Name: De alto rendimiento de síntesis de carbohidratos y funcionalización de nanopartículas polianhidrido (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-06T12:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 37 s
Description: Aprende la síntesis automatizada de oligosacáridos y la funcionalización de nanopartículas polianhídrido mediante el protocolo hydro put. Este método optimiza la morfología de nanopartículas y la densidad de carbohidratos para mejorar el direccionamiento a células presentadoras de antígenos.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Los autores desean agradecer a Ejército de los EE.UU. de Investigación Médica y Material Command (Grant # W81XWH-10-1-0806) y los Institutos Nacionales de Salud (Grant # U19 AI091031-01 y Grant # 1R01GM090280) para el apoyo financiero. BN reconoce la Cátedra Balloun en Ingeniería Química y Biológica y NLBP reconoce la Cátedra Wilkinson de Ingeniería Interdisciplinaria. Damos las gracias a Julia Vela por su ayuda en la realización de los experimentos de funcionalización de nanopartículas.

1. Hidratos de carbono de alto rendimiento Síntesis <ol><li> Antes de la síntesis automatizada de dimannoside, un donante de azúcar adecuadamente protegido, tricloroacetimidato típicamente, y aceptor, principalmente un alcohol fluorosa alquenilo, se sintetizan en el banco superior. </li><li> Un programa está escrito para la síntesis automatizada de dimannoside. Una representación esquemática del procedimiento automatizado de base se presenta en la Figura 2. En el programa, se asegura que antes de la adición del promotor, la mezcla de donante y aceptor se agita durante al menos 30 minutos. </li><li> Soluciones del donante sintético aceptor, y trimethylsilyltrifluoromethanesulfonate se hacen en diclorometano. El tolueno y el diclorometano se utilizan con mayor frecuencia para las reacciones de glicosilación. </li><li> También, preparar soluciones de reactivos para la desprotección de los grupos protectores temporales en 80% de metanol y 100% de metanol. </li><li> Antes del comienzo del programa, asegurar que la relaive la humedad en la habitación es de 30% o inferior en la cámara de la automatización. La alta humedad es perjudicial para las reacciones de glicosilación. </li><li> Una vez que se inicia el programa, el brazo robótico transfiere las soluciones de donante y aceptor en el vial de reacción secuencial. Luego la mezcla se agitó durante 30 min. </li><li> A continuación, el brazo robótico transfiere 0,2 a 0,3 equivalentes de trimethylsilyltrifluoromethanesulfonate en la mezcla, típicamente a temperatura ambiente, aunque las temperaturas más bajas como -20 ° C puede ser alcanzado. La mezcla de reacción se agitó durante 30 min. </li><li> Después de 30 minutos, la reacción se detuvo y una pequeña alícuota eliminado para vigilar el progreso de la reacción. Si no está completa, la reacción puede ser seguido y, finalmente, el tiempo requerido puede ser modificado. </li><li> Una vez que se completa la reacción, la mezcla de reacción se transfiere a los fluorosa extracción en fase sólida (FSPE) cartuchos que contienen C 8 F 17-modificado gel de sílice para su purificación. </li><li> El carrocrestas se lava primero con un 80% de metanol-agua mezcla (8 ml) para deshacerse de la fracción no fluorosa. </li><li> A continuación, los cartuchos se lavó con 100% de metanol para obtener el producto deseado fluorosa-etiquetados. Si purificación adicional se desea, la máquina puede ser parado y el producto de reacción (s) que se retiró para la purificación por medios adicionales. </li><li> Después del ciclo de purificación, el brazo robótico dispensa metóxido sódico en el vial de reacción. La reacción se agitó durante 2 h. Si no está completa, la reacción puede ser de nuevo continuó durante un período más largo y, finalmente, el tiempo programado requiere puede ser modificada. </li><li> Después de la terminación de la reacción, el producto se purifica por FSPE y después se somete a la disolución en tolueno anhidro, seguido por evaporación para eliminar el agua residual. </li><li> A continuación, el ciclo (de la etapa 6 a 13) se repite hasta que la longitud de cadena deseada se obtiene para la molécula diana. </li><li> El producto protegido, obtenido a partir de la automatización es ºes purificado y caracterizado completamente mediante técnicas tales como resonancia magnética nuclear (RMN). Desprotección completa (eliminación de todos los grupos protectores restantes) de la molécula objetivo final se completa entonces fuera de la plataforma de automatización como una regla, ya que generalmente implica el gas de hidrógeno explosivo y el paladio. La etapa de desprotección final se llevó a cabo en banco superior fuera de la plataforma de automatización. El primer paso fue ozonolisis del doble enlace en la etiqueta fluorosa seguido por oxidación del aldehído producido a un ácido carboxílico. El producto se purificó por cromatografía en columna. El paso final fue la desprotección de grupos éter de bencilo por hidrogenación catalizada con paladio. El producto se pasa a través de celita almohadilla para deshacerse de paladio para obtener producto final puro. </li></ol> 2. De alto rendimiento funcionalización superficial de nanopartículas <ol><li> De alto rendimiento de síntesis de