Çoklu Floresan Inter-kromozomal Kararlı sapmaları Algılama In Situ Hibridizasyon (mFISH) ve ışınlanmış Farelerde Spektral Karyotipik (SKY)

Bu moleküler sitojenik yöntemin genel amacı, toplam vücut ışınlamasına maruz kalan farelerin kemik iliği hücrelerinde kromozomal stabil anormallikleri gözlemlemektir. Bu yöntem, radyasyon biyolojisi alanında, toplam vücut radyasyonuna maruz kalan farelerin kemik iliği hücrelerinde stabil kromozomal anormalliklere neden olma riski gibi kilit soruyu yanıtlamaya yardımcı olabilir. Bu tekniğin ana avantajı, farelerin kemik iliği hücrelerinde radyasyonun neden olduğu stabil genetik hasarların rehberli olarak görselleştirilmesine izin vermesidir ve bu hasarlar birçok hücre nesli boyunca çoğaltılabilir.

Fare femur ve tibia kemiklerinden kemik iliğini izole ettikten ve metin protokolüne göre tek hücreli bir süspansiyon yaptıktan sonra, hücre süspansiyonunu eşit hacimde kemik iliği mononükleer hücre ayırma ortamı üzerine dikkatlice yerleştirin. Gradyanı oda sıcaklığında 30 dakika boyunca 400 kez G'de santrifüjleyin. Ardından, kalan katmanları bozmadan buffy kaplamayı dikkatlice toplayın ve çözeltiyi yeni bir 15 mililitrelik santrifüj tüpüne aktarın.

Metafaz hücre yayılımlarını hazırlamak için, buffy kaplamayı içeren tüpe 10 mililitre PBS ekleyin. Daha sonra tüpü oda sıcaklığında 400 kez G'de beş dakika santrifüjleyin. Ardından, süpernatanı dikkatlice çıkarın ve hücre peletini parçalamak için tüpe hafifçe vurun.

Ardından 10 mililitre PBS ekleyin ve süspansiyonu tekrar santrifüjleyin. Hücre peletini bozmadan süpernatanı çıkarın. Peleti parçalayın ve nazik, sürekli çalkalayarak dört mililitre önceden ısıtılmış hipotonik 0.075 molar potasyum klorür çözeltisi damla damla ekleyin.

Hücre süspansiyonunu bir su banyosunda 20 dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Daha sonra tüpe eşit hacimde sabitleyici ekleyin ve tüpü ters çevirerek hafifçe karıştırın. Tüpü santrifüjleyin ve süpernatanı çıkarın.

Sonra, hücre peletini parçalayın ve taze sabitleyici ekleyin. Eğirme işlemini ve sabitleyici ilavesini beş kez daha tekrarlayın. Hücreleri 400 ila 600 mikrolitre fiksatif içinde yeniden süspanse ettikten sonra, 30 mikrolitre sabit hücreyi 45 derecelik bir açıyla eğilmiş önceden temizlenmiş ve ıslak slaytlara bırakın ve slaytların gece boyunca tamamen kurumasını bekleyin.

mFISH ile fare kromozomu boyamayı gerçekleştirmek için, metafaz hücre yayılımlarını içeren slaydı oda sıcaklığında iki dakika boyunca 2X SSC'ye yerleştirin. Ardından, her yıkamada iki dakika boyunca %70 %80 ve %100 etanol ile seri etanol yıkayarak slaydı kurutun. Bir cam coplin kavanozunda 40 mililitre denatürasyon solüsyonunu 30 dakika boyunca 70 santigrat dereceye

Daha sonra slaytı önceden ısıtılmış çözeltiye aktarın ve kromozomları denatüre etmek için numuneyi bir ila 1 1/2 dakika inkübe edin. Denatürasyon sürecini durdurmak ve denatüre kromozomların yeniden tavlanmasını önlemek için slaytı iki dakika söndürmek için hemen buz gibi soğuk% 70 etanol kullanın. Ardından, iki dakika boyunca% 80 etanol ile başlayan bir etanol serisi kullanarak slaydı kurutun.

Ardından, slaydı iki dakika boyunca% 100 etanol içine yerleştirin. Ardından slaytı oda sıcaklığında tamamen kurutun. Probu denatüre etmek için, üretici tarafından sağlanan prob karışımını kısaca santrifüjleyin, ardından 10 mikrolitreyi 500 mikrolitrelik geçmeli kapaklı bir santrifüj tüpüne aktarın ve tüpü yedi dakika boyunca 80 santigrat derecede bir su banyosunda inkübe edin.

Şimdi denatüre probu içeren tüpü 10 dakika boyunca 37 santigrat derecede bir su banyosuna yerleştirin. Daha sonra prob karışımını denatüre kromozomlu bir slayt üzerine uygulayın. Alanı 18 milimetreye 18 milimetre cam lamel ile dikkatlice örtün ve lamel lamel çok nazikçe sürgün bastırarak görünür hava kabarcıklarını ortadan kaldırın.

