La preparación de Factor de Crecimiento Celular T a partir de esplenocitos de rata

Hola, soy Christine Beaton. Soy investigador asistente en el laboratorio de George Chen en el Departamento de Fisiología y Biofísica de la Universidad de California en Irvine. Y en los próximos dos días les voy a mostrar cómo preparar TCGF, que significa factor de crecimiento de células T.

Entonces, para nuestro cultivo celular diario, cuando no necesitamos un conocimiento preciso de la composición de las citocinas en el medio de cultivo, lo que usamos es el factor de crecimiento de células T, que es el sobrenadante S del cultivo spl CY que contiene las citocinas necesarias para ayudar a las células T a expandirse. Así que la forma en que preparamos el TCGF es cuando matamos ratas Louis sanas, tomamos sus bazos, preparamos una suspensión unicelular, nos deshacemos de los glóbulos rojos y luego las células mononucleares que vamos a estimular con carnaval en a, lo que va a inducir a las células T a producir todas las citoquinas necesarias para su crecimiento. Para generar el TCGF, necesitamos activar las celdas.

Así que la forma en que lo hacemos es que vamos a agregar lectina conval en forma abreviada como corona A a nuestro cultivo celular. Entonces, cuando agregamos el conc en a a nuestro cultivo celular, se unirá al complejo receptor de células T glicosiladas y se unirá a varios complejos al mismo tiempo, hará lo que llamamos taponamiento. Así que va a agregar, hacer un grupo de todos los receptores en la superficie de la célula y eso va a inducir una señal de activación en los linfocitos T.

Entonces, después de que las células se hayan activado, van a explotar. Así que se van a agrandar y luego van a empezar a secretar citoquinas. Así que originalmente pensamos que TCGF era principalmente interleucina dos, pero ahora sabemos que no es realmente el caso.

También contiene interferón gamma, TNF alfa y probablemente también citoquinas en cantidades muy pequeñas que son necesarias para mantener vivas las células después de 48 horas en cultivo, las células han producido todas las citocinas que necesitamos. Así que vamos a quitar las células y cuando hayamos eliminado las células y solo tengamos el sobrenadante, todavía tenemos algo de conal libre en a en el snat. Y eso va a ser un problema porque realmente queremos usar nuestro factor de crecimiento de células T para mantener las líneas de células T en crecimiento.

Y si dejamos el conval en un lugar libre, va a activar las células cuando no queremos que se activen. Entonces, para solucionar ese problema, vamos a agregar un exceso de azúcar que se unirá a todos los conc libres en a, en el ate. Por lo tanto, estará completamente inactivado y no se unirá a otros receptores glicosilados en las células cuando agreguemos el TCGF al cultivo.

Así que comencemos. El primer paso para este experimento es extraer el bazo de una rata justo después de la eutanasia. Así que eso es lo que voy a hacer de inmediato usando instrumentos estériles.

Y una vez que tenga los bazos fuera, los pondré en PBS suplementados con antibióticos y como antibióticos uso penicilina y estreptomicina. Así que comencemos. Así que rocío la rata con etanol al 70% para asegurarme de que no tengo ninguna contaminación de mi cultivo.

Y luego, usando mis instrumentos, voy a hacer un pequeño corte en la piel aquí. Luego quito una capa de músculo y el bazo aparece aquí mismo. Así que tomo otras pinzas, saco suavemente el bazo sin dañarlo.

Elimino el tejido conectivo de esta manera. Así que ahora tengo bazo. Por supuesto, tengo mucho cuidado de no dañar nada más dentro de la cavidad abdominal porque cualquier daño en el intestino va a provocar una contaminación inmediata de mi bazo.

Y luego voy a transferir mi bazo a un tubo que contiene PBS más antibióticos. Y este tubo lo mantengo en hielo. Así que ahora he cosechado el bazo de tres ratas.

Así que estamos listos para ir y preparar una suspensión de una sola célula a partir de esos bazos. Así que ahora que tengo mis bazos, los llevé a un cultivo de tejidos para preparar una suspensión de una sola célula a partir de ellos utilizando entrenadores de células de 70 micras. Así que voy a necesitar varias cosas para hacer la suspensión unicelular del bazo.