polímeros y la fabricación de nanopartículas se lleva a cabo siguiendo el mismo protocol y robótica configurar descrito por Petersen et al 19. Los sistemas de copolímero utilizado para la fabricación de partículas se basa en el ácido sebácico (SA) y 1,6-bis (para-carboxifenoxi) hexano (LPA), y 1,8-bis-( para-carboxifenoxi) -3,6-dioxaoctano (CPTEG) y CPH. Una representación esquemática del aparato de deposición robótica utilizada se presenta en la Figura 1b. </li><li> Después de la fabricación de nanopartículas, el soporte que contiene los tubos con la biblioteca de nanopartículas se vuelve a unir a la etapa de actuador lineal. </li><li> Para la fijación de hidratos de carbono a la superficie de las partículas de polianhídrido, una reacción ácido amino-carboxílico acoplamiento 20 que consta de dos reacciones consecutivas se lleva a cabo. </li><li> Para la primera reacción, la jeringa en la bomba de jeringa programable primero se llena con 10 equivalentes (Ec.) (equivalentes de media concentración molar de ácido carboxílico en la superficie de las partículas) de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)-bisrbodiimide clorhidrato (EDC) y la ecuación 10. de etilendiamina en una solución acuosa, mientras que la jeringa en la bomba de jeringa programable segundo está cargado con 12 eq. de N-hidroxisuccinimida (NHS) en solución acuosa. </li><li> Con el programa LabVIEW, las suspensiones de reactivos son depositados en la biblioteca de * nanopartículas. </li><li> A continuación, cada muestra se sometió a sonicación (30 s en 40 Hz) y el soporte del tubo está separado de la plataforma robótica. </li><li> Suspensiones de nanopartículas se incuban durante 9 h ** con rotación constante a 4 ° C. </li><li> Después del tiempo de reacción se ha completado, los tubos se centrifugaron (12.000 xg durante 5 min) y devuelto a la estación de robótica para realizar dos etapas de lavado. </li><li> Para el lavado, una jeringa queda vacío y cargado en la bomba de jeringa programable primero, mientras que la jeringa en la bomba de jeringa segundo se llena con agua fría. El sobrenadante de cada tubo se retira la jeringa vacía y los depósitos de la bomba segundo de agua fría. </li><li> Homogeneización de los nanosuspensión de partículas se realizó como se describió en el paso 2,6. Los tubos se centrifugan (12000 xg durante 5 min) y una segunda etapa de lavado se realizó como se describió en el paso 2,9. </li><li> Para la segunda reacción, dos etapas de deposición se utilizan. En la primera fase de depósito, 12 eq. de EDC se cargan con una bomba y eq 12. NHS de se cargan con la segunda bomba. </li><li> La segunda fase de depósito incluye 10 eq. de un sacárido específica sobre las bombas primera y segunda (es decir, galactosa, lactosa o di manosa-) *** y una tercera bomba con 10 eq. de ácido glicólico (utilizado como control ****). </li><li> Las suspensiones de nanopartículas se homogeneizó como se describe en el paso 2,6 y se incubaron durante 9 horas con rotación constante a 4 ° C. </li><li> Después del tiempo de reacción se ha completado, una etapa de lavado se realiza como se describe en los pasos 2.8, 2.9 y 2.10. </li><li> La biblioteca de nanopartículas funcionalizado se coloca entonces en una cámara de vacío para secar durante al menos 2 horas. </li><li> Las nanopartículas funcionalizadas son entonces de carácterzado por espectroscopía de rayos X de fotoelectrones y un alto rendimiento de fenol-sulfúrico ensayo del ácido para determinar la composición de la superficie y la concentración del sacárido respectivamente. Microscopía electrónica de barrido y dispersión dinámica de luz se utilizan para determinar el tamaño de partícula, distribución de tamaño, y la carga superficial. </li></ol> Notas: * Los volúmenes de deposición varía con la masa de nanopartículas contenidas en cada tubo. Veces ** de reacción para las reacciones primera y segunda se puede cambiar para ajustar la concentración de sacárido final. *** Cada sacárido se deposita en tubos de ensayo en función del grupo que desee. **** Para la reacción específica empleada en este estudio para la unión de los hidratos de carbono, ácido glicólico se utiliza como un control de enlazador desde sacáridos desprotegidos ya tienen esta molécula unida covalentemente, que permite una unión más a la superficie de las nanopartículas. 3. Los resultados representativos El útildimannoside ly protegido se muestra en la Figura 2 se sintetizó utilizando la plataforma de automatización. El compuesto sintetizado se caracterizó por 1 H RMN en un espectrómetro VXR 400 MHz usando CDCl $ 3 como disolvente. El espectro de RMN se muestra en la Figura 3. Utilizando la fabricación de nanopartículas de alto rendimiento y funcionalización de nanopartículas polianhídrido se describe aquí, la unión de lactosa dimannose, y galactosa se ​​ha llevado a cabo con éxito 10, 11. Utilizando esta configuración, las condiciones óptimas de reacción (es decir, temperatura de reacción y el tiempo) se identificaron para lograr funcionalización deseada nanopartículas y morfología. Cuando la reacción se llevó a cabo a 4 ° C en lugar de la temperatura ambiente, una reducción en la agregación de nanopartículas se observó por SEM (datos no presentados). La Tabla 1 muestra los resultados representativos de la caracterización