Name: De dos y tres dimensiones imágenes de células vivas de las proteínas de respuesta al daño del ADN (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-28T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: Aprende a visualizar proteínas de respuesta al daño del ADN mediante imágenes de células vivas en dos y tres dimensiones. Este método permite estudiar la dinámica celular y las relaciones espaciotemporales de proteínas como 53BP1 durante la mitosis.

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Apoyado en parte por R01NS064593 y R21ES016636 (KV). Microscopía se realizó en la UCV - Departamento de Servicio de Microscopía Neurobiología y Anatomía, apoyada, en parte, con fondos del NIH NINDS subvención 5P30NS047463 Center núcleo. El microscopio confocal de disco giratorio se compró con un premio NIH-CNRR (1S10RR027957).

A. Preparación de la célula <ol><li> Fibroblastos humanos normales primarios (GM02270) se obtuvieron de Coriell Cell Repository, Camden, Nueva Jersey, y se inmortalizan con hTERT 6. Las células se hicieron crecer y se expandieron en CellStar 6 cm de platos en los medios de comunicación (4 ml) que consiste en MEM suplementado con 20% fetal suero bovino (GIBCO), non-essential/essential aminoácidos, vitaminas, piruvato de sodio, y penicilina / estreptomicina (HyClone ). </li><li> De riñón embrionario humano 293 (HEK293) las células se obtuvieron a partir de American Type Culture Collection y se desarrollaron y se expandieron en CellStar 6-cm platos. Las células se mantuvieron en medios de comunicación (4 ml) que consiste en DMEM suplementado con fetales 10% de suero bovino, no aminoácidos esenciales, L-glutamina, y penicilina / estreptomicina. </li><li> 53BP1 mCherry-(N-Myc-53BP1 PESO pLPC-Puro; Addgene plásmido 19836) y H2B-GFP (pCLNR-H2BG; Addgene plásmido 17735) gen constructos de fusión también expresar puromicina o genes de resistencia a G418, respectivamente, fueron transducidas (fibroblapts) o transfectadas (HEK293) utilizando SuperFect (Qiagene) en las células y se mantiene en la selección de medicamentos. Mantenimiento de la fluorescencia se comprobó periódicamente. </li><li> 24-48 h antes de la adquisición de imágenes, las células se trataron con tripsina en una única suspensión de células y se sembraron a una densidad baja en placas de 3,5 cm de FluroDish fondo de cristal. </li></ol> B. Configuración del microscopio y de adquisición de imágenes Este protocolo fue desarrollado utilizando la Célula Zeiss Observador SD hilado disco microscopio confocal equipado con un AxioObserver Z1 stand, un dual-channel Yokagawa CSU-5000 X1A girar la unidad de disco, 2 Fotometría QuantEM 512SC cámaras EMCCD, un HXP 120C a base de fibra de iluminación, 4 láseres (un Lasos 100mW de varias líneas de argón [458, 488, 514 nm], 50 mW diodo 405 nm, 40 mW diodo 561 nm y 30 mW diodo 635 nm), AOTF, un Pecon XL etapa multiS1 sistema de incubación, incubación Zeiss módulos (Módulo de O 2 S, CO 2 Módulo S, S TempModule, Calefacción Unidad XL S) y un Prior motorized XY etapa con un inserto NanoScanZ piezo Z. Para reducir al mínimo las aberraciones esféricas, mientras que las células de formación de imágenes en vivo apoyado en un medio acuoso, un Agua C-Apochromat 63x/1.20 / Corr objetivo y lente Zeiss Immersol fluido de inmersión W (con un índice de refracción n = 1,334) fueron utilizados. Para canal 2 confocal de imágenes, un RQFT 405/488/568/647 espejo dicroico y BP525/50 (verde) y BP629/62 (rojo) se utilizaron filtros de emisión. El software del sistema utilizado fue Zeiss Axiovision (ver. 4.8.2.0) con AV4 Multi-channel/Z/T, Fast Imaging, Fisiología, Mosaix, Mark &amp; ​​Find, de doble cámara, Interior 4D, enfoque automático y 3-D módulos de deconvolución. <ol><li> Asegúrese de que el CO 2 gas se está ejecutando para el CO 2 Módulo del sistema de incubación. Si el microscopio se apoya en una mesa de aire anti-vibración, abra el suministro de aire (o gas N2) para la tabla del aire. </li><li> Encienda la alimentación del trípode del microscopio, la unidad de disco giratorio, las cámaras, los módulos de incubación, iluminación HXP, platina motorizada, Argonláser, y el ordenador. </li><li> Después de 1 minuto de tiempo de calentamiento, gire la llave de contacto para que el láser de argón a &quot;On&quot;. </li><li> En el panel de control del láser Zeiss, encienda los interruptores de las líneas de láser que se utilizarán. </li><li> Apague el interruptor de palanca para el controlador Lasos láser de argón de &quot;espera&quot; a &quot;run láser&quot; y ajustar el regulador de luz para el nivel óptimo (es decir, justo por debajo del punto en que el indicador verde se vuelve roja). </li><li> Inicie el software AxioVision Nota:. La interfaz de usuario para AxioVision pueden ser personalizados con menús de las ventanas y tirar hacia abajo que sean específicos para el microscopio especial y los