De dos y tres dimensiones imágenes de células vivas de las proteínas de respuesta al daño del ADN

Esta demostración utiliza imágenes de células vivas en 2D y 3D para comprender las relaciones espacio-temporales de las proteínas implicadas en la respuesta al daño del ADN. Primero, transfecte o transduzca su línea celular de elección con constructos de expresión que contengan marcadores fluorescentes adecuados. Aquí, M Cherry y GFP a continuación, adquiera una serie de videos de control que muestren las células marcadas fluorescentemente en condiciones normales.

Luego, aplique un tratamiento adecuado y capture datos sobre los efectos del tratamiento en el proceso de las células fluorescentes, y analice los datos de video para determinar las relaciones espacio-temporales de las proteínas. En definitiva, la microscopía de fluorescencia en células vivas puede detallar la dinámica celular, como la formación de focos de 53 BP1 en respuesta a agentes que dañan el ADN o el comportamiento de 53 BP1 durante la mitosis. Nuestro interés en la imagenología en cultivo bidimensional y tridimensional surgió cuando deseábamos estudiar cómo distintos tratamientos afectaban la mitosis en ciertas líneas celulares.

Este enfoque experimental nos permite estudiar la respuesta al daño del ADN y el mantenimiento de la estabilidad genómica más fácilmente que con los métodos tradicionales. Además, puede utilizar este método para investigar cómo ciertas proteínas interactúan en diversas vías de señalización y en distintas líneas celulares. La principal ventaja del análisis de imágenes en condiciones de cultivo vivo frente a técnicas tradicionales como la citohistoquímica es que permite el estudio de las proteínas de respuesta al daño del ADN en tiempo real.

Optimizar las condiciones adecuadas de grabación puede ser un desafío. Esta demostración puede utilizarse para observar los muchos pasos pequeños necesarios para garantizar el éxito. Recuerde que la persistencia da resultados cuando se trata de minimizar el fotoblanqueamiento, encontrar los intervalos de grabación adecuados y la duración óptima de la grabación, etc.

Transfecte o transduzca las líneas celulares apropiadas con los plásmidos para la expresión de proteínas de fusión mCherry y GFP. Mantenga los cultivos bajo selección con fármacos y verifique periódicamente la expresión de las proteínas fluorescentes el día anterior a la adquisición de imágenes. Recoga las células utilizando tripsina.

Luego siembre cultivos de baja densidad en placas de fondo de vidrio para pocillos fluoro de 3,5 centímetros. Este protocolo se desarrolló utilizando el microscopio confocal de disco giratorio Zeiss cell observer SD, equipado con un soporte axio observer Z1. En primer lugar, verifique que el gas CO₂ esté fluyendo hacia el módulo de CO₂ del sistema de incubación. Si el microscopio está montado sobre una mesa antivibración Airtable, encienda entonces el suministro de aire para la Airtable.

Ahora encienda la alimentación para la unidad de disco giratorio del microscopio, las cámaras, los módulos de incubación, el iluminador HXP, la platina motorizada, el láser argón y la computadora. Encienda los interruptores para las líneas láser que se utilizarán. Inicie el software Axio Vision.

El software Avision puede personalizarse con ventanas y menús desplegables específicos para el microscopio y los componentes que controla. Por lo tanto, cada interfaz de usuario puede tener un aspecto único. Aproximadamente una hora antes de la adquisición de imágenes, localice los controles del incubador y encienda el calentamiento de la cámara superior y de la placa de la platina.

Establezca la temperatura a 37 grados Celsius. Encienda el control de CO2 y ajuste el nivel al 5 %. Seleccione la lente objetivo para la obtención de imágenes en este estudio. La lente objetivo requiere el uso de un medio de inmersión que tenga un índice de refracción similar al del agua.

Si necesita imaginar múltiples posiciones durante largos períodos de tiempo, asegúrese de aplicar suficiente medio de inmersión para que el objetivo no se seque. Coloque la placa de cultivo sobre la platina y acerque la lente del objetivo hasta que haga contacto con la base, utilizando los controles del microscopio o el software. Dirija la luz emitida hacia los oculares y seleccione el conjunto de filtros de campo amplio adecuado para la señal fluorescente de interés.

Ahora observe a través de las lentes oculares. Enfoque la imagen y localice un campo adecuado de células utilizando ya sea el software o los controles del microscopio. Dirija la luz emitida lejos de los oculares hacia el puerto con la unidad de disco giratorio confocal en el software.

