דור מהיר ויעיל של נוירונים מתאי גזע pluripotent אדם בפורמט פלייט Multititre

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא להבדיל תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים או H PSCs לנוירונים באמצעות פורמט צלחת מרובת טיטר. זה מושג על ידי קציר וציפוי תרחיף תא יחיד של H PSCs לתוך V bottom 96. צלחות באר ליצירת גופי עובר או EBS בן לילה.

לאחר מכן, ה-EBS מועבר ללוחות חיבור נמוכים במיוחד בצורת U המכילים מדיום התמיינות כדי לגרום להיווצרות נוירואקטודרם. לאחר מכן, ה-EBS מצופה על כלים מצופים מטריג'ל כדי לקדם את צמיחת הנוירונים. ניתן להשיג תוצאות המראות נוכחות של סמנים עצביים טיפוסיים בסביבות היום השמיני על ידי אימונופלואורסצנטיות.

פרוטוקולי צביעה להתמיינות תאי גזע אנושיים טרום-עוצמתיים לנוירונים הם לרוב מסובכים ומייגעים. קצת במקרה. נתקלנו בהליך פשוט מאוד ליצירת תאי עצב מתאי גזע אנושיים קדם-עוצמתיים.

מבחינה טכנית, היתרון העיקרי של טכניקה זו של שיטות קיימות הוא שהיא קלה לביצוע, מהירה וחסכונית. במקביל, יציג את ההליך ד"ר MI Z מהמעבדה. הכן מדיום היווצרות EB ומדיום התמיינות כמתואר בפרוטוקול הכתוב.

לגדל PSCs בתנאים נטולי מזין כגון מדיום מותנה מת' על צלחות מצופות מטריג'ל, או באמצעות מערכות גידול מוגדרות כימית בתנאי גידול פעיל תת-מפגש. שימוש במיקרוסקופ סטריאו עם קצה פיפטה מפלסטיק סטרילי מסיר מכנית מושבות מובחנות באופן ספונטני. שטפו את המושבות הלא ממויינות הנותרות עם PBS והשתמשו באקוטן המכיל מעכב סלע אחד כדי לעכל לתאים בודדים.

גלולה את התאים הבודדים על ידי צנטריפוגה ב-200 גרם למשך שתי דקות ו-Resus תשעה בנפח קטן של מדיום היווצרות EB. השתמש בציטומטר המו כדי לקבוע את טיטר התא. הוסף תאים נוספים למדיום היווצרות ה-EB הנותר כדי להגיע לטיטר בין 40, 000 ל-80,000 תאים למיליליטר.

באמצעות פיפטה רב-ערוצית מעבירים 100 מיקרוליטר לבאר לצלחת תחתונה של 96 וולט, וכתוצאה מכך 4,000 עד 8,000 תאים לבאר. ובכן. סובב את הצלחת בצנטריפוגת צלחת מתנדנדת כלפי מעלה ב -400 גרם למשך דקה אחת כדי לאסוף את כל התאים בתחתית הבארות. העבירו את התאים לאינקובטור ואפשרו ל-EBS להיווצר למשך הלילה למחרת במיקרוסקופ סטריאו.

אוספים EBS ומעבירים בנפח קטן לצלחת חיידקים בגודל 3.5 סנטימטר המכילה שני מיליליטר התמיינות. בינוני. שוטפים את התאים על ידי סיבוב עדין של המנה. הוסף 100 מיקרוליטר של מדיום בידול לכל באר של חיבור נמוך במיוחד לך.

צלחת באר 96 תחתונה מתחת למיקרוסקופ סטריאו. מעבירים את EBS בכמויות קטנות מכלי הכביסה לבארות 96 U. דגרו על ה-EBS למשך ארבעה ימים כדי לאפשר היווצרות נוירואקטודרם ביום הרביעי.

שטפו את התאים במדיום התמיינות וזרעו אותם בזה אחר זה לבארות של צלחת מרובת טיטר מצופה מטריג'ל, כגון צלחת 12 בארות. התאים צריכים להיות מפוזרים באופן שווה בתוך הבארות כדי לאפשר צמיחה ללא הפרעה של נוירונים. יש לאפשר ל-EBS להיצמד באופן רופף למטריג'ל למשך כ-10 דקות בטמפרטורת החדר.

ואז העבירו בזהירות את הצלחת לחממה. נוירונים יצמחו מה-EBS המצופה בצורה רדיאלית במהלך ארבעת הימים הקרובים. בעבר הראינו כי בדומה לרבים אחרים, ניתן לייצר EBS מ-H PSCs פשוט על ידי ציפוי מחדש, אגרגטים בעת פיצול שגרתי של H HPCs לכלי חיבור נמוכים.

זה בדרך כלל מביא להתפלגות רחבה של גדלי תאים. בעיה נוספת היא ש-EBS שנשמר בתרחיף נוטה להצטבר זה עם זה, מה שמוביל להטרוגניות בגודל גבוה עוד יותר כדי לעקוף את ה-H הבודד הזה PSCs נטענו בבארות חיבור נמוכות, מה שהביא ללא היווצרות EB ומוות של תאים. עם זאת, שילוב מולקולת הישרדות התא, Y 2 7 6 3 2 עם אלכוהול פוליוויניל, שהוכח כמשפר את היווצרות ה- EB מ- HSCs, איפשר ל- EBS להיווצר מתרחיף HESC של תא בודד בן לילה.

באופן נוח, ניתן לשלוט היטב על גדלי EB בפורמט צלחת מרובה טיטר זה על ידי ישיבה במספרים שונים של תאים לבאר. בניגוד לשימוש בטכניקות קונבנציונליות, לאחר העברת EBS ללוחות 96 U נמוכים במיוחד, היווצרות נוירואקטודרם הושרה באמצעות קוקטייל מולקולות קטן המורכב ממעכבי F-G-F-E-R-K-T-G, TGF beta SMA 2 ו-BP SMA one, שאפשרו לתאים להיות מצופים על מטריג'ל כדי להוליד נוירונים. התחלת היווצרות EB מכ-8,000 תאים הניבה את יכולת ההתמיינות העצבית הטובה ביותר, המאופיינת בצמיחה עצבית בולטת מה-ebs המצופה.

מרכזי EB נמקיים מופחתים לאחר ציפוי וביטוי גבוה של סמנים עצביים חושיים ופאן-עצביים כגון B rrn שלוש A ובטא שלוש טובולין. נראה כי יעילות ההתמיינות העצבית הכוללת ניתנת להשוואה להליך המקורי, הרלוונטי הן ל-HSCs והן ל-HI PSCs עד כה. שלושה קווי HPSC עצמאיים, תאי HES כמו גם תאי HIPS נבדקו בהצלחה בהליך מרובה בארות, בעוד שבדרך כלל לא ניתן לשלול שונות תלויה בקו התאים ויעילות התמיינות.

איור זה מציג ארבעה תאים נוירואקטודרמליים מנותקים ביום אחד שצופו כתאים בודדים והתמיינו בהצלחה ביעילות של כ-60% טיפול ב-EBS בפלטפורמת הרב-טיטר דורש מעט אימון בהתחלה, אך לאחר זמן מה, תראה שזה די קל.