MISIÓN esiRNA sobre el cribado del ARNi en células de mamífero

El cribado de genes asociados al ciclo celular mediante IA de ARN comienza con la elección de una misión tecnológica de derribo adecuada. Fácil. Las bibliotecas de ARN de Sigma Aldridge hacen uso de la alta eficiencia y especificidad del Si preparado con endo ribonucleasa. Los ARN fáciles son agrupaciones complejas de ARN SI individuales, preparados por digestión enzimática de ARN bicatenario largo, complementarios a la agrupación del MNA objetivo de ARN SI dirigidos a la misma transcripción, aumenta la especificidad y evita la laboriosa búsqueda de ARN SI individuales eficientes y específicos.

Esto hace que Easy RNA sea especialmente adecuado para pantallas de pérdida de función a gran y mediana escala. Aquí mostramos los pasos necesarios para realizar un cribado ocular de ARN a gran escala, desde la configuración de un transfecto de alto rendimiento hasta el desarrollo de un ensayo adecuado. Esto se ejemplifica mediante la creación de un cribado de genes implicados en la progresión del ciclo celular de los mamíferos.

En primer lugar, mostramos cómo se optimiza la transfección de las células hiliares, seguido de una evaluación estadística de la calidad del ensayo. Por último, se realiza un cribado a escala genómica que mide la distribución del ciclo celular tras el agotamiento del gen diana. Los aciertos se seleccionan utilizando el estadístico zco y se verifican mediante ARN fáciles independientes secundarios.

Además, describimos los posibles procedimientos experimentales que se pueden utilizar para el seguimiento del cribado ocular de ARN. Hola, soy Ty del Instituto Max Plank de Biología Celular Molecular y Genética. Y Tristán.

Soy Frank Al, también del Instituto Marx Plunk de Dresde. Hoy le mostraremos un procedimiento para configurar una pantalla de pérdida de función en células de mamíferos utilizando ARN de misión fácil de Sigma Aldridge. Un ensayo para medir la distribución del ciclo celular en una población de células de cultivo de tejidos se utilizará como ejemplo para demostrar cómo los genes pueden vincularse al proceso biológico mediante el cribado de ARNi.

Así que comencemos. Cada proyecto de cribado de ARNi comienza con una selección de desencadenantes silenciadores, empleados en el si, los ARN preparados con endo ribonucleasa, los ARN o los ARN fáciles para abreviar se generan mediante la digestión enzimática limitada del ARN bicatenario largo utilizando ARN tres. La identidad de cada ARN fácil se verifica mediante secuenciación y la pureza mediante análisis de chip de laboratorio de calibre.

La agrupación de siRNAs individuales, todos dirigidos a la misma transcripción, aumenta la especificidad porque cada irna del grupo comparte lo mismo en el objetivo, mientras que los efectos fuera del objetivo se diluyen. Por lo tanto, los ARN fáciles tienen una buena eficacia de silenciamiento y una alta especificidad de la diana, evitando los efectos fuera de la diana. Escala genómica fácil.

bibliotecas de ARN son proporcionadas por Sigma Aldrich. En 384, placas de pozos con los pozos de borde vacíos. Además, ocho posiciones en el centro de la placa se dejan vacías para los controles.

Las subbibliotecas de ARN fáciles se proporcionan en placas de 96 pocillos con todos los pocillos ocupados aquí, los clientes pueden decidir cómo se colocarán los ARN fáciles en esas placas. Los ARN fáciles individuales se proporcionan en tubos individuales. La transfección de ARN fácil requiere optimización para diferentes reactivos de transfección y líneas celulares.

Aquí se curan nuestras células cultivadas siguiendo los procedimientos estándar y se utiliza oligonucleótido como reactivo de transfección. Utilice EEG cinco E-Z-R-N-A-A proteína motora de quinesina necesaria para el ensamblaje del huso bipolar como control positivo y ARN fácil de luciferasa ejecutada como control negativo. En una placa de 384 pocillos, valore diferentes cantidades de ARN fácil, por ejemplo, de un nanogramo a 56 nanogramos con un incremento de cinco nanogramos y cantidades crecientes de reactivo de transfección de 0,1 microlitros a 0,9 microlitros con un incremento de 0,05 microlitros.

Después de mezclar el ARN y el reactivo de transfección, agregue las células e incube durante 48 horas. Una vez finalizado el período de incubación, examine las células bajo un microscopio óptico. Cuente las células transfectadas con eeg.