componentes que lo controla. Como tal, cada sistema tiene una interfaz potencialmente única. Por lo tanto, las instrucciones generales para la manipulación de software se proporcionan en los siguientes pasos, en lugar de direcciones para las ventanas de software específicos, fichas y / o menús desplegables. </li><li> Aproximadamente 1 h antes de la formación de imágenes, en el software, localizar los controles de la incubadora yencender la calefacción de la cámara superior y la placa de la platina. Ajustar la temperatura a 37 ° C. Encienda el CO 2 Control y ajuste el nivel del 5%. </li><li> Seleccione la lente objetivo para formación de imágenes. En este estudio, un 63x/1.20 NA C-Apochromat Agua / Corr lente objetivo se utilizó Nota:. Para este objetivo, un medio de inmersión con un índice de refracción similar al del agua (Zeiss Immersol fluido de inmersión W) es necesario. </li><li> Si múltiples posiciones separadas son objeto de muestreo durante un largo período de tiempo, de aplicar una cantidad suficiente de medio de inmersión para asegurar que es transportada desde una posición a otra. </li><li> Colocar el plato de la etapa y llevar la lente del objetivo arriba en contacto con el fondo. </li><li> Usando los controles del microscopio o del software, dirigir la luz emitida a los oculares y seleccione el filtro de campo amplio establecido para la señal fluorescente de interés (para este estudio, &quot;Red&quot; filtro para 53BP1 y un &quot;buenas prácticas agrarias&quot; filtro para H2B ). &lt;/ Li&gt; <li> Ver a través de las lentes oculares, enfocar la imagen, y localizar un campo adecuado de células. </li><li> Utilizando el software o los controles del microscopio, dirigir la luz emitida fuera de los oculares al puerto con la unidad de disco giratorio confocal. </li><li> En el software, encienda el láser adecuado (para este estudio, el láser nm 561 por 53BP1 y la línea de 488 nm del láser de argón para H2B). </li><li> Para cada canal, ajustar la intensidad del láser mediante el ajuste del filtro acústico-óptico sintonizable (AOTF) de control a un nivel apropiado. </li><li> Seleccione el espejo dicroico apropiado (RQFT 405/488/568/647) y filtros de emisión (BP 629/62 para 53BP1 y BP 525/50 para H2B). Abrir el obturador a la unidad de disco giratorio. </li><li> Seleccione la opción &quot;Live&quot; ventana para mostrar el actual campo de visión. </li><li> En el software, abra el &quot;cámara&quot; de control, seleccione la cámara que desea utilizar (si es un sistema de cámara dual) y establecer el tiempo de exposición a aproximadamente 100 ms. Ajuste el% y ganar EM como necsario Nota:. La construcción 53BP1-mCherry parece un tanto débil. Nos pareció que es útil para aumentar la ganancia EM. </li><li> En el software, abra el control de la unidad de disco giratorio confocal y ajustar la velocidad de giro del disco introduciendo el tiempo de exposición de la cámara que se configuró para capturar una imagen adecuada (por ejemplo, ~ 100 ms). Haga clic en &quot;Set&quot; para guardar los cambios. </li><li> Abra &quot;multi-dimensional de adquisición&quot;. Seleccione la pestaña de canales y cargar / seleccionar los canales apropiados. Para este estudio, estamos utilizando canales definidos para dsRed (561 nm láser de excitación y BP 629/62 filtro de emisión) y las buenas prácticas agrarias (488 nm láser de línea para la excitación y BP525/50 filtro de emisión). </li><li> Para asegurar el registro de imagen, un espejo dicroico común (RQFT 405/488/568/647) se utilizó para ambos canales. Configure el software de &quot;Autofoco&quot; Nota:. Vaya a Herramientas → Configuración de editor para ajustar los valores de MDA. Asegúrese de que la potencia del láser adecuado se establece (&quot;láser de potencia adecuada&quot; se refiere a una opción que le permitepara excitar el fluoróforo apropiado mientras se minimiza foto-blanqueamiento). </li><li> En la ventana MDA, seleccione la pestaña z-stack. Seleccione &quot;Z-stack en la posición de foco actual&quot;. Ajuste el rango de ~ 10 m z-pila y elija &quot;óptimo&quot; para el número de pasos para asegurar un muestreo de Nyquist a través de Z. Nota: El tamaño exacto de la z-stack dependerá de la altura de sus células. Ajuste en consecuencia. </li><li> 23. Haga clic en &quot;Inicio&quot; y analizar el resultado z-stack en la imagen para asegurar la configuración es apropiada para lo que se está investigando (por ejemplo, en este estudio, es importante para la imagen del núcleo entero). </li><li> Seleccione la opción &quot;T&quot; (tiempo) ficha. Para nuestro experimento con camptotecina, se establece el intervalo entre los puntos de tiempo de formación de imágenes a 5 min y la duración total de la sesión de 1 hora para un control (células no tratadas) video Nota:. Para minimizar foto-blanqueamiento de las células, el experimento debe ser configurado de tal manera que