De dos y tres dimensiones imágenes de células vivas de las proteínas de respuesta al daño del ADN

Esta demostración utiliza imágenes de células vivas en dos y en 3D para comprender las relaciones espacio-temporales de las proteínas involucradas en la respuesta al daño del ADN. En primer lugar, transfecte o transduca la línea celular de su elección con construcciones de expresión que contengan marcadores fluorescentes adecuados. Aquí, M Cherry y GFP adquieren una serie de videos de control que muestran las células marcadas con fluorescencia en condiciones normales.

A continuación, aplique un tratamiento adecuado y capture los datos de los efectos del tratamiento en el proceso de células fluorescentes y analice los datos de vídeo para las relaciones espacio-temporales de las proteínas. En última instancia, la microscopía de fluorescencia de células vivas puede detallar la dinámica celular como la formación de focos 53 BP uno en respuesta a agentes que dañan el ADN o el comportamiento de 53 BP uno durante la mitosis. La primera vez que nos interesamos fue en las imágenes de estilo de vida en dos y en 3D cuando quisimos estudiar cómo los distintos tratamientos afectaban a la mitosis en ciertas líneas celulares.

Este enfoque experimental nos permite estudiar la respuesta al daño del ADN y el mantenimiento de la estabilidad genómica más fácilmente que los métodos tradicionales. Además, puede utilizar este método para estudiar cómo interactúan ciertas proteínas en varias vías de señalización y varias líneas celulares. La principal ventaja de las imágenes de estilo de vida sobre las técnicas tradicionales como la citoquímica es que permite el estudio de las proteínas de respuesta al daño del ADN en tiempo real.

Optimizar las condiciones de grabación adecuadas puede ser un reto. Esta demostración se puede utilizar para ver los muchos pequeños pasos necesarios para garantizar el éxito. Recuerde que la persistencia vale la pena cuando se trata de minimizar el blanqueo de fotos, encontrar los intervalos de grabación correctos y la duración de grabación correcta, etc.

Transfectar o transducir las líneas celulares apropiadas con los plásmidos para la expresión de proteínas de fusión mCherry y GFP. Mantener los cultivos bajo selección de fármacos y comprobar periódicamente la expresión de las proteínas fluorescentes el día antes de la adquisición de la imagen. Recolecta las células usando tripsina.

A continuación, siembre cultivos de baja densidad en placas de fondo de vidrio con flúor de 3,5 centímetros. Este protocolo se desarrolló utilizando el microscopio confocal de disco giratorio Zeiss cell observer SD, equipado con un axio observador Z one stand En primer lugar, verifique que el gas CO2 esté corriendo hacia el módulo de CO2 del sistema de incubación. Si el microscopio está soportado por una Airtable antivibración, abra el suministro de aire de la Airtable.

Ahora encienda la alimentación del soporte del microscopio, las cámaras de la unidad de disco giratorio, los módulos de incubación, el iluminador HXP, la platina motorizada, el láser de argonne y la computadora. Encienda los interruptores de las líneas láser que se van a utilizar. Inicie el software de visión Axio.

El software Avision se puede personalizar con ventanas y menús desplegables que son específicos del microscopio y los componentes que controla. Como tal, cada interfaz de usuario tiene un aspecto potencialmente único Aproximadamente una hora antes de la toma de imágenes. Ubique los controles de la incubadora y encienda la calefacción de la cámara superior y la placa de la etapa.

Ajuste la temperatura a 37 grados centígrados. Encienda el control de CO2 y ajuste el nivel al 5%Seleccione la lente del objetivo para la toma de imágenes en este estudio. La lente del objetivo requiere el uso de un medio de inmersión que tenga un índice de refracción similar al agua.

Si necesita obtener imágenes de varias posiciones durante largos períodos de tiempo, asegúrese de aplicar suficiente medio de inmersión para que el visor no se seque. Coloque la placa de cultivo en la platina y ponga la lente del objetivo en contacto con la parte inferior, utilizando los controles del microscopio o el software. Dirija la luz emitida a los oculares y seleccione el conjunto de filtros de campo amplio adecuado para la señal fluorescente de interés.

Ahora mira a través de las lentes oculares. Enfoque la imagen y localice un campo adecuado de células utilizando el software o los controles del microscopio. Dirija la luz emitida lejos de los oculares hacia el puerto con la unidad de disco giratorio confocal en el software.