Cinco ARN fáciles que muestran una forma redonda indicativa de mitótico. El resto también cuenta el número total de células transfectadas con un control negativo. Gran vainilla luciferasa de ARN fácil.

La condición óptima de transfección muestra la menor toxicidad para la luciferasa de vainilla y el fenotipo más pronunciado para el EEG cinco. Ahora que los parámetros de transfección están optimizados, proceda a la configuración y la pantalla principal. Las estaciones de pipeteo automatizadas, como Matrix, Wellm Mate o Tecan Aquarius, utilizadas para preparar las cribas primarias, deben colocarse debajo de la campana de flujo de lámina para evitar la contaminación.

Todos los componentes utilizados deben desinfectarse antes de su uso, ya sea mediante autoclave, si corresponde, o rociando con etanol al 75% antes de la pantalla. Estos instrumentos deben optimizarse de acuerdo con los protocolos del fabricante. Optimice la precisión del pipeteo para todos los componentes utilizados en la estación de pipeteo automatizada, ya que los parámetros de pipeteo cambian según el tipo de solución, el volumen y el tipo de placa.

Esta optimización debe repetirse para cada paso por separado. Además, optimice los protocolos de lavado para que se excluya la contaminación cruzada de un pozo a otro cuando las estaciones de pipeteo automatizadas estén listas. Transfecte las celdas en formato de 384 pocillos utilizando las condiciones optimizadas previamente determinadas para asegurarse de que no se observen efectos de posición.

Use ARN fáciles para EEG cinco y luciferasa de vainilla con un patrón alterno que cubra toda la placa. Deje todos los pocillos de borde vacíos, ya que un problema común cuando se usan placas de pocillos múltiples es la mayor evaporación en los pocillos de borde durante el tiempo de incubación. Esto conduce a diferentes condiciones experimentales en diferentes pozos, lo que a menudo se traduce en efectos de posición de la placa para minimizar aún más la evaporación, barreras de evaporación de empleados como Corning, cinta de techo transpirable.

También asegúrese de que las incubadoras se mantengan a alta humedad. Sin embargo, recuerde que existen las posibles fuentes de los efectos de posición, como la variación en el manejo de líquidos o el sistema de lectura, como un lector de placas. Después de la incubación durante 48 horas, fije las celdas con etanol 100% frío durante dos horas, luego rehidrate en PBS durante 15 minutos.

Tiñir las células fijas durante 25 minutos en PBS que contenga un microgramo por mililitro de DPI y 100 microgramos por mililitro de ARN. A finalmente lavar tres veces con PBS y almacenar a cuatro grados centígrados. A continuación, mida la intensidad de la fluorescencia DPI mediante microscopía.

Aquí se utiliza un sistema de escáner Olympus para cada uno. Examine bien las celdas y determine la intensidad relativa de DPI. Genere un histograma trazando la intensidad de PPP en función del número de celda en función del histograma.

Evalúe la distribución del ciclo celular calculando el porcentaje de células con contenido de ADN A: dos N para G, una fase G cero entre dos N y cuatro N para la fase S, cuatro veces, N para G dos fases MPH y más de cuatro N para aneuploidía o poliploidía. Con el fin de evaluar la homogeneidad de los resultados sobre la placa, compare la distribución del ciclo celular entre los diferentes pocillos comparando el porcentaje de células en fase G dos M para el EEG cinco y el transfecto de luciferasa si los resultados difieren significativamente sobre la placa, se requiere una mayor optimización para eliminar los efectos de posición. Una vez satisfecho con la consistencia de los resultados, calcule las diferencias estadísticas entre los controles positivos y negativos.

Utilice la ecuación del factor Z que se muestra aquí para determinar la significación estadística de los resultados. SD significa desviación estándar y AV significa promedio. Un factor Z entre uno y 0,5 indica una separación estadísticamente significativa entre los controles negativos y el ruido de los controles positivos.

Si se ha establecido tal diferencia estadística, se puede pasar a la pantalla principal. Prepara 384. Placas de cultivo de tejidos de pozos para la transfección de ARN fáciles utilizando las condiciones optimizadas predeterminadas aquí.

15 nanogramos de ARN fácil por pocillo se disuelven en cinco microlitros de tampón TE. Al menos ocho posiciones de control por placa están cargadas con controles positivos y negativos adecuados para el proceso biológico. Se estudió aquí, EEG cinco y luciferasa de ranil.

