Citometría de flujo basado Purificación de

El objetivo general del siguiente experimento es generar una población purificada de zigotos de levadura. Esto se logra primero expresando zonas poli marcadas con GFP citoplasmático o M cherry. En células haploides de tipo de apareamiento opuesto, las células se cultivan hasta la fase logarítmica, luego se combinan e incuban conjuntamente para permitir la formación de zigotos.

La mezcla de apareamiento se cosecha y se clasifica mediante citometría de flujo en modo de recuperación para aislar las células doble positivas para rojo y verde. Esta subpoblación incluye tanto entidades prezigóticas como zigóticas. Para purificar aún más la muestra, la población doble positiva para rojo y verde se somete a una segunda ronda de clasificación por citometría de flujo.

Utilizando el modo de pureza. Este procedimiento proporciona una pureza promedio del 90 % de cigotos basada en el examen visual y la cuantificación de las células mediante microscopía fluorescente. Las ventajas de esta técnica frente a los métodos existentes, como la purificación basada en sedimentación, son las siguientes.

Primero, esta técnica proporciona una evaluación visual conveniente de la pureza y maduración del cigoto. Segundo, en nuestra experiencia, la pureza promedio de la fracción cigótica es aproximadamente del 90 %, mucho más alta que la de otros métodos existentes. Nuestro método de purificación puede ayudar a responder preguntas biológicas clave sobre la transición haploide a diploide en células eucariotas a nivel molecular, ya que existe una conservación considerable entre eucariotas inferiores y superiores.

Por lo tanto, el estudio de los zigotos de levadura debería promover una comprensión general de la biología del zigoto. Podría argumentarse que los zigotos también pueden considerarse un modelo para la función de células progenitoras o células madre. Cultive cepas S. cerevisiae MATa y MATα BY4741. Siembre células mediante el rayado de cultivos congelados de levadura sobre medio de crecimiento en agar sólido e incube las placas a temperatura ambiente o a 30 grados Celsius hasta que aparezcan colonias, el día anterior a la purificación de los zigotos. Etiquete dos tubos cónicos de 50 mililitros para el cultivo de tabloides transformados como GFP soluble y RPL25-MCherry. Inocule un cultivo con tabloides transformados que expresen GFP soluble en el citoplasma, y otro con tabloides transformados que expresen una única proteína ribosomal.

RPL 25 fusionado con mCherry. Incube los cultivos con agitación durante la noche a 23 grados Celsius para alcanzar una A600 que no supere 1,0. A continuación, para realizar un cruce, comience ajustando la densidad óptica de cada muestra a 1,0 en medio fresco, aproximadamente equivalente a tres veces 10 a la séptima células por mililitro.

A continuación, mezcle volúmenes iguales de las dos culturas en medio fresco, en un tubo cónico de 50 mililitros. Vortex brevemente tres veces, luego vortex durante 10 segundos. Coloque una punta de pipeta una vez un centímetro por encima de la superficie de una habitación.

Placa de glucosa CSM a temperatura. Inicie un temporizador para contar hacia atrás desde 30 minutos e inmediatamente distribuya gotas de 40 microlitros de las culturas mezcladas a lo largo de la periferia de la placa, cubriendo la circunferencia. Deje secar las placas sobre la superficie del banco con la tapa retirada durante aproximadamente 30 minutos.

Una vez que el líquido haya sido absorbido, cubra las placas y déjelas sin perturbar a temperatura ambiente durante 1,75 a 2,5 horas. El proceso de crecimiento polarizado genera la morfología característica similar a un schmo. Durante la fase schmo, las dos células haid continúan creciendo una hacia la otra hasta lograr el contacto célula-célula.

La fusión celular subsiguiente da lugar a la formación del cigoto. El cigoto incipiente luego reingresa al ciclo celular mitótico, dando origen a su primer brote diploide. Tras la incubación, coloque las placas sobre hielo y recopile las muestras lavando individualmente las áreas de gotas secas de 10 a 20 veces con 150 microlitros de CSM glucosa frío.