de CPTEG 50:50 funcionalizado CPH: nanopartículas, ya sea con di-manosa olactosa, sintetizado a 4 ° C. Los datos indican un pequeño aumento en el diámetro promedio de nanopartículas, debido a la funcionalización. Mientras que las nanopartículas no funcionalizados tenía un potencial zeta negativo de aprox. -20 MV, las partículas funcionalizadas mostró un valor positivo del potencial zeta, lo que demuestra el éxito de la funcionalización de la superficie de las nanopartículas. La lactosa y di-manosa son azúcares neutros, sin embargo, los grupos amina libres de la etilendiamina enlazador utilizados para unir los sacáridos pueden ser responsables de la potencial zeta positivo. El tiempo de reacción es otra variable que podría afectar tanto a la morfología final de las nanopartículas y el grado de unión del azúcar alcanzado. Al ajustar el tiempo de reacción, la concentración final de azúcar unido a la superficie nanopartículas pueden controlarse como se muestra en la Figura 4A. Como se esperaba, la concentración de dimannose en la superficie de 50:50 CPTEG: CPH nanopartículas aumentó conel tiempo total de reacción y alcanzó un máximo después de 18 h. Las nanopartículas funcionalizadas con el tiempo de reacción total de 24 horas se utilizaron para evaluar la posibilidad de dirigir CLR en el mouse de la médula ósea derivados de las células dendríticas (DC). La citometría de flujo se utilizó para evaluar la expresión de dos receptores CL (es decir, CIRE (CD209, la DC-SIGN) y el receptor de manosa (CD206)) después de la estimulación con no funcionalizado, y la lactosa y di-manosa nanopartículas funcionalizadas (Figura 4B). Una mayor expresión de ambos receptores, que es un indicativo de focalización eficaz, se obtuvo cuando las células se estimularon con ambos lactosa y di-manosa nanopartículas funcionalizados. Sin embargo, di-manosa-funcionalizados partículas mostraron un mayor nivel de expresión que indica una especificidad de este ligando para los receptores que se estudiaron. <table border="1"><tbody><tr><td> Nanopartículas de tipo </td><td> Diámetro medio de partícula (nm) </td><td> Avenidala rabia de partículas ζ-potencial (mV) </td></tr><tr><td> No funcionalizado </td><td> 162 ± 43 </td><td> -20 ± 0,6 </td></tr><tr><td> Lactosa </td><td> 235 ± 34 </td><td> 26 ± 2,4 </td></tr><tr><td> Di-manosa </td><td> 243 ± 32 </td><td> 30 ± 4,2 </td></tr></tbody></table> Tabla 1. Caracterización de las nanopartículas. No funcionalizado y funcionalizado se caracteriza por la dispersión de luz cuasi-elástica y las mediciones de potencial zeta. Los datos del tamaño de partícula representan el valor medio ± desviación estándar (DE) de la dinámica de los datos de dispersión de luz obtenidos en tres experimentos independientes. Datos de potencial zeta representan el valor medio ± desviación estándar de tres mediciones independientes. Cambio en el signo del potencial zeta demuestra que el azúcar era eficiente conjugado con el CPTEG 50:50: superficie de las nanopartículas CPH. <img alt="Figura 1" src<html> = &quot;/ Files/ftp_upload/3967/3967fig1.jpg&quot; /&gt; Figura 1. (A) Representación gráfica de la aproximación a cabo con la funcionalización de las nanopartículas de hidratos de carbono polianhídrido y un ejemplo de las bibliotecas de nanopartículas funcionalizadas que podrían ser diseñadas con el descrito enfoque de alto rendimiento. (B) Representación esquemática del aparato de deposición automatizado utilizado para funcionalización de partículas, que consiste en (i) tres NE 1000 bombas, (ii) una etapa robótico integrado por dos actuadores (Zaber): uno para el movimiento en la dirección x, y el otro para el movimiento en la dirección y, (iii) una segunda etapa robótico con dos bastidores adyacentes (apropiado para tubos y cubetas) que consta de tres actuadores, uno para cada dirección (x, y, z). Las bombas y un total de cinco actuadores están conectados en serie. Los actuadores y bombas son accionadas por un ordenador utilizando el software LabVIEW. Este diagrama no está a escala.arge.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Haga clic aquí para ver más grande figura. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3967/3967fig2.jpg" /> Figura 2. Representación gráfica de la automatizado iterativo síntesis de hidratos de carbono utilizando manosa como un ejemplo. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3967/3967fig3.jpg" /> Figura 3. 1 H RMN de la dimannoside protegido. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3967/3967fig4.jpg" /> Figura 4 (A). Efecto del tiempo de reacción sobre la concentración de nanopartículas superficie de sacárido. En los datos mostrados, 50:50 CPTEG: nanopartículas CPH se funcionalizado con dimannose a diferentes tiempos de reacción y la reacción se llevó a cabo a 4 ° C. El error medio y estándar de dos experimentos independientes de funcionalización se muestra. (B) a la lactosa y la di-manosa funcionalizados nanopartículasefectivamente objetivo de la DC-SIGN (CIRE, CD209) y manosa receptor (CD206) en la médula ósea procedentes de células dendríticas como lo demuestra el aumento de expresión de estos dos marcadores tras la estimulación con CPTEG 50:50 funcionalizado: nanopartículas de CPH, en comparación con la expresión obtenida no funcionalizados con partículas.