Necesito instrumentos estériles, un par de pinzas y un par de tijeras. Luego tengo el émbolo de una jeringa estéril de una milésima de pulgada en la placa de Petri. Voy a poner mi bazo en PBS más antibióticos.

Y en otra placa de Petri he puesto un colador de células de 70 micras en 10 mililitros de PBS más antibióticos. Así que el primer paso es asegurarse de que el bazo esté limpio porque, como pueden ver aquí, todavía hay pequeños trozos de tejido conjuntivo y voy a eliminarlos porque van a obstruir el filtro celular muy rápido. Entonces, para eso, simplemente corto lo que no quiero y lo descarto en la tapa de la placa de Petri.

Así que ahora mis bazos están en su mayoría limpios, así que voy a tomar los bazos uno por uno, ponerlos en el entrenador celular y cortarlos en trozos pequeños y mezclar los tres ples. El siguiente paso es hacer una suspensión de una sola célula. Así que, por supuesto, como quiero todo ster, no toco el entrenador celular en absoluto y uso el émbolo de una jeringa estéril de una milésima de pulgada para presionar mis pedazos de bazo a través del entrenador celular.

Y como puedes ver en el exterior del entrenador de celdas, tengo una suspensión de una sola celda que se está fabricando. Así que la primera vez todavía tengo algunos trozos pequeños de bazo, pero ya voy a sacar la suspensión de una sola celda. Ya lo he transferido a un tubo de 50 mil que tengo almacenado en hielo.

Y voy a volver a llenar mi colador de células con 10 milésimas de pulgada más de PBS y antibióticos. Así que tomo 10 miladas más de mi PBS con antibióticos aproximadamente, no tiene que ser muy precisamente 10 minutos, solo nos estamos lavando. Lo pongo en el colador de celdas y luego uso el mismo procedimiento.

Vuelvo al émbolo de la jeringa y presiono un poco más a través del ocid. Así que, por supuesto, nunca se pasa todo porque hay tejido conjuntivo y pequeños trozos de grasa que no pude eliminar y que van a permanecer en el filtro de células. Sin embargo, debe obtener la mayor parte de su bazo para el filtro de células.

Y luego repito exactamente lo que hice antes. Voy a cosechar mi suspensión unicelular y agregarla al mismo diente. A estas alturas ya no queda casi nada de la pantalla en el cribado de celdas y el PBS que sale es mucho más claro Y simplemente voy a lavarme una vez más y ya deberíamos tener la mayoría de las celdas fuera.

Así que ahora tengo mi suspensión unicelular de citos PLE y voy a girarlos simplemente para paletizarlos. Por lo tanto, girar durante ocho a 10 minutos será suficiente. Así que ahora hemos reducido nuestros citos PLE y tenemos una bonita paleta.

Así que lo que voy a hacer es deshacerme del sobrenadante y luego voy a analizar los glóbulos rojos. Así que voy a suspender miocitos y voy a usar cloruro de amonio. Así que es una SU una solución de cloruro de amonio molar oh punto 15 y voy a usar cinco mililitros por bazo.

Entonces, como tenía tres bazos, voy a usar 15 mililitros de cloruro de amonio y lo voy a hacer con hielo. Así que para los eritrocitos, voy a canalizarlos suavemente hacia arriba y hacia abajo durante tres minutos. Bien, usaremos esta toma con la exposición más alta aquí.

Así que ahora he analizado los electrocitos durante tres minutos. Voy a llenar mi tubo con PBS o también podrías usar medio. Eso es para que la osmolaridad de la solución vuelva al rango normal para las células.

Y voy a girar las células hacia abajo como lo hice anteriormente durante ocho a 10 minutos para pelletizarlas. Y luego los lavaré dos veces usando el mismo PBS con antibióticos. Así que ahora nos extendemos por las celdas después de los electrocitos y no se preocupen, nunca obtenemos liberaciones del cien por cien de los electrocitos.

Por lo tanto, la paleta seguirá siendo roja, pero el sobrenadante será más claro. Y ahora voy a vaciar el sobrenadante, romper la paleta, agregar un poco de PBS hasta 50 mil, centrifugar y repetir ese paso una vez más para que tenga dos lavados y luego pueda contarme. He lavado miocitos dos veces y luego los he suspendido en medio de cultivo y los he contado con su citómetro.

