El uso de ARN de interferencia mediada estrategia de alimentación para la detección de genes implicados en la regulación del cuerpo Tamaño del nematodo C. elegans

Este video muestra un procedimiento para identificar los genes que regulan, ver el crecimiento de los elgan y el tamaño del cuerpo. Utilizando el ARN de interferencia o el ojo de ARN para inactivar los genes candidatos, se preparan las primeras placas que contienen bacterias que expresan ARN bicatenario, que se dirigen a los genes de interés. Los hermafroditas de la cuarta etapa larvaria se transfieren a las placas de ARNi.

Una vez que alcanzan la etapa de adulto joven, se transfieren a nuevas placas de ARNA para poner huevos. Después de varias horas, se retiran dejando poblaciones sincronizadas de embriones. En la etapa deseada de desarrollo, la progenie recolectaba y montaba en portaobjetos.

Finalmente, se adquieren imágenes microscópicas de los gusanos. El análisis de la imagen muestra cambios en el tamaño corporal causados por la inactivación de genes. Aunque este método se puede utilizar para identificar reguladores de la vía de señalización beta de TGF, también se puede aplicar a otras vías que regulan el desarrollo postembrionario en el mar, como la vía de señalización de la insulina.

Comience este procedimiento clonando las secuencias de genes objetivo en el vector L 4 4 4 0 Un plásmido de ARNi de gusano de uso común transforma el plásmido recombinante en la cepa bacteriana. HT uno 15 DE tres cultura. Las bacterias transformadas en placas de agar LB con 25 microgramos por mililitro de carbono y 12,5 microgramos por mililitro de tetraciclina, luego eligen un solo clon para su uso futuro.

Mientras tanto, transforme el vector vacío L 4 4 4 0 en la cepa bacteriana. HT uno 15. Para utilizar como control para el cultivo de los experimentos, las bacterias transformadas en un mililitro de caldo LB con 100 microgramos por mililitro de ampicilina durante la noche a 37 grados centígrados.

La tetraciclina no se añade porque disminuye la eficiencia del ARN. Agregue otros cinco mililitros de caldo LB con 100 microgramos por mililitro de ampicilina al cultivo durante la noche, luego incube durante otras cuatro a seis horas a 37 grados Celsius. Una vez que el cultivo esté listo, siembre 0,5 mililitros de bacterias experimentales o de control en las placas de gusano de ARN etiquetadas con el nombre de clon apropiado.

Se deben preparar al menos dos placas para cada afección. Incubar las placas durante la noche a 37 grados centígrados. Al día siguiente.

Debe haber un grupo de bacterias que expresen ARNi con o sin la secuencia del gen diana. Los animales utilizarán las bacterias como fuente de alimento. Una vez que las placas de alimentación de RNAI están listas, las llamas esterilizan la punta de un alambre de platino.

A continuación, utilice el alambre de platino para transferir de seis a diez cuartos estadios larvales o L cuatro Hermafroditas de C elgan a cada placa de ARNi. Deje que los hermafroditas crezcan a 20 grados centígrados durante la noche. Al día siguiente, los animales serán adultos jóvenes.

Transfiéralos a una nueva placa de RNAI debidamente etiquetada y preparada. Incubar las placas a 20 grados centígrados durante cuatro a seis horas para permitir que los adultos pongan huevos. Después de la incubación, retire todos los adultos de la placa para sincronizar la progenie.

Una vez que se retiren los adultos, comience a contar el tiempo. Este es el tiempo cero. Incubar las placas a 20 grados centígrados para que los animales crezcan hasta la etapa de desarrollo de interés.

Aquí, se elegirán adultos jóvenes para el análisis fenotípico. Para los derribos que se desarrollan a un ritmo normal, se requiere una incubación de 72 horas. Tenga en cuenta que varios genes afectan el desarrollo animal de manera diferente, por lo que es posible que sea necesario ajustar los tiempos de incubación.

Si el ARNi hace que los animales crezcan a un ritmo diferente, los adultos jóvenes pueden identificarse como aquellos que no han pasado más de 24 horas después de las cuatro horas con un desarrollo VUL completo y de dos a seis embriones en el útero, como se muestra aquí. Para identificar otras etapas del desarrollo, el investigador debe utilizar el desarrollo gonadal y VUL como guía. Una vez que los animales hayan crecido a la etapa adecuada, prepárese para anotar los fenotipos del tamaño corporal de los gusanos tratados con ARNi.

A continuación, coloque dos capas de cinta adhesiva de color en un portaobjetos de muestra de un milímetro de grosor como se muestra aquí. Haz dos de estos portaobjetos de vidrio. A continuación, coloque un nuevo portaobjetos de vidrio entre los dos portaobjetos con la cinta y aplique una gota de 2%Agros derretido en agua.