<ol><li>Zepp, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+vacine+design-lessons+from+nature%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Principles of vacine design-lessons from nature.</a> Vaccine. 28, C14-C24 (2010).</li>
<li>Ulery, B. D., Phanse, Y., Sinha, A., Wannemuehler, M. J., Narasimhan, B., Bellaire, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymer+chemistry+influences+monocytic+uptake+of+polyanhydride+nanospheres%5BTitle%5D)+AND+%22Pharm.+Res%22%5BJournal%5D)">Polymer chemistry influences monocytic uptake of polyanhydride nanospheres.</a> Pharm. Res. 26, 683-690 (2009).</li>
<li>Torres, M. P., Wilson-Welder, J. H., Lopac, S. K., Phanse, Y., Carrillo-Conde, B., Ramer-Tait, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyanhydride+microparticles+enhance+dendritic+cell+antigen+presentation+and+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">Polyanhydride microparticles enhance dendritic cell antigen presentation and activation.</a> Acta Biomater. 7, 2857-2864 (2011).</li>
<li>Torres, M. P., Determan, A. S., Anderson, G. L., Mallapragada, S. K., Narasimhan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amphiphilic+polyanhydrides+for+protein+stabilization+and+release%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Amphiphilic polyanhydrides for protein stabilization and release.</a> Biomaterials. 28, 108-116 (2007).</li>
<li>Petersen, L. K., Ramer-Tait, A. E., Broderick, S. R., Kong, C. S., Ulery, B. D., Rajan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+innate+immune+responses+in+a+pathogen-mimicking+manner+by+amphiphilic+polyanhydride+nanoparticle+adjuvants%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Activation of innate immune responses in a pathogen-mimicking manner by amphiphilic polyanhydride nanoparticle adjuvants.</a> Biomaterials. 32, 6815-6822 (2011).</li>
<li>Petersen, L. K., Xue, L., Wannemuehler, M. J., Rajan, K., Narasimhan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+simultaneous+effect+of+polymer+chemistry+and+device+geometry+on+the+in+vitro+activation+of+murine+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The simultaneous effect of polymer chemistry and device geometry on the in vitro activation of murine dendritic cells.</a> Biomaterials. 30, 5131-5142 (2009).</li>
<li>Lopac, S. K., Torres, M. P., Wilson-Welder, J. H., Wannemuehler, M. J., Narasimhan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+polymer+chemistry+and+fabrication+method+on+protein+release+and+stability+from+polyanhydride+microspheres%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Mater.+Res.+B%22%5BJournal%5D)">Effect of polymer chemistry and fabrication method on protein release and stability from polyanhydride microspheres.</a> J. Biomed. Mater. Res. B. 91, 938-947 (2009).</li>
<li>Determan, A. S., Wilson, J. H., Kipper, M. J., Wannemuehler, M. J., Narasimhan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+stability+in+the+presence+of+polymer+degradation+products%3A+Consequences+for+controlled+release+formulations%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Protein stability in the presence of polymer degradation products: Consequences for controlled release formulations.</a> Biomaterials. 27, 3312-3320 (2006).</li>
<li>Determan, A. S., Lin, V. S. Y., Nilsen-Hamilton, M., Narasimhan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Encapsulation%2C+stabilization%2C+and+release+of+BSA-FITC+from+polyanhydride+microspheres%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Encapsulation, stabilization, and release of BSA-FITC from polyanhydride microspheres.</a> J. Controlled Release. 100, 97-109 (2004).</li>
<li>Chavez-Santoscoy, A., Roychoudhury, R., Ramer-Tait, A. E., Pohl, N. L. B., Wannemuehler, M. J., Narasimhan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tailoring+the+immune+response+of+alveolar+macrophages+by+targeting+different+C-type+lectin+receptors+using+%22pathogen-like%22+amphiphilic+polyanhydride+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Tailoring the immune response of alveolar macrophages by targeting different C-type lectin receptors using "pathogen-like" amphiphilic polyanhydride nanoparticles.</a> Biomaterials. , Forthcoming (2011).</li>
<li>Carrillo-Conde, B., Song, E. -H., Chavez-Santoscoy, A., Phanse, Y., Ramer-Tait, A., Pohl, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mannose-functionalized+%22pathogen-like%22+polyanhydride+nanoparticles+target+C-type+lectin+receptors+on+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Mannose-functionalized "pathogen-like" polyanhydride nanoparticles target C-type lectin receptors on dendritic cells.</a> Mol. Pharmaceutics. 8, 1877-1886 (2011).</li>
<li>Carrillo-Conde, B., Schiltz, E., Torres, M. P., Yu, J., Phillips, G., Minion, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amphipilic+polyanhydrides+for+stabilization+of+Yersinia+pestis+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22Acta.+Biomater%22%5BJournal%5D)">Amphipilic polyanhydrides for stabilization of Yersinia pestis antigens.</a> Acta. Biomater. 6, 3110-3119 (2010).</li>