el AOTF espacios en blanco el láser entre los puntos de tiempo de formación de imágenes. </li><li> Fo múltiples puntos de imagen de varias células en el plato, en la ventana MDA, seleccione la ficha posición. Asegúrese de &quot;Aplicar&quot; ajuste antes / después de punto en el tiempo &quot;posición por&quot; está marcada. Seleccione &quot;Mark_Find&quot;. Usando el &quot;Live&quot; vista, mueva el plato alrededor y seleccionar los campos apropiados de vista. </li><li> Haga clic en &quot;Inicio&quot; en el menú multi-dimensional de adquisición para iniciar el experimento y grabar un vídeo de control (de las células no tratadas). </li><li> Después de que el control de vídeo, añadir el tratamiento apropiado (en este caso, 10 camptotecina mM). Se registró el experimental (droga células tratadas) de vídeo a intervalos de 5-10 min 2-4 h Nota:. Una cuestión importante a tener en cuenta es la velocidad con que se produce un efecto determinado después del tratamiento. Como se ve en el video, 53BP1 focos comienzan a partir de ~ 5 min después de la adición de CPT. Aunque es un proceso relativamente fácil, y agregó droga para el plato manualmente y volver a calibrar el microscopio toma tiempo. Hay que prestar atención a esto cuando el diseño de experimentos. </li><li> Para el seguimiento de mitosis, fijamos el intervalo de 7,5 minutos y grabado durante 4-5 horas (la configuración específica dependerá de la línea celular utilizada y la duración de su ciclo celular). Los ajustes que tenga que hacer para evitar que la foto-blanqueamiento durante grabaciones más largas. </li></ol> C. Procesamiento de imágenes y análisis Este protocolo fue desarrollado usando software Volocity (PerkinElmer). El software utilizado para adquirir la información (AxioVision) también tiene la capacidad para procesar y analizar imágenes. Los usuarios están invitados a utilizar el software a su disposición, y consulte la bibliografía adecuada en cuanto a su aplicación. <ol><li> Abra el software Volocity. Crear y nombrar una nueva biblioteca, e importar los archivos de vídeo. </li><li> Para ver los archivos, por lo general les resulta más útil usar el &quot;Focus extendido&quot; de ajuste. Esta superpone las rebanadas z-stack y, para este protocolo, nos permite visualizar los focos 53BP1 en las diferentes áreas del núcleo. </li><li> Ajuste vídeos como sea necesario. Volocity está equipado con una gama de herramientas para mejorar la calidad de las imágenes adquiridas. Al asegurarse de que los ajustes del microscopio eran apropiadas, mucho tiempo se pueden guardar en la edición más adelante. A menudo, es útil para deconvolucionar sus imágenes y ajustar el brillo / contraste. Sus necesidades de edición específicas pueden variar basado en el experimento. </li><li> Añadir una marca de tiempo relativo y la barra de escala. </li><li> Para ver las células en 3-D, cambie a la &quot;3-D opacidad&quot; de ajuste. Esto permite la rotación de las células en 3-D prestados en el espacio, proporcionando así múltiples perspectivas de estructuras de interés dentro de las células Nota:. Es útil para visualizar las células en diferentes planos para determinar donde las estructuras de los viajes interés. Por ejemplo, en el &quot;Focus extendida&quot; ajuste es difícil discernir que el 53BP1 es, de hecho, se disocian de ADN durante la mitosis. Sin embargo, esto es fácilmente evidente en 3-D. </li><li> Las películas y las imágenes fijas pueden ser exportados a una variedad de tipos de archivos basado en la preferencia del usuario. </l<html> i&gt; </ol> D. Representante Resultados Un ejemplo de 53BP1 formación de focos en respuesta a la CPT se muestra en la figura 1. Las células expuestas a forma CPT focos dentro de 5-10 minutos, y mantener estos focos durante toda la duración de la grabación. Como se muestra en la Figura 2, 53BP1 disocia de la cromatina en el inicio de la mitosis, formando una fina neblina alrededor de los cromosomas de condensación. Como telofase se produce la mitosis y llega a su fin, 53BP1 una vez más agregados en distintos focos. Mientras que las células HEK293 no fueron expuestos a CPT, que sin embargo forman focos abundante, reparación espontánea 53BP1 generado por el daño del ADN endógeno. Esta observación nos permitió concluir que 53BP1 no formar focos durante la mitosis temprana, de acuerdo con un informe anterior que muestra un efecto similar después de la exposición de las células a la radiación ionizante y las drogas radiomiméticos 5. ure 1 &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/4251/4251fig1.jpg &quot;/&gt; Figura 1. Camptotecina (10 mM) y provoca DSBs 53BP1 formación de focos en el ciclismo fibroblastos dentro de 30 min de la adición del fármaco al medio. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/4251/4251fig2.jpg" /> Figura 2. 53BP1 no formar focos durante la mitosis hasta telophase/G1 en células HEK293.

