De alto rendimiento de síntesis de carbohidratos y funcionalización de nanopartículas polianhidrido

En este artículo de vídeo, describimos un nuevo protocolo de hidropuesta para la síntesis automatizada de oligosacáridos en fase de solución y la funcionalización de nanopartículas de polianácrino. Con estos agentes dirigidos a base de carbohidratos, las primeras moléculas de carbohidratos se sintetizan utilizando un sistema automatizado que utiliza la síntesis en fase de solución en lugar de sintetizadores de fase sólida. A continuación, los oligosacáridos intermedios se purifican mediante floristería, extracción en fase sólida o FSPE.

Las moléculas de carbohidratos producidas se caracterizan por RMN y luego se unen a las nanopartículas de polianhídrido mediante conjugación de carbo IDE. Por último, las nanopartículas funcionalizadas con carbohidratos se caracterizan mediante espectroscopia de fotoelectrones de rayos X y un ensayo de ácido fenilsulfúrico hidroputt. En última instancia, utilizando la metodología de hidrocolocación descrita aquí, se han obtenido las condiciones de reacción para optimizar la morfología de las nanopartículas y la densidad de carbohidratos en la superficie de las partículas.

La principal ventaja de este método sobre los existentes, como la síntesis de oligosacáridos de cara sólida, es que en este método utilizamos una cantidad sustancialmente menor de bloques de construcción. Primero tenemos la idea de este método cuando demostramos la eficacia de los efectos superficiales, la funcionalización de las poli hidro nanopartículas, el uso de carbohidratos para dirigirse a los receptores ceep en las células anti abolladuras. Luego quisimos diseñar un sistema de alto rendimiento que nos permitiera evaluar los múltiples parámetros que están involucrados en la fabricación y aplicación de estos nuevos portadores.

La demostración visual de este método es fundamental porque el desarrollo de plataformas automatizadas para la síntesis de alto rendimiento de oligosacáridos y su unión a partículas poliméricas es un área de investigación novedosa sin mucha documentación disponible antes de la síntesis automatizada de dianoácido. Un donante de azúcar adecuadamente protegido, generalmente tri cloroacetamida un aceptor principalmente en Alcon, el alcohol fluorado se sintetiza en la mesa de trabajo y se prepara en clorometano también prepara trimetilsilo, tri fluoro metano sulfonato en clorometano, 80% metanol y 100% metanol. Asegúrese de que la humedad relativa de la habitación sea del 30% o inferior en la cámara de automatización.

La alta humedad es perjudicial para las reacciones de glicosilación. Los siguientes pasos se realizan utilizando una plataforma de automatización. La primera glicosilación se lleva a cabo con el donante y el alcohol de la floristería.

Una vez hecho esto, la molécula de azúcar de etiqueta de floristería resultante es purificada por FSPE. A continuación, el grupo protector temporal se elimina mediante sodio, óxido de metanfetamina y metanol y, una vez más, el producto se purifica mediante FSPE. Después de eso, el azúcar de la etiqueta de floristería se usa como aceptor y se acopla al mismo donante para obtener el disacárido, el disacárido es purificado por FSPE para comenzar.

Coloque los reactivos, incluido el promotor del aceptor del donante, el agua con metanol al 80%, el metanol al 100%, el óxido de metanfetamina de sodio en la plataforma robótica e inicie el programa. El brazo robótico extraerá al donante y luego al aceptor de los viales y los transferirá a un vial de reacción. A continuación, se agita la mezcla de donante y aceptor durante 30 minutos.

Pasados 30 minutos. El brazo robótico transfiere silo catalítico de trimetilo, trifluoro, sulfonato de metano a la mezcla. A continuación, la solución se agita durante 30 minutos más. Una vez finalizada la agitación, el programa se detiene.

Retire una alícuota de 10 microlitros para verificar si la reacción se completa mediante cromatografía en capa fina. Si la reacción se completa, no se verá la molécula aceptora. Si la reacción no se ha completado, el aceptante en el TLC sigue siendo visible.

Si este es el caso, detenga el programa, restablezca el tiempo de glicosilación alrededor de 30 minutos y agregue un exceso del promotor trimetilsilo, tri fluoro, sulfonato de metano. Cuando se complete la reacción, continúe con el siguiente paso. Una vez completada la reacción, el robot transfiere la mezcla de reacción a cartuchos FSPE que contienen gel de sílice modificado C nine F 17 para su purificación.

A continuación, los cartuchos se lavan con ocho mililitros de metanol al 80%, seguidos de ocho mililitros de metanol al 100%. Para eliminar la fracción no floris, el flujo se recoge en un vial para obtener el producto deseado marcado por el florista. Si se requiere una purificación adicional, detenga el robot y retire los productos de reacción adecuados.