Encienda el láser adecuado para este estudio. Para cada canal, ajuste la intensidad del láser ajustando el control de filtro sintonizable de kuo optic a un nivel apropiado. A continuación, seleccione el espejo dicroico y los filtros de emisión adecuados.

Abra el obturador de la unidad de disco giratorio. Ahora seleccione la ventana en vivo para mostrar el campo de visión actual. Ahora abra la ventana de control de la cámara.

Seleccione la cámara que se va a utilizar y ajuste el tiempo de exposición a aproximadamente 100 milisegundos. Ajuste el porcentaje y la ganancia EM según sea necesario. Además, abra el control de la unidad de disco giratorio confocal y ajuste la velocidad del disco giratorio ingresando el tiempo de exposición de la cámara que se configuró para capturar una imagen adecuada.

Haga clic en establecer para bloquear el cambio. Ahora abra la ventana de adquisición multidimensional. Seleccione la pestaña de canales y cargue o seleccione los canales apropiados definidos para los Flora Fours.

Para garantizar el registro de la imagen, utilice un espejo dicroico común para ambos canales. Configure el software en enfoque automático. Vaya a la ventana de MDA y haga clic en la pestaña de pila ZS.

Seleccione la pila ZS en la posición de enfoque actual. Establezca el rango para un Zack de 10 micras y elija óptimo para el número de pasos para garantizar el muestreo de nyquist a través de Z.Ahora haga clic en iniciar y analice la imagen de pila Z resultante. Seleccione la pestaña de tiempo.

Establezca el intervalo entre los puntos de tiempo de la imagen y la duración total de la sesión. Para obtener imágenes multipunto de varias células en la placa, abra la ventana MDA. Seleccione la pestaña de posición y compruebe que la opción Aplicar antes o después del punto de tiempo por posición esté marcada.

Ahora seleccione marcar. Buscar usando la vista en vivo, mueva la antena y seleccione los campos de vista apropiados. Haga clic en Iniciar en el menú de adquisición multidimensional para comenzar el experimento y grabar un vídeo de control.

Proceda a agregar el tratamiento adecuado y grabe el video experimental a intervalos de tiempo determinados durante un período de tiempo definido. Para esta línea celular y para el seguimiento de todo el proceso de mitosis, utilizamos un intervalo de siete minutos y medio y lo hicimos durante cuatro o cinco horas. Tendrá que determinar la configuración particular para su línea celular y para lo que desea estudiar.

Abra el software de velocidad, cree y asigne un nombre a una nueva biblioteca e importe los archivos de video experimentales para ver los archivos. Intente usar la configuración de enfoque extendido, ajuste los videos según sea necesario. Velocity está equipado con una gama de herramientas para ayudar a mejorar la calidad de las imágenes adquiridas.

Si la configuración del microscopio es adecuada, ahorrará mucho tiempo más adelante en la edición. A menudo, es útil delegar las imágenes y ajustar el brillo y el contraste, sus necesidades específicas variarán en función de su experimento para ver las celdas en 3D. Cambie a la configuración de opacidad 3D.

Esto permite la rotación de las celdas renderizadas en 3D en el espacio, proporcionando así múltiples perspectivas de las estructuras de interés dentro de las celdas. Cine. Las imágenes fijas se pueden exportar a una variedad de tipos de archivos según las preferencias del usuario en comparación con los controles. Las células de fibroblastos expuestas a CPT formaron focos en un plazo de cinco a 10 minutos y mantuvieron estos focos durante todo el registro.

Curiosamente, en las células de riñón embrionarias humanas, 53 BP uno se disocia de la cromatina al inicio de la mitosis, formando una fina neblina alrededor de los cromosomas en condensación. A medida que se produce el télef y la mitosis llega a su fin, 53 BP uno, una vez más, se agrega en focos distintos. Esperamos que este vídeo te permita estudiar las relaciones espacio-temporales de las proteínas implicadas en la respuesta al daño del ADN, así como otras vías.

Por ejemplo, en el campo de la dinámica de la cromatina, esta técnica se utilizó para estudiar cómo la unión de 53 BP one afecta el movimiento de los extremos teloméricos del ADN. Después de la creación de células modificadas genéticamente, se pueden realizar imágenes de células vivas en dos y 3D en aproximadamente cuatro a ocho horas. Asegúrese de que la configuración del microscopio esté ajustada adecuadamente para obtener imágenes óptimas.