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</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

Mantenimiento de la integridad genómica es crucial para la supervivencia celular. El incumplimiento de preservar los resultados del genoma en el envejecimiento prematuro, la carcinogénesis, o la muerte 8. Hay un gran interés en discernir cómo funciona el DDR, derivadas de su importancia para la investigación básica y clínica. Muchas técnicas se han desarrollado a lo largo de los años para ayudar en el estudio de cómo las células detectar y reparar el daño del ADN. Los métodos tradicionales como la inmunocitoq...

<table border="1"><tbody><tr><td> Producto </td><td> Empresa </td></tr><tr><td> Cellstar placas de cultivo </td><td> Greiner Bio-One </td></tr><tr><td> FluroDish platos con fondo de cristal </td><td> World Precision Instruments, Inc. </td></tr><tr><td> Medio MEM </td><td> GIBCO </td></tr><tr><td> No esenciales de aminoácidos </td><td> GIBCO </td></tr><tr><td> Los aminoácidos </td><td> GIBCO </td></tr><tr><td> Vitaminas </td><td> GIBCO </td></tr><tr><td> Piruvato de sodio </td><td> Invitrogen </td></tr><tr><td> Penicilina / Estreptomicina </td><td> HyClone </td></tr><tr><td> Suero Bovino Fetal </td><td> GIBCO </td></tr><tr><td> N-Myc-53BP1 PESO pLPC-Puro; plásmido 19836 </td><td> Addgene </td></tr><tr><td> pCLNR-H2BG; plásmido 17735 </td><td> Addgene </td></tr><tr><td> SuperFect </td><td> Qiagen </td></tr><tr><td> Zeiss celular Observador SD Imaging System </td><td> Zeiss </td></tr><tr><td> AxioVision (versión 4.8.2) </td><td> Zeiss </td></tr><tr><td> Zeiss Immersol W Petróleo </td><td> Zeiss </td></tr><tr><td> Volocity software (versión 6,0) </td><td> PerkinElmer </td></tr></tbody></table>

de dos y tres dimensiones imágenes de células vivas de las proteínas de respuesta al daño del adn