Los ARN fáciles se utilizan para evitar efectos de posición. Los pozos de borde se cargan solo con cinco microlitros de tampón TE. A continuación, agregue cinco microlitros de opti MEM que contengan 0,2 microlitros de oligo por mezcla de pocillo e incube durante 20 minutos a temperatura ambiente.

Después de mezclar el ARN con el reactivo de transfección, agregue la suspensión celular aquí. Se agregan 40 microlitros de una suspensión de células R a una concentración de 25 células por microlitro, lo que equivale a 1000 células por pocillo incubado durante 72 horas. Después de las 72 horas de incubación.

Mida el contenido de ADN en un microscopio automatizado como el Olympus scan R, como se muestra anteriormente. Repita este procedimiento para todas las placas de la biblioteca para la selección de resultados. Evalúe los valores de contenido de ADN utilizando estadísticos de puntuación Z.

Tenga en cuenta que la puntuación Z no es lo mismo que la puntuación Z del factor Z. Proporcionar una medida estadística de la significación del valor de la muestra en comparación con un control negativo o simulado. Se calcula siguiendo la ecuación que se muestra aquí.

Calcule el zco para todas las muestras de ARN fácil utilizando la señal para el control negativo de luciferasa vainilla como referencia para la selección de golpes, se debe aplicar un umbral. Normalmente, se utiliza un criterio de significación para Z mayor que dos o menor que menos dos. Sin embargo, dependiendo del proceso biológico estudiado o del alcance del cribado, se pueden aplicar diferentes umbrales.

También se pueden utilizar métodos de evaluación matemática más elaborados, como la Q, para la selección de aciertos. A continuación, las visitas seleccionadas se someten a un cribado secundario y a una validación HIIT. Un cribado secundario de los genes HIIT seleccionados sigue al cribado primario para eliminar los falsos positivos debidos a la variación experimental.

En primer lugar, verifique los aciertos seleccionados utilizando el mismo procedimiento que en la pantalla principal, excepto que configure los aciertos con un mayor número de réplicas entre tres y cinco para permitir una mejor evaluación estadística. Para los resultados verificados, utilice el mismo ensayo y lectura que en la pantalla primaria, pero con un ARN fácil secundario que no se superponga u otro desencadenante silenciador que no se superponga, como un si sintetizado químicamente. En última instancia, el ARN valida los genes seleccionados por especies cruzadas.

RNAI rescata, el estándar de oro para la verificación de fenotipos de RNAi disponible hasta la fecha. En resumen, un cromosoma artificial bacteriano abreviado que codifica un tronco ortonólogo de una especie diferente del gen seleccionado se transfecta de manera estable en las células. Las construcciones traseras preservan un gen en su contexto genómico y permiten una expresión casi fisiológica.

El ARNi frente al gen endógeno dejará inalterada la expresión del transgén orto, lo que rescata el fenotipo ARNi. Finalmente, los candidatos validados han estudiado con más detalle para finalmente derivar la comprensión mecanicista. En muchos casos, el ARNi también se puede utilizar en estos ensayos secundarios más elaborados.

Por ejemplo, la microscopía time-lapse de fenotipos de ARNi. Este es un ejemplo de un cribado del ciclo celular en el que se midió el contenido de ADN de las células R sanadas después de la eliminación de más de 16.000 genes del genoma humano. Se identificaron 1.351 aciertos primarios necesarios para la división celular.

En el cribado secundario, se verificaron 743 aciertos con un disparador secundario independiente de ARN fácil mediante un ensayo secundario. Las caídas que resultaron en un arresto por G dos se separaron de las caídas que resultaron en un arresto mitótico. Finalmente, en el experimento de rescate ocular de ARN de varias especies para el gen, se utilizó Lin 54 para validar su papel en la división celular adecuada.

Experimentos posteriores mostraron que el agotamiento de Lin 54 alteraba la expresión de muchos genes del ciclo celular. Acabamos de mostrarle cómo configurar la transfección de misión de alto rendimiento, los ARN fáciles y el análisis de la distribución del ciclo celular en la línea celular de cultivo de tejidos humanos. Al realizar este procedimiento, es importante recordar que las condiciones de transfección y los ensayos deben optimizarse por separado para cualquier sistema celular y cualquier proceso biológico.

Se recomienda el uso de sistemas automatizados de manejo de líquidos, pero no es indispensable, especialmente para pantallas a pequeña escala. La manipulación manual también es factible. Gracias por mirar y buena suerte con tus experimentos.