<li>Reddy, S. T., Swartz, M. A., Hubbell, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+dendritic+cells+with+biomaterials%3A+developing+the+next+generation+of+vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">Targeting dendritic cells with biomaterials: developing the next generation of vaccines.</a> Trends Immunol. 27, 573-580 (2006).</li>
<li>Higashi, N., Fujioka, K., Denda-Nagai, K., Hashimoto, S., Nagai, S., Sato, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+macrophage+C-type+lectin+specific+for+galactose%2FN-acetylgalactosamine+is+an+endocytic+receptor+expressed+on+monocyte-derived+immature+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The macrophage C-type lectin specific for galactose/N-acetylgalactosamine is an endocytic receptor expressed on monocyte-derived immature dendritic cells.</a> J. Biol. Chem. 277, 20686(2002).</li>
<li>Geijtenbeek, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signalling+through+C-type+lectin+receptors%3A+shaping+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Signalling through C-type lectin receptors: shaping immune responses.</a> Nat. Rev. Immunol. 9, 465-479 (2009).</li>
<li>Seeberger, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+oligosaccharide+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Soc.+Rev%22%5BJournal%5D)">Automated oligosaccharide synthesis.</a> Chem. Soc. Rev. 37, 19-28 (2008).</li>
<li>Seeberger, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+Carbohydrate+Synthesis+as+Platform+to+Address+Fundamental+Aspects+of+Glycobiology-Current+Status+and+Future+Challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Carb.+Res%22%5BJournal%5D)">Automated Carbohydrate Synthesis as Platform to Address Fundamental Aspects of Glycobiology-Current Status and Future Challenges.</a> Carb. Res. 343, 1889-1896 (2008).</li>
<li>Jaipuri, F. A., Pohl, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+solution-phase+automated+iterative+synthesis%3A+fluorous-tag+assisted+solution-phase+synthesis+of+linear+and+branched+mannose+oligomers%5BTitle%5D)+AND+%22Org.+Biomol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Toward solution-phase automated iterative synthesis: fluorous-tag assisted solution-phase synthesis of linear and branched mannose oligomers.</a> Org. Biomol. Chem. 6, 2686-2691 (2008).</li>
<li>Petersen, L. K., Chavez-Santoscoy, A., Narasimhan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+synthesis+of+and+high-throughput+protein+release+from+polymer+film+and+nanoparticle+libraries%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Combinatorial synthesis of and high-throughput protein release from polymer film and nanoparticle libraries.</a> J. Vis. Exp. , Forthcoming (2011).</li>
<li>Song, E. -H., Osanya, A. O., Petersen, C. A., Pohl, N. L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+multivalent+tuberculosis+and+Leishmania-associated+capping+carbohydrates+reveals+structure-dependent+responses+allowing+immune+evasion%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Synthesis of multivalent tuberculosis and Leishmania-associated capping carbohydrates reveals structure-dependent responses allowing immune evasion.</a> J. Am. Chem. Soc. 132, 11428-11430 (2010).</li>
<li>Hakamori, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aberrant+glycosylation+in+tumor+and+tumor+associated+carbohydrate+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Aberrant glycosylation in tumor and tumor associated carbohydrate antigens.</a> Adv. Cancer Res. 59, 257-331 (1989).</li>
<li>Atherton, T., Sheppard, R. C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAtherton%2C+T+%22Solid-phase+peptide+synthesis%3A+a+practical+approach%22">Solid-phase peptide synthesis: a practical approach</a>. , Oxford Univ Press. Oxford, UK. (1999).</li>
<li>Caruthers, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+synthesis+machines%3A+DNA+chemistry+and+the+uses%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Gene synthesis machines: DNA chemistry and the uses.</a> Science. 230, 281-285 (1985).</li>
<li>Plante, O. J., Palmacci, E. R., Seeberger, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+solid-+phase+synthesis+of+oligosaccharides%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Automated solid- phase synthesis of oligosaccharides.</a> Science. 291, 1523-1527 (2001).</li>
<li>Ko, K. -S., Park, G., Yu, Y., Pohl, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protecting+group-based+colorimetric+monitoring+of+fluorous-phase+and+solid-phase+synthesis+of+oligoglucosamines%5BTitle%5D)+AND+%22Org.+Lett%22%5BJournal%5D)">Protecting group-based colorimetric monitoring of fluorous-phase and solid-phase synthesis of oligoglucosamines.</a> Org. Lett. 10, 5381-5384 (2008).</li>
<li>Pohl, N. L. Automated solution-phase oligosaccharide synthesis and carbohydrate microarrays: development of fluorous-based tools for glycomics. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPohl%2C+NL+%22Chemical+Glycobiology%22">Chemical Glycobiology</a>. Chen, X. H. R., Wang, G. P. , American Chemical Society. Washington, DC. 272-287 (2008).</li>
</ol>