Two- and Three-Dimensional Live Cell Imaging of DNA Damage Response Proteins

Doble filamento se rompe (DSBs) son el ADN más perjudicial lesiones que una célula pueda encontrar. Si se deja sin reparar, DSBs gran puerto potencial para generar mutaciones y aberraciones cromosómicas 1. Para evitar este trauma de catalizar la inestabilidad genómica, que es crucial para las células para detectar DSBs, activan la respuesta al daño del ADN (DDR), y reparar el ADN. Cuando se estimula, el DDR trabaja para preservar la integridad genómica mediante la activación de detención del ciclo celular para permitir la reparación a tener lugar o forzar la célula a la apoptosis. Los mecanismos predominantes de reparación de DSB ocurrir a través de nonhomologous fin de unirse (NHEJ) y reparación de recombinación homóloga (HRR) (revisado en 2). Hay muchas proteínas cuyas actividades deben estar precisamente orquestada por la RDA para funcionar correctamente. En este documento, se describe un método para 2 - y 3-dimensional (D) la visualización de una de estas proteínas, 53BP1. La proteína p53 de unión 1 (53BP1) se localiza en áreas deDSBs por la unión a las histonas modificadas 3,4, formando focos dentro de 5-15 minutos 5. Las modificaciones de las histonas y el reclutamiento de proteínas DDR 53BP1 y otro a sitios de DSB se cree que facilita la reorganización estructural de la cromatina alrededor de las áreas de daño y contribuir a la reparación del ADN 6. Más allá de la participación directa en la reparación, funciones adicionales han sido descritos para 53BP1 en el DDR, tales como la regulación de un puesto de control intra-S, un punto de control G2 / M, y la activación de proteínas aguas abajo de DDR 7-9. Recientemente, se descubrió que 53BP1 no formar focos en respuesta al daño del ADN inducido durante la mitosis, en vez de espera para entrar en las células G1 antes de localizar a la vecindad de DSBs 6. Proteínas tales como DDR 53BP1 han encontrado asociación con estructuras mitóticas (tal como cinetocoros) durante la progresión a través de mitosis 10. En este protocolo se describe el uso de 2 - y 3-D imágenes de células vivas para visualizarla formación de focos 53BP1 en respuesta al agente que daña el ADN camptotecina (CPT), así como el comportamiento de 53BP1 durante la mitosis. La camptotecina es un inhibidor de topoisomerasa I que causa principalmente DSBs durante la replicación del ADN. Para lograr esto, se utilizó una anteriormente descrita 53BP1-mCherry proteína de fusión fluorescente construir consta de un dominio de proteína 53BP1 capaz de unirse DSBs 11. Además, se utilizó una histona H2B-GFP proteína de fusión fluorescente construir capaz de monitorear dinámica de la cromatina a través del ciclo celular, pero en particular durante la mitosis 12. Imágenes de células vivas en múltiples dimensiones es una excelente herramienta para profundizar en nuestra comprensión de la función de las proteínas de DDR en las células eucariotas.

Este protocolo describe un método para visualizar un ADN de doble hebra proteína rotura de señalización activada en respuesta al daño del ADN, así como su localización durante la mitosis.

De dos y tres dimensiones imágenes de células vivas de las proteínas de respuesta al daño del ADN

Las roturas de doble cadena (DSB, por sus siglas en inglés) son las lesiones del ADN más deletéreas que puede experimentar una célula. Si no se reparan, las DSB poseen un gran potencial para generar...