Dependiendo de la estructura, los donantes pueden ser extremadamente poco reactivos y quedará alguna molécula aceptante de floristería incluso después de agregar suficiente promotor. Si este es el caso, FSPE no será lo suficientemente eficiente para la purificación y se puede realizar una purificación adicional a través de la cromatografía en columna de gel de sílice después de la purificación, el brazo robótico dispensa óxido de metanfetamina de sodio en el vial de reacción. A continuación, la reacción se agita durante dos horas en la plataforma robótica, si no se completa según lo determinado por TLC, se extiende el período de incubación en aproximadamente una hora.

Una vez completada la reacción, el producto es purificado por FSPE como antes. A continuación, retire el producto de reacción del robot y colóquelo en la mesa de trabajo sometido a disolución en tolueno anhidro, seguido de evaporación para eliminar el agua residual. Una vez que una muestra esté seca, vuelva a colocarla en el robot en el mismo ciclo que incluye la purificación por glicosilación mediante FSPE.

La protección profunda del grupo protector temporal seguida de glicosilación se repite hasta que se obtiene la longitud de cadena deseada para que la molécula objetivo desproteja el producto protegido obtenido de la automatización, retire el vial del robot. Los pasos finales del procedimiento utilizan gas hidrógeno explosivo y deben realizarse fuera de la plataforma de automatización. En la onza de sobremesa, se produce la lisis del doble enlace en la etiqueta de la floristería y es seguida por la oxidación del aldehído producido en ácido carboxílico.

Purifique el producto resultante mediante cromatografía en columna de gel de sílice en una mesa de trabajo utilizando una mezcla de 30% de metanol en di clorometano. Finalmente, para desproteger los grupos benzo éter mediante hidrogenación catalizada por paladio, pase el producto a través de una almohadilla satelital para deshacerse del paladio, para obtener un producto final puro. Caracterice completamente el producto mediante resonancia magnética nuclear o espectroscopía de RMN.

La síntesis de polímeros de alto tiro y la fabricación de nanopartículas se llevan a cabo siguiendo el protocolo descrito por Peterson et al. Como se menciona en el documento adjunto, el aparato de deposición automatizado utilizado para la funcionalización de partículas consta de tres bombas ne 1000, una etapa robótica integrada por dos actuadores, uno para el movimiento en la dirección X y el otro para el movimiento en la dirección Y y una segunda etapa robótica con dos bastidores adyacentes que constan de tres actuadores, Uno para cada dirección, las bombas y un total de cinco actuadores están conectados. En serie, los actuadores y las bombas son operados por una computadora que utiliza un software de vista de laboratorio.

Los sistemas de copolímeros utilizados para la fabricación de partículas se basan en ácido SEBA o SA y uno seis bis, carboxi paraico, heano oxilo oxi o CPH y un ocho BIS para carboxifenoxi tres seis dioxano o CP Teeg. Después del lugar de fabricación de nanopartículas, se realiza una gradilla que contiene los tubos de centrifugación de 1,7 mililitros con una biblioteca de nanopartículas a la etapa del actuador lineal para la unión de carbohidratos a la superficie de las partículas de poliana y se realiza una reacción de acoplamiento de ácido carboxílico medio que consta de dos reacciones consecutivas para la primera reacción. Llene una jeringa en una bomba de jeringa programable con una solución acuosa de EDC y etileno diamina a una concentración de dos miligramos por miligramo de nanopartículas y 0,6 miligramos por miligramos de nanopartículas, respectivamente.

Llene una segunda jeringa en una bomba de jeringa programable con 2,5 miligramos por miligramo de partículas de NHSA un total de 12 equivalentes por muestra de nanopartículas, una solución acuosa. A continuación, utilizando el programa de vista de laboratorio, indique al robot que deposite suspensiones de reactivos en la biblioteca de nanopartículas. A continuación, los actuadores del robot moverían el soporte del tubo a la posición correcta en la plataforma para la dispensación de soluciones, EDC y NHS.

Activar los grupos de ácido carboxílico en la superficie de las nanopartículas de polianhídrido y permitir un acoplamiento medio. A continuación, sumerja una sonda de sonicación en cada tubo y sonique cada muestra durante 30 segundos a 40 hercios. Antes de pasar a la siguiente muestra, limpie la sonda con acetona.

Una vez que todas las muestras están saciadas, el soporte del tubo se separa de la plataforma robótica. Incubar las suspensiones de nanopartículas durante nueve horas con rotación constante a cuatro grados centígrados. Los tiempos de reacción para la primera y segunda reacción se pueden cambiar para ajustar la concentración final de sacáridos.

Una vez completada la reacción, centrifugar los tubos a 12.000 veces G durante cinco minutos. En un ambiente frío, regrese a la estación robótica. Vuelva a colocar el soporte del tubo en el brazo robótico y llene la segunda jeringa en la plataforma robótica.