Lamelin dört tarafını da kapatmak için kauçuk çimento kullanın. Ve slaytı karanlıkta nemlendirilmiş bir odada 37 santigrat derecede 12 ila 16 saat boyunca inkübe edin. Hibridizasyonun ardından, kauçuk çimentoyu ve lamel dikkatlice çıkarın ve sürgünü beş dakika boyunca 74 santigrat derecede önceden ısıtılmış 0,4X SSC'ye yerleştirin.

Ardından slaydı iki dakika boyunca üç yıkama çözeltisine aktarın. Lam üzerine 20 mikrolitre DAPI karşı boyalı antifade montaj ortamı ekleyin ve üzerini cam lamel ile kapatın. Hava kabarcıklarını ve fazla montaj solüsyonunu çıkarmak için lamel üzerine hafifçe bastırmak için laboratuvar kağıt mendil kullanın.

Ardından lamel kenarlarını kapatmak için oje kullanın. Uygun filtrelerle donatılmış bir floresan mikroskobu kullanarak slaytları görüntüleyin. Fare kromozomlarının spektral karyotiplemesi için, problar denatüre kromozomlar üzerine hibritlendikten ve numuneler metin protokolüne göre yıkandıktan sonra, slayta 80 mikrolitre SY5 boyama reaktifi uygulayın.

Numunenin üzerine 24 x 60 milimetrelik plastik bir lamel yerleştirin ve karanlıkta 37 santigrat derecede nemlendirilmiş bir odada 40 dakika boyunca inkübe edin. Slaytı önceden ısıtılmış yıkama solüsyonu üç içeren bir cam coplin kavanozuna batırın ve iki dakika çalkalayarak 45 santigrat derecede bir su banyosunda inkübe edin. Yıkamayı üç kez tekrarlayın.

Numuneye 80 mikrolitre SY5.5 boyama reaktifi uygulayın, 24 x 60 milimetrelik plastik bir lamel ile örtün ve karanlıkta 37 santigrat derecede nemlendirilmiş bir odada 40 dakika inkübe edin. Slaytı üç kez yıkamak için önceden ısıtılmış yıkama solüsyonu üç kullanın, ardından fazla sıvıyı boşaltmak için slaytı bir kağıt havluya karşı eğik bir konumda tutun. Numuneye 20 mikrolitre antifade DAPI reaktifi ekleyin ve herhangi bir hava kabarcığı oluşturmadan üstüne dikkatlice bir cam lamel yerleştirin.

Kenarları kapatmak için oje kullanın ve numuneyi gökyüzü görüntülerini yakalamak için donatılmış bir epifloresan mikroskobu ile gözlemleyin. Bu şekil, normal ve anormal fare kromozom çiftleri bir, iki ve üç ile temsili metafaz hücre yayılımlarını göstermektedir. Burada, birinci kromozomun bir kısmının boyanmamış bir DAPI kromozomuna entegre edildiği, diğer bir parçanın ise asentrik bir parça oluşturduğu birinci kromozomu içeren kararlı bir sapma söz konusudur.

Bu örnekte, ikinci kromozomun bir kısmı boyanmamış bir kromozoma entegre edilmiştir. Bu kararlı sapma, kromozom üçünü içerir. Bu metafaz yayılımında üç boyalı kromozomun tümünü içeren kararlı sapmalar görülür.

Burada normal bir dişi farenin spektro karyotiplemesinin bir örneği gösterilmektedir. Bu panel, dört ve 12. kromozomları içeren kararlı bir sapmayı temsil eder. Son olarak, bu paneldeki kararlı kromozomal sapma, kromozom yedi ve 10'u içerir.

Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik düzgün bir şekilde yapılırsa 48 ila 72 saat içinde yapılabilir. Bu prosedürü denerken, sadece çoğalan hücrelerin kullanılması gerektiğini unutmamak önemlidir. Bu prosedürü takiben ve banttaki gibi diğer yöntemler, ışınlanmış hücrelerde kromozomal stabil anormalliklerin olup olmadığı gibi ek soruları yanıtlamak için kullanılabilir.

Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, moleküler sitogenetik alanındaki araştırmacıların, genetik sapmalar ile çeşitli hastalıklar arasındaki ilişkiyi keşfetmelerinin yolunu açtı. Bu videoyu izledikten sonra, kromozomal stabil sapmaların nasıl belirleneceği konusunda daha net bir fikre sahip olmalısınız. Kolşisin ile çalışmanın kanserojen olduğu için son derece tehlikeli olabileceğini ve bu deneyi yaparken her zaman eldiven giymek gibi önlemlerin alınması gerektiğini unutmayın.