Esta demostración utiliza imágenes de células vivas en 2D y 3D para comprender las relaciones espacio-temporales de las proteínas implicadas en la respuesta al daño del ADN. Primero, transfecte o transduzca su línea celular de elección con constructos de expresión que contengan marcadores fluorescentes adecuados. Aquí, M Cherry y GFP a continuación, adquiera una serie de videos de control que muestren las células marcadas fluorescentemente en condiciones normales.Luego, aplique un tratamiento adecuado y capture datos sobre los efectos del tratamiento en el proceso de las células fluorescentes, y analice los datos de video para determinar las relaciones espacio-temporales de las proteínas. En definitiva, la microscopía de fluorescencia en células vivas puede detallar la dinámica celular, como la formación de focos de 53 BP1 en respuesta a agentes que dañan el ADN o el comportamiento de 53 BP1 durante la mitosis. Nuestro interés en la imagenología en cultivo bidimensional y tridimensional surgió cuando deseábamos estudiar cómo distintos tratamientos afectaban la mitosis en ciertas líneas celulares.Este enfoque experimental nos permite estudiar la respuesta al daño del ADN y el mantenimiento de la estabilidad genómica más fácilmente que con los métodos tradicionales. Además, puede utilizar este método para investigar cómo ciertas proteínas interactúan en diversas vías de señalización y en distintas líneas celulares. La principal ventaja del análisis de imágenes en condiciones de cultivo vivo frente a técnicas tradicionales como la citohistoquímica es que permite el estudio de las proteínas de respuesta al daño del ADN en tiempo real.Optimizar las condiciones adecuadas de grabación puede ser un desafío. Esta demostración puede utilizarse para observar los muchos pasos pequeños necesarios para garantizar el éxito. Recuerde que la persistencia da resultados cuando se trata de minimizar el fotoblanqueamiento, encontrar los intervalos de grabación adecuados y la duración óptima de la grabación, etc.Transfecte o transduzca las líneas celulares apropiadas con los plásmidos para la expresión de proteínas de fusión mCherry y GFP. Mantenga los cultivos bajo selección con fármacos y verifique periódicamente la expresión de las proteínas fluorescentes el día anterior a la adquisición de imágenes. Recoga las células utilizando tripsina.Luego siembre cultivos de baja densidad en placas de fondo de vidrio para pocillos fluoro de 3,5 centímetros. Este protocolo se desarrolló utilizando el microscopio confocal de disco giratorio Zeiss cell observer SD, equipado con un soporte axio observer Z1. En primer lugar, verifique que el gas CO₂ esté fluyendo hacia el módulo de CO₂ del sistema de incubación. Si el microscopio está montado sobre una mesa antivibración Airtable, encienda entonces el suministro de aire para la Airtable.Ahora encienda la alimentación para la unidad de disco giratorio del microscopio, las cámaras, los módulos de incubación, el iluminador HXP, la platina motorizada, el láser argón y la computadora. Encienda los interruptores para las líneas láser que se utilizarán. Inicie el software Axio Vision.El software Avision puede personalizarse con ventanas y menús desplegables específicos para el microscopio y los componentes que controla. Por lo tanto, cada interfaz de usuario puede tener un aspecto único. Aproximadamente una hora antes de la adquisición de imágenes, localice los controles del incubador y encienda el calentamiento de la cámara superior y de la placa de la platina.Establezca la temperatura a 37 grados Celsius. Encienda el control de CO2 y ajuste el nivel al 5 %. Seleccione la lente objetivo para la obtención de imágenes en este estudio. La lente objetivo requiere el uso de un medio de inmersión que tenga un índice de refracción similar al del agua.Si necesita imaginar múltiples posiciones durante largos períodos de tiempo, asegúrese de aplicar suficiente medio de inmersión para que el objetivo no se seque. Coloque la placa de cultivo sobre la platina y acerque la lente del objetivo hasta que haga contacto con la base, utilizando los controles del microscopio o el software. Dirija la luz emitida hacia los oculares y seleccione el conjunto de filtros de campo amplio adecuado para la señal fluorescente de interés.Ahora observe a través de las lentes oculares. Enfoque la imagen y localice un campo adecuado de células utilizando ya sea el software o los controles del microscopio. Dirija la luz emitida lejos de los oculares hacia el puerto con la unidad de disco giratorio confocal en el software.Encienda el láser