Recoger la solución de lavado en tubos cónicos de 15 mililitros sobre hielo. A continuación, manteniendo las muestras sobre hielo, sonicar cada tubo con sonda 10 veces al 60% de amplitud. Tras la sonicación, verificar mediante microscopio de contraste de fases que queden pocos o ningún agregado; se espera que del 15 al 50% de las células hayan formado zigotos. En este punto, dejar el tubo de células en posición vertical, sin perturbar, sobre hielo durante 10 minutos como precaución para permitir que cualquier agregado restante se sedimente.

Recupere el 90 % superior del volumen y filtre a través de un tubo de polipropileno con malla de nailon y tapa con colador. En un experimento típico, se recuperan 10 a la séptima células de una placa y cuatro mililitros de CSM. La clasificación celular por glucosa se realiza utilizando un citómetro de flujo modelo Sony Eyesight Reflection con un HAPS uno con punta de 100 micrones.

Comience seleccionando los láseres de excitación en el software win list 3D para la excitación de GFP. Utilice el láser azul de argón de 500 milivatios a 488 nanómetros para la excitación de M cherry. Utilice el láser de 100 milivatios a 561 nanómetros en el software de control HAPS.

Asegúrese de que esté seleccionado el modo de recuperación y de que la presión de la envoltura para la clasificación se haya ajustado a 21,5 libras por pulgada cuadrada, con una frecuencia de gotas de 43.400 gotas por segundo y una presión de muestra de 20,5 libras por pulgada cuadrada. Establezca los parámetros de clasificación basándose en un gráfico de dispersión directa versus dispersión inversa para delimitar las células viables. Tenga en cuenta que el equipo Sony Eyesight utilizado aquí indica de forma única el gráfico de dispersión lateral como dispersión inversa, pero esta dispersión inversa es funcionalmente equivalente a la dispersión lateral. Establezca un gráfico de emisión de M-cherry versus GFP para dividir los eventos en cuatro cuadrantes.

Rojo positivo, verde positivo, rojo negativo, verde positivo, rojo positivo, verde negativo y rojo negativo, verde positivo. Utilice células no fluorescentes como estándar para la determinación del cuadrante rojo negativo, verde negativo. Para el ordenamiento inicial.

Seleccione el modo de recuperación y recopile las muestras en tubos de microcentrífuga enfriados que contengan 250 mililitros de CSM glucosa frío. Tras la recopilación, sedimente las células durante 10 segundos a velocidad máxima en una microcentrífuga refrigerada; tras la centrifugación, aspire la solución de flujo y resuspenda las células en 500 microlitros de CSM glucosa frío.

Dado que no se logra un alto enriquecimiento con un solo ordenamiento, sonique brevemente la muestra parcialmente purificada dos veces al 60 % de amplitud. Ordene las células nuevamente, esta vez utilizando la opción de modo de pureza, seleccione las células viables y establezca un gráfico de emisión de M-cherry versus GFP del sedimento, las células purificadas y re-suspenda los pellets en 0,5 a 1,0 mililitros de CSM con glucosa. Después de la centrifugación, transfiera 0,5 mililitros a cada uno de los pocillos de placas de 24 pocillos y luego agite las células durante 15 minutos.

En placas de 24 pocillos a 23 grados Celsius para permitir la recuperación metabólica. Para preparar los almohadillados de agros, llevar una suspensión de agros al 1,5% en glucosa CSM a ebullición en un tubo cónico de 15 mililitros. Vortexar brevemente la solución y luego aplicar muestras de 0,3 mililitros de la solución de agros sobre la superficie de al menos dos o tres portaobjetos de vidrio estándar; inmediatamente cubrir los portaobjetos con un segundo portaobjeto.

No aplique presión. Deje enfriar las laminillas durante 10 minutos. Si los discos aros no se van a usar inmediatamente, colóquelos en una cámara humidificada a temperatura ambiente sin retirar la laminilla superior.

Estos se pueden almacenar hasta por un día. Luego, retire suavemente la cubierta superior deslizándola horizontalmente. Tenga cuidado de dejar una superficie lisa y de no perturbar rápidamente la capa de aros; dentro de uno o dos minutos, deposite alícuotas de un microlitro de células sedimentadas sobre las almohadillas de aros sin tocar la superficie.