Con agua fría, la primera jeringa debe permanecer vacía. Encienda el robot. El sobrenadante de cada tubo se retira a la jeringa vacía y la segunda bomba deposita agua fría en los tubos.

Este paso se realiza para eliminar cualquier reactivo no reactivo de las suspensiones de nanopartículas. A continuación, homogeneice la suspensión de nanopartículas por sonicación como se ha demostrado anteriormente. A continuación, centrifugar los tubos a 12.000 veces G durante cinco minutos.

Realice un segundo lavado con agua fría utilizando el aparato robótico para la segunda carga de reacción: 12 equivalentes por muestra de nanopartículas de EDC en la primera bomba y 12 equivalentes por muestra de nanopartículas de NHS en la segunda bomba. Ponga en marcha la plataforma robótica para dispensar volúmenes adecuados en los tubos que contienen nanopartículas. La presencia de EDC y NHS permitirá la formación de un enlace amida entre los grupos amina de la dita de etileno ya unida a la superficie de la nanopartícula y el grupo ácido carboxílico del azúcar protegido en profundidad.

Una vez completada la deposición, cargue 10 equivalentes de un sacárido específico. En este caso, se utilizó lactosa y el control de ácido glicólico en las dos bombas disponibles. Cada sacárido se deposita en tubos de ensayo en función de la funcionalización deseada a conseguir en cada tubo, la cual se programa previamente en el programa de vista de laboratorio, utilizado para operar los actuadores y las funciones de la bomba para la reacción específica empleada en este estudio para la unión de carbohidratos, se utiliza el ácido glicólico como control enlazador ya que los sacáridos protegidos en profundidad ya tienen esta molécula unida covalentemente, lo que permite una mayor adhesión a la superficie de la nanopartícula.

Las suspensiones de nanopartículas se homogeneizan por sonicación como antes y luego se incuban durante nueve horas con una rotación constante a cuatro grados centígrados. Después de la incubación, lavar las suspensiones de nanopartículas por centrifugación eliminando el sobrenadante, luego Resus suspende el pellet en agua fría y coloca sónicamente los tubos, que ahora contienen la biblioteca de nanopartículas funcionalizadas, en una cámara de vacío para que se sequen durante al menos dos horas. Las nanopartículas funcionalizadas se caracterizan por la dispersión dinámica de la luz y otros métodos para evaluar la composición de la superficie, la concentración, el tamaño de las partículas, la distribución del tamaño y la carga superficial.

El lado diano totalmente protegido que se muestra aquí se sintetizó utilizando la plataforma de automatización. El compuesto sintetizado se caracterizó por RMN de protones en un espectrómetro VXR de 400 megahercios. Utilizando CDC 13 como disolvente, la formación del producto puede confirmarse a partir de la presencia de algunos picos característicos.

En el diagrama de RMN de protones, los cuatro protones de 1,79 a 2,21 y los dos protones de 3,38 son de la etiqueta de floristería. El pico singlete a 2,16 corresponde al pico de acetato, los picos a 4,94 y 5,11 son los protones anoméricos para evaluar el efecto del tiempo de reacción sobre la morfología final de las nanopartículas y el grado de unión de azúcares alcanzado. Las nanopartículas se funcionalizaron con tiempos de reacción crecientes como se muestra aquí, la concentración de diano en la superficie de las nanopartículas 50 50 CPT CPH aumentó con el tiempo total de reacción y alcanzó un máximo después de 18 horas.

A continuación, se utilizaron nanopartículas funcionalizadas con un tiempo de reacción total de 24 horas para evaluar su capacidad para dirigirse a las CLR en células dendríticas derivadas de la médula ósea de ratón mediante citometría de flujo, como se muestra aquí. Se observó un aumento de la expresión del signo DC y del receptor mano a los receptores de lectina de tipo C después de la estimulación con nanopartículas no funcionalizadas, así como con lactosa y dano funcionalizadas. Esto indica una segmentación eficaz.

Sin embargo, las partículas funcionalizadas con Diano mostraron un mayor nivel de expresión, lo que indica una especificidad de este ligando para los receptores estudiados. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar la síntesis automatizada de oligosacáridos de alto rendimiento, así como la funcionalización de polinanopartículas. Utilizando estos hidratos de carbono a base de agentes dirigibles, una vez dominada la síntesis del azúcar protegido aceptor donante, así como el montaje del aparato se puede realizar en 24 a 48 horas.

Por supuesto, la duración del tiempo depende del tamaño de la biblioteca, así como del tiempo de funcionalización. Al asistir a este método, es importante recordar que puede optimizar las condiciones de reacción de la funcionalización de polihidropartículas biodegradables en función de la química de la nanopartícula. Siguiendo este procedimiento, se pueden sintetizar varias estructuras de carbohidratos con el fin de dirigirse a diferentes receptores celulares para influir en el resultado inmunológico.