NLBP es co-fundador y tiene acciones en la compañía de hidratos de carbono LuCella Biosciences, Inc.

La eficacia de los hidratos de carbono como agentes dirigidos a las interacciones de nanopartículas directos a las células inmunes se ha demostrado anteriormente 10, 11. Investigaciones previas en nuestros laboratorios han mostrado que los azúcares específicos a los que las nanopartículas polianhídrido son capaces de dirigir CLR diferentes en las células presentadoras de antígeno (APC), mejorando así la activación de células inmunes, que puede ser importante para la posterior activación de las células T ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> Motorizada XYZ Etapa: 3x T-LSM050A, 50 mm de recorrido por eje </td><td> Zaber Tecnologías </td><td> T-XYZ-LSM050A-KT04 </td></tr><tr><td> NE-1000 bomba de jeringa individual </td><td> Nuevos sistemas de la Era de la bomba </td><td> NE-1000 </td></tr><tr><td> Pyrex * Vista * Al Aire Tubos de vidrio reutilizables Cultura </td><td> Corning </td><td> 07-250-125 </td></tr><tr><td> ASW 1000 </td><td> Chemspeed Tecnologías </td><td></td></tr><tr><td> LabVIEW </td><td> National Instruments </td><td> 776671-35 </td></tr><tr><td> SGE Tight Gas Jeringas, Luer Loc </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 509507 </td></tr><tr><td> XL-2000 Sonicator </td><td> Qsonica </td><td> Q55 </td></tr><tr><td> Mini-tubo rotador </td><td> Fisher Scientific </td><td> 05-450-127 </td></tr></tbody></table>