Cubra inmediatamente la muestra con un cubreobjetos cuadrado y recorte el exceso de agarosa utilizando una cuchilla de afeitar de borde único. Use una jeringa para dispensar gel de petrolato a lo largo de los bordes del cubreobjetos. Capture imágenes usando un sistema Delta Vision con un objetivo de inmersión en aceite de 100x sin binning. Un campo ideal es aquel que muestra una sola capa de células con suficiente espacio entre ellas para distinguir células individuales. Realice la adquisición de imágenes con intervalos de 0,2 a 0,4 micrones una vez completada la captura.

Devuelva Zacks utilizando el programa Soft Works 5.0 0.0 y procese mínimamente con una desconvolución estándar de 20 ciclos. Ajuste la intensidad de la fluorescencia roja frente a la verde para minimizar cualquier señal de fondo en las imágenes DeVol y evaluar así la expresión de las proteínas fluorescentes en las células transformadas. Las células se analizaron mediante citometría de flujo antes y después de realizar un cruce, previo al cruce. Esencialmente, todos los transformantes M cherry fueron rojos y todos los transformantes GFP fueron verdes.

Téngase en cuenta que, aunque la señal de M cherry fue menos intensa que la señal de GFP, se detectó tanto mediante citometría como mediante microscopía de fluorescencia. Las células se clasificaron y se seleccionaron las células más brillantes, que aparecen en el cuadrante R dos, y se cultivaron junto con la transformación GFP durante 2,5 horas, como se puede observar aquí. La muestra positiva para rojo y verde representó el 8,89 % de la población total tras el cruce.

Esto se enriqueció hasta un 52,4 % tras la primera clasificación de recuperación, y luego se enriqueció aún más mediante la segunda clasificación de pureza al examinar 21 preparaciones similares de células rojas positivas y verdes positivas mediante microscopía de contraste de fases. Para evaluar el número de cigotos, la pureza promedio fue del 90 %. Los contaminantes eran haploides verdes o rojos, o pares de haploides que estaban en contacto, con el fin de determinar la cinética de la aparición inicial del brote cigótico, así como la incidencia y distribución de las ubicaciones del brote cigótico mediales, laterales y terminales. Los haploides se cruzaron durante 1,75 horas o 2,5 horas, se clasificaron mediante citometría de flujo y luego se examinaron mediante microscopía epifluorescente.

Cuando las células se recolectaron tras 1.75 horas, más del 50 % estaban sin brotar y mediales. Los brotes laterales o terminales estuvieron igualmente representados tras 2.5 horas. Sin embargo, había aproximadamente un número igual de zigotos en cada una de las cuatro categorías: sin brotar con brotes mediales, laterales o terminales.

La estructura de los cigotos parece permanecer sin cambios durante la purificación. Tenga en cuenta que la GFP entra al núcleo y puede encontrarse en el núcleo incluso cuando los núcleos no se han fusionado. Los ES se destacan como esferas negras no fluorescentes.

El producto final de la purificación produce una población diversa en distintas etapas de desarrollo. Los cigotos etiquetados como A no han llevado a cabo la fusión. Los cigotos tipo B no están fecundados.

Los de tipo C tienen un brote pequeño, los de tipo D tienen un brote más grande, y los zigotos de tipo E están a punto de experimentar citocinesis; obsérvese también que muchos de los zigotos más tempranos aún exhiben una línea de división medial no fluorescente y que la estructura de herencia valar a menudo puede verse extendiéndose desde el zigoto hacia el brote. Al realizar este procedimiento, es importante incluir tanto la clasificación de recuperación como la clasificación subsiguiente de pureza. Descubrimos que la segunda clasificación es fundamental para aumentar la pureza zigótica del producto final.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar un cruzamiento, generar cigotos purificados mediante citometría de flujo, evaluar la pureza mediante métodos microscópicos y cómo montar y fotografiar cigotos utilizando microscopía de desconvolución fluorescente.