra, inter-kromozomal stabil aberasyonların nasıl belirleneceği konusunda daha net bir fikre sahip olmalısınız. Kolşisin ile çalışmanın, karsinojen olması nedeniyle son derece tehlikeli olabileceğini ve bu deneyi gerçekleştirirken eldiven giymek gibi önlemlerin her zaman alınması gerektiğini unutmayın.

detection-inter-chromosomal-stable-aberrations-multiple-fluorescence

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Bu makale, tek hücreli FISH, blastomer çekirdeklerinin yayılmasını teknikleri, in situ hibridizasyon ve klinik bir ortamda pre-implantasyon genetik tanı (PGD) uygulanan sinyal puanlama için uygun probların seçim açıklamaktadır.

Pre-implantasyon Genetik Tanı için FISH

Chromosomics: Sayısal ve Yapısal Değişmeler Algılama Tüm 24 İnsan Kromozomlar Aynı zamanda Roman OctoChrome BALIK Test kullanma

Spektral Karyotipik (SKY), genomik ve kromozomal sapmaları belirlemek için gelişmiş bir sitogenetik bir yöntemdir. Bu teknik, bütün kromozomlar sınıflamasına izin verir, kromozom boyayan problar yararlanır. SKY da polikistik böbrek hastalığı dahil olmak üzere çeşitli hastalıklar, farelerde ve insanlarda kompleks kromozom anomalileri ve ayrımcılığın kusurları tespit edebilir.

Polikistik Böbrek Hastalığı Olan İnsanlar ve Fareler kromozom anomalileri Eğitim Spektral Karyotipik

Biz doğrudan etiketli floresan problar kullanarak 3D DNA FISH ile nükleer mimarisi analiz için sağlam ve çok yönlü protokol açıklar.

Doğrudan Etiketli Problar kullanarak Sağlam 3D DNA BALIK

In situ hibridizasyon (FISH) floresan hücre içinde kendi doğal ortamında nükleik asitlerin saptanmasını sağlar. Burada fare embriyonik kök hücreleri X kromozomu inaktivasyon incelemek için kullanılabilir FISH vasıtasıyla RNA ve DNA birleşik, eş zamanlı olarak saptanması için bir protokol açıklar.

Kombine DNA-RNA Floresan<em&gt; In situ</em&gt; Hibridizasyon (FISH) Farklılaştırılmış Kadın Fare Embriyonik Kök Hücreleri X kromozomu inaktivasyonu Eğitim için

DNA onarım yolları genomik bütünlüğünü korumak ve mutasyon ve kanser önlenmesi için gereklidir. Bu protokolün amacı, metafaz telomerik DNA tekrarlar in situ hibridizasyon (FISH) floresan kullanılarak fare B hücreleri yayılır içinde kromozom anormallikleri doğrudan gözlem ile genomik istikrarsızlık ölçümüdür.

PNA-FISH ile Fare B Lenfositlerindeki kromozom anormallikleri hızlı Analizi

Kinaz inhibitörü tedavisi karşı genetik direnç ortaya çıkması etkili kanser tedavisi için önemli bir sorun teşkil etmektedir. Yeni geliştirilen ilacın karşı tanımlanması ve dirençli mutasyonların karakterizasyonu daha iyi klinik yönetim ve yeni nesil ilaç tasarımında yardımcı olur. Burada, in vitro tarama ve dirençli mutasyonların doğrulama için bizim protokol açıklar.

Kinaz İnhibitörleri Karşı Dayanıklı Mutasyonlarının Tarama ve Doğrulama için Bir Yöntem

Bu el yazması Xoluşturmak için ayrıntılı bir yöntem sunuyor-kromozom kol sonda ve kız kardeşi durumunu incelemek için performans gösteren Floresans in situ hibridizasyon (balık) Kromatit uyum içinde prometafaz ve metafaz tutuklandı Drosophila yumurta. Bu iletişim kuralı segregasyonun kol uyum bozulmamış veya kesintiye farklı genotip içinde olup olmadığını belirlemek için uygundur.

Kol uyum içinde prometafaz ve metafaz durumunu izlemek için Floresans In Situ hibridizasyon (balık) kullanarak ben Drosophila yumurta

Bu tek molekül floresans in situ hibridizasyon Protokolü bitkisel büyüme ve mayoz sırasında RNA molekülleri mayası sayısını ölçmek için optimize edilmiştir.

Tek molekül floresans In Situ hibridizasyon (smFISH) analizi Budding Maya bitkisel büyüme ve mayoz

Burada, multipl miyelom hastalarından alınan kemik iliği yaymalarında interfaz floresan in situ hibridizasyon tespitinin başarısını artırmak için bir protokol sunuyoruz.

İnfaz Floresan in situ Multipl Miyelomun Kemik İliği Yaymalarının Hibridizasyonu

Sinapslardaki mayotik hatalar ve rekombinasyon, memeli oositlerinde yaygındır. Bu süreçlerde yer alan proteinlerin titiz analizi, oogenezin nasıl ve neden sıklıkla yanlış gittiğini anlamak için çok önemlidir. Burada sunulan teknikler, farelerde oosit kalitesini değerlendirmek için rekombinasyon ve sinapsların kapsamlı bir şekilde izlenmesine izin verir.

Sinapsis ve Rekombinasyonun Değerlendirilmesi için Fare Oositlerinden Mayotik Kromozom Yayılımlarının Hazırlanması

Öğrenin, fare kemik iliği hücrelerinde mFISH ve SKY teknikleriyle radyasyon kaynaklı interkromozomal kararlı sapmaları nasıl tespit edeceğinizi. Bu yöntem, genetik hasarın görselleştirilmesi için değerli bir araçtır.

Çoklu Floresan Inter-kromozomal Kararlı sapmaları Algılama In Situ Hibridizasyon (mFISH) ve ışınlanmış Farelerde Spektral Karyotipik (SKY) (Video) | JoVE Journal

Çoklu Floresan Inter-kromozomal Kararlı sapmaları Algılama

Daha fazla video keşfet