En el centro de la nueva diapositiva de vidrio, presione una segunda diapositiva de vidrio en la parte superior para hacer una almohadilla delgada de agros. Una vez que los agros se hayan solidificado, retire el vaso superior. Deslice la corredera con la almohadilla agros y estará lista para cargar gusanos.

Etiquete la diapositiva con el nombre del clon. Agregue 10 microlitros de azida de sodio de 25 milimolares a la almohadilla aros. Luego, usando un alambre de platino como antes, transfiera de 30 a 40 animales a la solución de azi de sodio.

Para inmovilizarlos, coloque un cubreobjetos en la parte superior. Haga esto tanto para los animales tratados con ARNi recombinantes como para los vacíos L 4 4 4 0. A continuación, coloque el portaobjetos del micrómetro bajo el microscopio de disección con una lente de objetivo de 2,5x.

Con Q Capture o un software similar, capture una imagen de la regla del micrómetro y guárdela. A continuación, coloque los gusanos bajo el visor y capture las imágenes. Para medir primero la longitud del cuerpo, abra la imagen de la regla del micrómetro en el software Image Pro.

A continuación, haga clic en medir y elija calibración. A continuación, elija el asistente de calibración espacial con calibrar la imagen activa seleccionada. Haga clic en siguiente.

Introduzca el nombre de la calibración y asegúrese de que las unidades de referencia espacial estén establecidas en micras. A continuación, marque el botón Crear una calibración de referencia y haga clic en Siguiente. Haga clic en dibujar línea de referencia.

Aparecerá una barra de escala de referencia. Vuelva a colocar la barra de escala para que coincida con los extremos del micrómetro. A continuación, indique que la referencia indica 1000 unidades.

Haga clic en Aceptar. Siguiente y finalizar. Una vez calibrado el software, abra una imagen de gusano.

Luego, en el menú de medidas, seleccione calibración y luego haga clic en seleccionar espacial. En el menú desplegable, seleccione el nombre del archivo creado para la calibración del micrómetro. A continuación, en el menú de medidas, seleccione medidas en la ventana que se abre.

Seleccione la herramienta de dibujo libre y, con el mouse de la computadora, trace una línea a través del centro del cuerpo del animal desde la cabeza hasta la cola. La longitud se informará en la ventana. Repita este proceso para todos los animales en el campo.

Exporte las medidas de longitud a un archivo de Microsoft Excel u otro software estadístico adecuado. Analice los datos calculando la media y la desviación estándar de cada muestra. A continuación, compare los resultados de cada grupo utilizando la prueba T de un estudiante.

El factor de crecimiento transformante beta o la proteína DBL uno de la superfamilia TGF beta es necesario para la activación de la vía TGF beta. En respuesta a la activación de la señal, los transductores de señal smad intracelulares se translocan al núcleo e inician la transcripción génica. Observe que la elegancia en la que se interrumpe la vía TGF beta tiene un tamaño corporal más pequeño, incluida una longitud corporal más corta que los animales de tipo salvaje.

Por lo tanto, pantallas para la elegancia del mar. Los mutantes del tamaño corporal son capaces de identificar los componentes y modificadores de señalización beta de TGF para probar la eficacia del ARNi mediante la alimentación para la identificación de mutantes del tamaño corporal. El ARNi se utilizó para derribar los componentes de la vía DBL uno, SMA tres en SMA seis, en cuatro cepas diferentes de elegancia marina.

Las cepas de elegancia C probadas incluyeron dos que son RN AI hipersensibles A uno, Lin 15 B y RF tres, así como la cepa estándar de tipo salvaje N dos y la cepa LIN 36, cuya sensibilidad de ARNi es similar a N dos como se muestra aquí. Cuando se interrumpió la expresión de SMA tres o SMA seis, los animales mostraron un tamaño corporal significativamente más corto que los animales de control, excepto el ARNi de SMA six en Lin 36. Antecedentes en RF tres.

Las longitudes corporales de los adultos jóvenes después del tratamiento con ARNi fueron del 84 al 95% del vector solo. En A uno Lin 15 B, las longitudes corporales de fondo de los adultos jóvenes después del ARNi fueron del 68 al 86% de los animales de control. Sin embargo, la cepa A one lin 15 B produce una progenie de vista.

Esto los hace inadecuados para el cribado a gran escala. Por lo tanto, se sugiere el uso de la cepa RF tres para estas técnicas. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo identificar los genes que regulan el crecimiento y el tamaño corporal utilizando la técnica de interferencia de RNI.