adecuado para este estudio. Para cada canal, ajuste la intensidad del láser regulando el control del filtro óptico sintonizable kuo a un nivel apropiado. A continuación, seleccione el espejo dicróico y los filtros de emisión adecuados.Abra el obturador de la unidad de disco giratorio. Ahora seleccione la ventana de vista en vivo para mostrar el campo de visión actual. A continuación, abra la ventana de control de la cámara.Seleccione la cámara que se utilizará y ajuste el tiempo de exposición a aproximadamente 100 milisegundos. Ajuste el porcentaje y la ganancia EM según sea necesario. Además, abra el control de la unidad de disco giratorio confocal y ajuste la velocidad del disco giratorio ingresando el tiempo de exposición de la cámara que se estableció para capturar una imagen adecuada.Haga clic en establecer para bloquear el cambio. Ahora abra la ventana de adquisición multidimensional. Seleccione la pestaña de canales y cargue o seleccione los canales apropiados definidos para los Flora Fours.Para garantizar el registro de imágenes, utilice un espejo dicromático común para ambos canales. Configure el software para enfoque automático. Continúe hasta la ventana MDA y haga clic en la pestaña de pila ZS.Seleccione la pila ZS en la posición de enfoque actual. Establezca el rango para una pila Z de 10 micrones y elija el número óptimo de pasos para garantizar un muestreo de Nyquist a través de Z. Ahora haga clic en iniciar y analice la imagen de la pila Z resultante. Seleccione la pestaña de tiempo.Establezca el intervalo entre los puntos temporales de adquisición de imágenes y la duración total de la sesión. Para la adquisición de imágenes multipunto de varias células en la placa, abra la ventana MDA. Seleccione la pestaña de posición y verifique que la opción aplicar configuración antes o después del punto temporal por posición esté marcada.Ahora seleccione marca. Busque utilizando la vista en vivo, mueva el platillo y seleccione los campos de visión adecuados. Haga clic en iniciar en el menú de adquisición multidimensional para comenzar el experimento y grabar un video de control.Proceda a añadir el tratamiento adecuado y registre el video experimental a intervalos de tiempo determinados durante un período definido. Para esta línea celular y para monitorear todo el proceso de mitosis, utilizamos un intervalo de siete minutos y medio durante cuatro a cinco horas. Usted deberá determinar los parámetros específicos para su línea celular y para lo que desee estudiar.Abra el software Velocity, cree y asigne un nombre a una nueva biblioteca e importe los archivos de video experimentales para ver los archivos. Intente usar la configuración de enfoque extendido y ajuste los videos según sea necesario. Velocity cuenta con una serie de herramientas para ayudar a mejorar la calidad de las imágenes adquiridas.Si la configuración del microscopio es adecuada, se ahorrará mucho tiempo posteriormente en la edición. A menudo es útil procesar sus imágenes y ajustar el brillo y el contraste, ya que sus necesidades específicas variarán según su experimento. Para visualizar las células en 3D, cambie al ajuste de opacidad 3D.Esto permite la rotación de las células renderizadas en 3D en el espacio, proporcionando así múltiples perspectivas de las estructuras de interés dentro de las células. Películas. Las imágenes fijas pueden exportarse a una variedad de formatos de archivo según la preferencia del usuario En comparación con los controles. Las células de fibroblastos expuestas al CPT formaron focos dentro de los cinco a 10 minutos y mantuvieron estos focos durante toda la duración de la grabación.Curiosamente, en células renales embrionarias humanas, 53BP1 se disocia de la cromatina al inicio de la mitosis, formando un tenue halo alrededor de los cromosomas en condensación. A medida que ocurre la telofase y la mitosis finaliza, 53BP1 vuelve a agregarse en focos bien definidos. Esperamos que este video les permita estudiar las relaciones espacio-temporales de las proteínas implicadas en la respuesta al daño del ADN, así como en otras vías.Por ejemplo, en el campo de la dinámica de la cromatina, esta técnica se utilizó para estudiar cómo la unión de 53 BP1 afecta el movimiento de los extremos teloméricos del ADN. Tras la creación de células modificadas genéticamente, se puede realizar imágenes en células vivas en dos y tres dimensiones en aproximadamente de cuatro a ocho horas. Asegúrese de que la configuración del microscopio se ajuste adecuadamente para obtener una imagen óptima.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