Como era de esperar. De tres bazos obtuve alrededor de 600 millones de células, lo cual es de esperar ya que un bazo normalmente nos da de 200 a 250 millones de células. Así que lo que voy a hacer ahora es sembrar mis células a 2 millones por millar en mi medio que ha sido suplementado con un 10% de suero cal fetal.

Y a ese medio le voy a añadir dos microgramos por millar de conc A para estimular las células. Y después de eso, simplemente voy a poner las células en la incubadora durante 48 horas. Las células han estado en la incubadora durante 48 horas y, como les mostraré, han crecido bastante bien.

El medio se ha vuelto naranja. Así que ahora estamos listos para terminar nuestra preparación para el TCGF. Como recordarán, agregué con carnaval en una suspensión en mi celular para activar las células.

Así que el con carnaval en a es lectin. Va a unir los azúcares en todos los receptores de la célula T y va a activar artificialmente todas esas células. El problema que tenemos ahora es que todavía tenemos algo de la con carnaval en a, en el sobrenadante de la celda S.

Y como vamos a usar un snat en otros cultivos de células T para expandir las células, no queremos que el con carnaval esté presente en esos cultivos celulares. Entonces, para deshacerme de él, lo que voy a hacer es agregar un exceso de azúcar al que se une el connaval en a, y ese es el cito de metilo alfa D que se muestra aquí. Y voy a añadir un exceso de este azúcar para disolverlo por completo.

Va a unir todos los conc navales restantes en un Y una vez hecho esto, voy a filtrar estérilmente mis sobrenadantes celulares y voy a congelar líquidos Ali para usarlos en las próximas semanas o meses. Así que comencemos con este último paso. Así que estoy agregando mi sobrenadante de cultivo celular a tubos de 50 milésimas de pulgada para poder girarlos y deshacerme de las células.

Así que simplemente lleno tantos tubos como sea necesario y no lo hago en la campana de cultivo, podría, pero como necesito cualquier forma de filtrar mi, mi solución al final porque estoy agregando el azúcar, que no es estéril, simplemente lo hago en el banco. Es más fácil. Ahora he vertido todas mis células y sobrenadante en mis tubos de halcón de 50 milésimas de pulgada.

Así que los llevaré a la centrífuga y los haré girar durante unos 10 minutos. Y la única razón para girarlos es pellet las células para tener sobrenadantes claros. Las celdas ahora se han extendido hacia abajo, por lo que el sobrenadante es claro y eso es lo que quería recolectar.

Así que voy a recoger todo el sobrenadante en un matraz limpio de 150 centímetros cuadrados. Y a este frasco le voy a añadir el azúcar. Así que mientras las células giraban, pesé suficiente azúcar para añadir 15 miligramos por ml de sobrenadante.

Voy a dejar que se disuelva por completo, y después de eso voy a filtrar estérilmente mi sobrenadante. Así que ahora voy a añadir el azúcar 15 miligramos por ml de sobrenadante. Vuelvo a poner la tapa y como no estoy trabajando en condiciones estériles, no importa si la comida entra en la tapa, así que mezclo hasta que se disuelva todo el azúcar.

Eso debería ser bastante rápido. Sí, todo el azúcar se ha disuelto ahora. Así que todo lo que tengo que hacer es que el filtro estéril es sobrenadante y luego voy a alícuota.

Así que normalmente hago de 10 a 15 mil alícuotas que almaceno a menos 20 grados. Alícuotas como esa se pueden almacenar durante varios meses. También puede almacenar su TCGF en el refrigerador, pero luego lo usaría dentro de los próximos 10 a 15 días.

Durante los últimos dos días, les he mostrado cómo preparar el factor de crecimiento de células T, y este sobrenadante es muy simple de hacer y es muy barato de preparar. Por lo tanto, lo usamos muy a menudo en el laboratorio para mantener nuestras líneas de células T en cultivo sin tener que comprar costosos cócteles de citoquinas. Así que buena suerte con tus experimentos.