Name: MISIÓN esiRNA sobre el cribado del ARNi en células de mamífero (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-05-12T17:45:00.000+00:00
Duration: 15 min 31 s
Description: Aprende a realizar cribados de esiRNA en células de mamífero para identificar genes del ciclo celular. Este método optimiza la transfección y valida resultados mediante ensayos secundarios independientes.

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Queremos agradecer a los miembros del laboratorio Buchholz y el Sigma-Aldrich RNAi de equipo para la discusión. Nos gustaría agradecer a la Sociedad Max Planck y el Bundesministerium für Bildung und Forschung Grandes Go-Bio [0315105] para la ayuda. MISIÓN ® es una marca registrada de Sigma-Aldrich Biotecnología LP

1. De alta calidad bibliotecas MISIÓN esiRNA <ol><li> Para cada gen de interés de la región de destino más sensibles y específicos para la utilización de ARNi se elige el algoritmo DEQOR (http://cluster-1.mpi-cbg.de/Deqor/deqor.html). 4 puntuaciones DEQOR el potencial de silenciamiento de todos los posible 21 nucleótidos de largo siRNAs en un objetivo-mRNA basado en el estado de la técnica de diseño 4-restricciones. Además, cada siRNA potenciales se analizan las posibles reacciones cruzadas con otros genes mediante la realización de una búsqueda BLAST contra el transcriptoma del organismo estudiado. Modo, el programa proporciona un análisis de la calidad y el silenciamiento de las capacidades transversales de la esiRNA potencial (300-600 pb de longitud). </li><li> La zona elegida de la meta-gen de ADNc se amplificó por PCR utilizando cebadores específicos del gen flanqueado por bacteriófagos ARN-polimerasa-promotor de las secuencias. </li><li> Cada producto de PCR utilizado para la producción MISIÓN esiRNA se verifica la identidad de la secuenciación y análisis de pureza Caliper LabChip. </li><li> Largo ARN de doble cadena se transcribe a partir del producto de PCR por la ARN polimerasa, seguida de una hibridación de las cadenas transcritas. </li><li> esiRNAs son preparados por la digestión enzimática limitada de la larga ARN de doble cadena utilizando RNaseIII seguido por la purificación mediante cromatografía de intercambio aniónico utilizando Q-sefarosa columnas de centrifugado. </li><li> esiRNAs se precipitan y resuspendido en buffer TE. El rendimiento se mide por las mediciones de la absorción de los rayos UV y la concentración se ajusta mediante la disolución en un volumen adecuado de tampón TE. La calidad general del producto final está marcada por Caliper análisis LabChip. </li></ol> 2. La elección de una línea celular y la optimización de transfección para la detección <ol><li> Cantidades titular de esiRNA (uso Eg5 como positivo y renilla-luciferasa como control negativo) y el aumento de las cantidades de reactivo de transfección en una placa de 384 pocillos, agregar las células y se incuba durante 48 horas. Eg5 es una proteína motora quinesina necesarias para el montaje del huso bipolar y el agotamiento conduce a un arresto mitótico. Repita este procedimiento para los reactivos de transfección diferentes líneas celulares. Aquí, nosotros usamos las células HeLa cultivadas siguiendo los procedimientos estándar y oligofectamine (Invitrogen) como reactivo de transfección. </li><li> Para la elección de las condiciones óptimas de transfección contar las células transfectadas con Eg5 esiRNAs que muestran un paro mitótico (forma redonda) y el número total de células transfectadas con renilla-luciferasa (Rluc) esiRNA por microscopía de luz. Elija el estado con la menor toxicidad para Rluc y el fenotipo más pronunciado para Eg5. Un método alternativo para optimizar las condiciones de transfección consiste en una línea celular estable que expresan EGFP (u otro gen reportero adecuado), bajo el control de un promotor activo constitutiva. Después de la transfección de un esiRNA contra EGFP (u otro gen reportero) y Rluc (u otro esiRNA adecuado control negativo) medida derribo eficacia y la toxicidad por ejemplo, la clasificación de fluorescencia de células asistida (FACS). Asegúrese de que el esiRNA utilizado para EGFP es totalmente complementaria con el objetivo de ARNm. </li></ol> 3. Configuración de la pantalla principal 5,6 <ol><li> Optimizar la precisión de pipeteo para todos los componentes utilizados en una estación de pipeteo automatizado (por ejemplo, Acuario, Tecan y WellMate, Matrix). Debido a que los parámetros de pipeteo cambiar en función del tipo de tipo de solución, el volumen y la placa de esta optimización tiene que ser repetido para cada etapa por separado. Si es posible, la