de alto rendimiento de síntesis de carbohidratos y funcionalización de nanopartículas polianhidrido

High-throughput Synthesis of Carbohydrates and Functionalization of Polyanhydride Nanoparticles

Enfoques transdisciplinarios que involucran áreas como el diseño de materiales, la nanotecnología, la química y la inmunología que se utilizarán para diseñar racionalmente los transportistas vacunas eficaces. Basados ​​en nanopartículas plataformas puede prolongar la persistencia de los antígenos de la vacuna, lo que podría mejorar la vacuna contra la inmunogenicidad 1. Varios polímeros biodegradables se han estudiado como vehículos de entrega de vacunas 1; en particular, las partículas de polianhídrido han demostrado la capacidad para proporcionar una liberación sostenida de antígenos proteicos estables y para activar las células presentadoras de antígenos y modular la respuesta inmune 2-12. El diseño molecular de estos portadores de vacunas necesita para integrar la selección racional de las propiedades del polímero, así como la incorporación de agentes adecuados de focalización. De fabricación de alto rendimiento automatizado de los ligandos y partículas funcionalizadas es una potente herramienta que aumentará la capacidad para estudiar una amplia range de las propiedades y se traducirá en el diseño de dispositivos de administración de vacunas reproducibles. La adición de ligandos capaces de ser reconocida por receptores específicos en las células del sistema inmune se ha demostrado que modulan la respuesta inmune y adaptar 10,11,13 C-receptores de tipo lectina (CLR) son los receptores de reconocimiento de patrones (RRP), que reconocen los hidratos de carbono presentes en el superficie de patógenos. La estimulación de células inmunes a través de CLR permite la internalización mejorada de antígeno y posterior presentación para la activación de células T más 14,15. Por lo tanto, las moléculas de hidratos de carbono juegan un papel importante en el estudio de las respuestas inmunes, sin embargo, el uso de estas biomoléculas menudo sufre de la falta de disponibilidad de estructuralmente bien definidos y los hidratos de carbono puro. Una plataforma de automatización basada en un proceso iterativo fase de solución reacciones pueden permitir la síntesis rápida y controlada de estas moléculas sintéticamente desafiantes con b significativamente menoronstruyendo cantidades de bloques que los tradicionales métodos en fase sólida 16,17. Aquí nos presenta un protocolo para la solución automatizada de la síntesis en fase de oligosacáridos como la manosa-basados ​​en ligandos con fluorosa extracción en fase sólida para la purificación intermedia. Después del desarrollo de métodos automatizados para hacer que el agente de carbohidratos selección de base, se describen métodos para su fijación en la superficie de polianhídrido nanopartículas empleando un conjunto robótico automatizado hasta operado por LabVIEW como se ha descrito previamente 10. Funcionalización de superficies con los hidratos de carbono ha demostrado su eficacia en la orientación CLR 10,11 y aumentar el rendimiento del método de fabricación para descubrir las complejidades asociadas con un sistema multi-paramétrico será de gran valor (Figura 1a).

En este artículo, un método de alto rendimiento se presenta para la síntesis de oligosacáridos y su fijación a la superficie de las nanopartículas polianhídrido para su uso posterior en la orientación de receptores específicos en las células presentadoras de antígenos.

De alto rendimiento de síntesis de carbohidratos y funcionalización de nanopartículas polianhidrido

Se deben utilizar enfoques transdisciplinarios que involucren áreas como el diseño de materiales, la nanotecnología, la química y la inmunología para diseñar racionalmente...

En este artículo en video, describimos un nuevo protocolo Hydro Put para la síntesis automatizada en fase solución de oligosacáridos y la funcionalización de nanopartículas de polianhídrido. Con estos agentes de direccionamiento basados en carbohidratos, primero se sintetizan moléculas de carbohidratos mediante un sistema automatizado que utiliza la síntesis en fase solución en lugar de sintetizadores en fase sólida. A continuación, los intermedios de oligosacáridos se purifican mediante extracción en fase sólida de florosil o FSPE.Las moléculas de carbohidratos producidas se caracterizan mediante RMN y luego se unen a las nanopartículas de polianhídrido mediante conjugación por carbo IDE. Finalmente, las nanopartículas funcionalizadas con carbohidratos se caracterizan mediante espectroscopía de fotoelectrones de rayos X y un ensayo de ácido fenil sulfúrico hidrofóbico. En última instancia, utilizando la metodología de hidrofobicidad descrita aquí, se han obtenido las condiciones de reacción para optimizar la morfología de las nanopartículas y la densidad de carbohidratos en la superficie de las partículas.La principal ventaja de este método frente a los métodos existentes, como la

high-throughput-synthesis-carbohydrates-functionalization

Research

Investigación

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingeniería

Este método describe la síntesis combinatoria de película polianhídrido biodegradable y bibliotecas de nanopartículas y la detección de alto rendimiento de liberación de proteína a partir de estas bibliotecas.

Síntesis combinatoria y de alto rendimiento liberación de proteínas de película de polímero y nanopartículas Bibliotecas

Un enfoque eficaz para la preparación de nanofibras decoradas con grupos funcionales capaces de interactuar específicamente con proteínas se describe. El primer enfoque requiere la preparación de un polímero funcionalizado con el grupo funcional apropiado. El polímero funcional se fabrica en nanofibras por electrohilado. La eficacia de la unión de las nanofibras con una proteína se estudió por microscopía confocal.