En este video, describimos el método de inmunofluorescencia para visualizar la localización de las proteínas de reparación del ADN γH2AX y 53BP1 en los sitios de roturas de ADN de doble cadena en núcleos celulares irradiados.

Visualización basada en inmunofluorescencia de las interacciones de las proteínas de reparación del ADN

Los láseres se utilizan con frecuencia en los estudios de la respuesta celular al daño del ADN. Sin embargo, que generan lesiones cuya distancia, la frecuencia y las colisiones con las horquillas de replicación están raramente caracterizado. Aquí se describe un método que permite la determinación de estos parámetros con láser localizado entrecruzamientos entre cadenas.

El análisis de moléculas individuales de láser localizadas psoraleno aductos

Aquí se demuestra cómo se puede usar el Ensayo de Ligación de Proximidad in situ (PLA) para detectar y visualizar las interacciones directas proteína-proteína entre ATM y p53 en cultivos de células en suspensión expuestos al estrés genotóxico.

Detección y visualización de los complejos de proteínas inducidos por daño de ADN en cultivos de células en suspensión usando el ensayo de ligación de proximidad

Microirradiation láser es una herramienta útil para estudios de reparación del ADN en las células vivas. Se muestra un enfoque metodológico para el uso de láseres de rayos UVA para inducir varias lesiones del ADN. Hemos optimizado un método para microirradiation local que mantiene el ciclo normal de la célula; así, las células irradiadas proceden a través de mitosis.

Avanzadas técnicas de Microscopía Confocal para estudiar las interacciones proteína-proteína y cinética en las lesiones del ADN

El objetivo de este protocolo es describir cómo utilizar microirradiation de láser para inducir a diferentes tipos de daños en el ADN, como roturas de cadena relativamente simple y complejo daño, para el estudio de ADN daños reparación y señalización de factor Asamblea en sitios de daño en vivo .

Microirradiation láser para estudiar In Vivo las respuestas celulares al daño en el ADN Simple y complejo

Confocal de la fluorescencia microscopía láser micro-irradiación oferta herramientas y para inducir daño en el ADN y control de la respuesta de proteínas de reparación del ADN en áreas seleccionadas de las nucleares. Esta técnica ha avanzado significativamente nuestro conocimiento de detección de daño, las señales y reclutamiento. Este manuscrito muestra estas tecnologías para examinar reparación de rotura de filamento solo y doble.

Aplicación de Micro-la irradiación del Laser para la examinación de Single y doble filamento romper reparación en células de mamíferos

Estudiar la cinética de reparación de daños de ADN requiere un sistema para inducir lesiones en regiones definidas del nucleares. Se describe un método para crear localizados roturas de doble cadena utilizando un microscopio confocal de escaneo láser equipado con un 405 nm láser y procedimientos automatizados para cuantificar la dinámica de los factores de reparación de estas lesiones.

Investigación de reclutamiento de la proteína a las lesiones del ADN usando 405 Nm láser Micro-irradiación

Reparación de roturas del DNA de doble cadena es un proceso dinámico, que requiere no sólo la formación de complejos de reparación en los descansos, pero también su resolución después de la lesión se trata. Aquí, utilizamos microscopia de la inmunofluorescencia para roturas de doble hebra transitorias y duradera como una herramienta para diseccionar este mecanismo de mantenimiento del genoma.

Caracterización de procesos de reparación del ADN en transitoria y duradera doble cadena DNA roturas por microscopia de la inmunofluorescencia

Después del daño del ADN, las células humanas activan vías de reparación esenciales para restaurar la integridad de su genoma. Aquí, describimos el método de inmunofluorescencia indirecta como un medio para detectar proteínas de reparación del ADN, analizar su reclutamiento espacial y temporal, y ayudar a interrogar la interacción proteína-proteína en los sitios de daño del ADN.

Visualización de la interacción de proteínas de reparación del ADN por inmunofluorescencia

Este artículo introduce pasos esenciales de immunostaining y de la inmunoprecipitación de la cromatina. Estos protocolos se utilizan comúnmente para estudiar los procesos celulares relacionados con el daño del ADN y para visualizar y cuantificar el reclutamiento de proteínas implicadas en la reparación del ADN.

Visualización Y Cuantificación De La Endonucleasa Basada En El Daño Específico Del ADN Específico Del Sitio

Este protocolo presenta un nuevo sistema de genes reporteros y la configuración experimental para detectar la transcripción en roturas de doble cadena de ADN con sensibilidad de molécula única.

Imágenes de células vivas de la actividad transcripcional en roturas de doble cadena de ADN

Aprende a visualizar proteínas de respuesta al daño del ADN mediante imágenes de células vivas en dos y tres dimensiones. Este método permite estudiar la dinámica celular y las relaciones espaciotemporales de proteínas como 53BP1 durante la mitosis.

De dos y tres dimensiones imágenes de células vivas de las proteínas de respuesta al daño del ADN

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