Encienda el láser adecuado para este estudio. Para cada canal, ajuste la intensidad del láser regulando el control del filtro óptico sintonizable kuo a un nivel apropiado. A continuación, seleccione el espejo dicróico y los filtros de emisión adecuados.

Abra el obturador de la unidad de disco giratorio. Ahora seleccione la ventana de vista en vivo para mostrar el campo de visión actual. A continuación, abra la ventana de control de la cámara.

Seleccione la cámara que se utilizará y ajuste el tiempo de exposición a aproximadamente 100 milisegundos. Ajuste el porcentaje y la ganancia EM según sea necesario. Además, abra el control de la unidad de disco giratorio confocal y ajuste la velocidad del disco giratorio ingresando el tiempo de exposición de la cámara que se estableció para capturar una imagen adecuada.

Haga clic en establecer para bloquear el cambio. Ahora abra la ventana de adquisición multidimensional. Seleccione la pestaña de canales y cargue o seleccione los canales apropiados definidos para los Flora Fours.

Para garantizar el registro de imágenes, utilice un espejo dicromático común para ambos canales. Configure el software para enfoque automático. Continúe hasta la ventana MDA y haga clic en la pestaña de pila ZS.

Seleccione la pila ZS en la posición de enfoque actual. Establezca el rango para una pila Z de 10 micrones y elija el número óptimo de pasos para garantizar un muestreo de Nyquist a través de Z. Ahora haga clic en iniciar y analice la imagen de la pila Z resultante. Seleccione la pestaña de tiempo.

Establezca el intervalo entre los puntos temporales de adquisición de imágenes y la duración total de la sesión. Para la adquisición de imágenes multipunto de varias células en la placa, abra la ventana MDA. Seleccione la pestaña de posición y verifique que la opción aplicar configuración antes o después del punto temporal por posición esté marcada.

Ahora seleccione marca. Busque utilizando la vista en vivo, mueva el platillo y seleccione los campos de visión adecuados. Haga clic en iniciar en el menú de adquisición multidimensional para comenzar el experimento y grabar un video de control.

Proceda a añadir el tratamiento adecuado y registre el video experimental a intervalos de tiempo determinados durante un período definido. Para esta línea celular y para monitorear todo el proceso de mitosis, utilizamos un intervalo de siete minutos y medio durante cuatro a cinco horas. Usted deberá determinar los parámetros específicos para su línea celular y para lo que desee estudiar.

Abra el software Velocity, cree y asigne un nombre a una nueva biblioteca e importe los archivos de video experimentales para ver los archivos. Intente usar la configuración de enfoque extendido y ajuste los videos según sea necesario. Velocity cuenta con una serie de herramientas para ayudar a mejorar la calidad de las imágenes adquiridas.

Si la configuración del microscopio es adecuada, se ahorrará mucho tiempo posteriormente en la edición. A menudo es útil procesar sus imágenes y ajustar el brillo y el contraste, ya que sus necesidades específicas variarán según su experimento. Para visualizar las células en 3D, cambie al ajuste de opacidad 3D.

Esto permite la rotación de las células renderizadas en 3D en el espacio, proporcionando así múltiples perspectivas de las estructuras de interés dentro de las células. Películas. Las imágenes fijas pueden exportarse a una variedad de formatos de archivo según la preferencia del usuario En comparación con los controles. Las células de fibroblastos expuestas al CPT formaron focos dentro de los cinco a 10 minutos y mantuvieron estos focos durante toda la duración de la grabación.

Curiosamente, en células renales embrionarias humanas, 53BP1 se disocia de la cromatina al inicio de la mitosis, formando un tenue halo alrededor de los cromosomas en condensación. A medida que ocurre la telofase y la mitosis finaliza, 53BP1 vuelve a agregarse en focos bien definidos. Esperamos que este video les permita estudiar las relaciones espacio-temporales de las proteínas implicadas en la respuesta al daño del ADN, así como en otras vías.

Por ejemplo, en el campo de la dinámica de la cromatina, esta técnica se utilizó para estudiar cómo la unión de 53 BP1 afecta el movimiento de los extremos teloméricos del ADN. Tras la creación de células modificadas genéticamente, se puede realizar imágenes en células vivas en dos y tres dimensiones en aproximadamente de cuatro a ocho horas. Asegúrese de que la configuración del microscopio se ajuste adecuadamente para obtener una imagen óptima.