Procedimiento para la fabricación de nanofibras Biofuncionales

Este video ilustrar un método rápido y eficiente de metacrilato de poli (etilenglicol), lo que permite polimerizaciones de cadena y la síntesis de hidrogel. Demostrará cómo introducir de manera similar funcionalidades metacrilamida en péptidos, detalle los métodos analíticos comunes para evaluar la eficiencia de funcionalización, proporcionar sugerencias para la solución de problemas y modificaciones avanzadas y demostrar las técnicas típicas de caracterización de hidrogel.

Funcionalización asistida por microondas de poli (etilenglicol) y los péptidos sobre resina para uso en polimerizaciones de cadena y Formación de hidrogel

Se demuestra una síntesis eficiente de tres pasos de glicopolímeros fluorescentes basados en RAFT, que consiste en preparación de glucomonómero, copolimerización y post-modificación. Este protocolo se puede utilizar para preparar glicopolímeros estadísticos basados en RAFT con las estructuras deseadas.

Preparación Facile y Eficiente de la glicopolímeros fluorescentes Tri-componentes a través de polimerización BALSA controlado

Informamos de protocolos para "polimerizar" varios tipos de nanopartículas metálicas encapsuladas en polímeros en largas cadenas de "homo-" y "co-polímeros".

El uso de poliestireno<em&gt; Bloque</em&gt; Poli (ácido acrílico) presenta el revestimiento de metal nanopartículas como monómeros para su homo- y co-polimerización

Presentamos un método modular automatizado de alto rendimiento para la identificación y caracterización de exopolisacáridos microbianos a pequeña escala. Este método combina una preselección rápida para analizar la cantidad total de polisacáridos secretados con una huella digital detallada de carbohidratos para permitir el cribado rápido de cepas bacterianas recién aisladas o colecciones completas de cepas.

Plataforma modular de selección automatizados de alto rendimiento de exopolisacáridos Junto con el análisis de carbohidratos de la huella digital de alta sensibilidad

Se han detallado esquemas de síntesis para preparar nanopartículas peludas altamente estables a base de fibra de madera y biopolímeros funcionales basados en celulosa.

Altamente estable, funcional Hairy nanopartículas y biopolímeros con fibras de madera: Hacia Nanotecnología Sostenible

Presentamos un protocolo para la síntesis de hidrogeles funcionalizados con RGD como dispositivos para la administración de células y fármacos. El procedimiento consiste en la cicloadición de alquina-azida catalizada por cobre (CuAAC) entre el ácido poliacrílico modificado con alquino (PAA) y un derivado de RGD-azida. Los hidrogeles se forman mediante policondensación asistida por microondas y se investigan sus propiedades fisicoquímicas.

La síntesis de hidrogeles funcionalizado-RGD como una herramienta para aplicaciones terapéuticas

Un enfoque modular para la síntesis de N- glicanos para enganchar a un vidrio recubierto de óxido de aluminio slide (diapositiva ACG) como un microarray de glicanos se ha desarrollado y ha demostrado su uso para la elaboración de perfiles de un VIH ampliamente neutralizante del anticuerpo.

Chemo-enzimático síntesis de N- glicanos para el desarrollo de la matriz y el anticuerpo del VIH perfiles

Este protocolo demuestra cómo utilizar el software Auto-CHO para la síntesis jerárquica y programable de oligosacáridos. También describe el procedimiento general para los experimentos de determinación de RRV y la glicosilación de una olla de SSEA-4.

Síntesis jerárquica y programable de oligosacáridos de una olla

Las proteínas y los ligandos que contienen aminas pueden unrse covalentemente a polisacáridos activados por el reactivo de cianilación, 1-ciano-4-dimetilaminopiridina tetrafluoroborato (CDAP), para formar conjugados de proteína covalente (ligando)-polisacárido. Este artículo describe un protocolo mejorado para llevar a cabo la activación controlada de CDAP a 0 °C y variando el pH y realizar la posterior conjugación de los polisacáridos activados.

Activación y conjugación de polisacáridos solubles utilizando 1-ciano-4-dimetilaminopiridina tetrafluoroborato (CDAP)

Aprende la síntesis automatizada de oligosacáridos y la funcionalización de nanopartículas polianhídrido mediante el protocolo hydro put. Este método optimiza la morfología de nanopartículas y la densidad de carbohidratos para mejorar el direccionamiento a células presentadoras de antígenos.

De alto rendimiento de síntesis de carbohidratos y funcionalización de nanopartículas polianhidrido

Explorar más videos