estación de pipeteo debe ser colocado bajo una campana de flujo laminar para evitar la contaminación. Todos los componentes utilizados deben ser desinfectados antes de su uso ya sea en autoclave o en su caso por pulverización con etanol al 75%. Optimizar los protocolos de lavado de modo que la contaminación cruzada de pozo a pozo está excluida. Detalles para la optimización de pipeteo automático no se puede dar el espacio para las restricciones y dependen en gran medida de la estación de pipeteo utilizadas. Para más información consulte a los fabricantes de protocolo. </li><li> Transfectar células en formato de 384 pocillos con las condiciones optimizadas desde arriba con esiRNAs para Eg5 y Rluc. Use un patrón alternante de Eg5 y esiRNA Rluc cubriendo todo el plato. </li><li> Después de la incubación durante 48 horas, fijar las células con etanol frío al 100%, rehidratar en PBS durante 15 minutos, la mancha durante 25 minutos en PBS que contenía 1 mg / ml DAPI y 100 ug / ml RNasa A (Qiagen). Por último lavado con PBS y se almacenan a 4 ° C. </li><li> Medir la intensidad de fluorescencia DAPI-por ejemplo, la microscopía en un sistema Olympus ScanR. Generar un histograma mediante el trazado de la intensidad de DAPI contra el número de células y evaluar la distribución del ciclo celular mediante el cálculo del porcentaje de células con el 2N contenido de ADN para la fase G1; &lt;2N&gt; 4N de la fase S; 4N para G2/M-phase y &gt; 4N de aneuploidía / poliploidía. </li><li> Evaluar la homogeneidad de los resultados sobre la placa. Una mayor optimización es necesaria si los resultados difieren significativamente de excluir a effe posicióncts. Un problema común cuando se utilizan múltiples placas es aumento de la evaporación en los pozos del borde durante el tiempo de incubación. Esto lleva a diferentes condiciones experimentales en diferentes pozos, que a menudo se traduce en efectos específicos de posición de la placa. Por esta razón, se recomienda dejar todos los pozos vacíos borde de una pantalla. Para minimizar aún más la evaporación asegurarse de que las incubadoras se mantienen a la alta humedad. También emplean habitualmente las barreras evaporación, tales como cintas de sellado Corning transpirable que bloquean la evaporación. Recursos también para otros efectos de posición tienen que ser tomadas en cuenta, por ejemplo, la variación técnica del sistema de lectura (microscopio, lector de placas, etc) o las variaciones en el manejo de líquidos (pendientes, falta de homogeneidad de las soluciones, etc.) </li><li> Las diferencias estadísticas entre los controles positivos y negativos de proporcionar una medida de la importancia de los análisis utilizados. Una gran diferencia entre el control negativo (o el ruido de fondo, la maqueta de control) y la muestra tiene que ser establecida antes de iniciar el examen real. Una buena medida para la significación estadística es el factor Z. El factor Z se calcula con la ecuación: Z = 1 - (3 SD [muestra] + 3 SD [maqueta]) * (| Av. [muestra] - Av. [maqueta] |) -1; con SD: desviación estándar; Av: media. Un factor Z de 1&gt; Z&gt; 0,5 indica una separación significativa de los controles negativos (y ruido) de los controles positivos 7. </li></ol> 4. Pantalla principal <ol><li> Preparar 384 y placas de cultivo de tejidos para la transfección de esiRNAs utilizando las condiciones optimizadas desde arriba. Aquí, nosotros usamos esiRNA 15NG por bien disuelta en buffer TE 5μl. Al menos ocho puestos de control por placa se debe cargar con adecuados controles positivos y negativos de los procesos biológicos estudiados (en este caso Eg5 y Rluc). Para evitar los efectos de posición de los pozos se cargan con borde 5μl buffer TE solamente. </li><li> Añadir 5μl OptiMEM (Invitrogen) que contiene Oligofectamine 0.2μl por tanto, mezclar e incubar durante 20 minutos a temperatura ambiente. </li><li> Añadir la suspensión de células en la mezcla de transfección (aquí: 40μl de una suspensión de células HeLa a 25 células / l de concentración, equivalente a 1.000 células por pocillo) y se incuba durante 72 horas. </li><li> Medida del ADN contenido en un microscopio automatizado (Olympus ScanR, ver arriba). Evaluar con Z-score estadísticas para la selección de golpe: Z-scores se calculan para todos los esiRNAs muestra usando la señal para el control negativo como referencia. Tenga en cuenta que el Z-score no es el mismo que el Z-factor. Z-scores proporcionar una medida estadística de significación de los valores de la muestra, en comparación con un control (maqueta). Se calcula según la ecuación: Z = (valor [Sample] - media [maqueta]) * desviación estándar [maqueta] -1. Para la selección de un umbral de éxito tiene que ser aplicado. Por lo general, un criterio de importancia como: 2 &lt;Z &lt;-2 se utiliza, pero dependiendo de la calidad del conjunto de datos, el proceso biológico estudiado o, simplemente, el alcance de la pantalla, los umbrales aplicables sean diferentes. Junto a la relativamente fácil puntaje Z-estadísticas métodos matemáticos también más elaborado de evaluación se pueden utilizar (en su interior por primera vez en el amplio campo de la evaluación estadística de los datos de investigación se puede encontrar en el Malo et al. 8). </li></ol> 5. Pantalla secundaria y la validación de éxito <ol><li> Una pantalla secundaria sigue la pantalla principal para eliminar falsos positivos debido a errores experimentales o efectos fuera del objetivo. Por los golpes seleccionado el mismo procedimiento que el utilizado en la pantalla principal se debe repetir para un mayor número de repeticiones (3-5) para permitir una mejor evaluación estadística. </li><li> Por éxitos verificado una esiRNA secundaria que no se superponen (o cualquier otro disparo silenciador no se superponen) con los objetivos fijados en las pantallas iniciales deben ser utilizados. El mismo ensayo y lectura se debe aplicar en cuanto a la pantalla principal. </li><li> En última instancia los genes seleccionados pueden ser validadas por las especies cruzadas de rescate RNAi 9. Por lo tanto un cromosoma artificial bacteriano (BAC) que codifica por ejemplo, el ortólogo de ratón de los genes es transfectadas establemente en las células. BAC-construcciones de preservar un gen en su contexto genómico y permitir una expresión casi fisiológica. ARNi contra el gen humano endógeno saldrá de la expresión transgénica de ratón alterado que rescata la RNAi fenotipo. RNAi de rescate proporciona el estándar de oro para la verificación de los fenotipos RNAi disponible hasta la fecha. </li><li> Finalmente, los candidatos validados se estudian con más detalle a la larga se derivan comprensión mecanicista. En muchos casos, el ARNi puede ser utilizado en estos experimentos, por ejemplo, en los ensayos de secundaria, más elaborado. </li></ol>

<ol><li>Ghildiyal, M., Zamore, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+silencing+RNAs%3A+an+expanding+universe%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Small silencing RNAs: an expanding universe.</a> Nat Rev Genet. 10, 94-108 (2009).</li>
<li>Jackson, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+profiling+reveals+off-target+gene+regulation+by+RNAi%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Expression profiling reveals off-target gene regulation by RNAi.</a> Nat Biotechnol. 21, 635-637 (2003).</li>
<li>Echeverri, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimizing+the+risk+of+reporting+false+positives+in+large-scale+RNAi+screens%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Minimizing the risk of reporting false positives in large-scale RNAi screens.</a> Nat Methods. 3, 777-779 (2006).</li>
<li>Henschel, A., Buchholz, F., Habermann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DEQOR%3A+a+web-based+tool+for+the+design+and+quality+control+of+siRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">DEQOR: a web-based tool for the design and quality control of siRNAs.</a> Nucleic Acids Res. 32, W113-W120 (2004).</li>
<li>Kittler, R., Pelletier, L., Buchholz, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systems+biology+of+mammalian+cell+division%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Systems biology of mammalian cell division.</a> Cell Cycle. 7, 2123-2128 (2008).</li>
<li>Kittler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-scale+RNAi+profiling+of+cell+division+in+human+tissue+culture+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Genome-scale RNAi profiling of cell division in human tissue culture cells.</a> Nat Cell Biol. 9, 1401-1412 (2007).</li>
<li>Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Simple+Statistical+Parameter+for+Use+in+Evaluation+and+Validation+of+High+Throughput+Screening+Assays%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomol+Screen%22%5BJournal%5D)">A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays.</a> J Biomol Screen. 4, 67-73 (1999).</li>
<li>Malo, N., Hanley, J. A., Cerquozzi, S., Pelletier, J., Nadon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Statistical+practice+in+high-throughput+screening+data+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Statistical practice in high-throughput screening data analysis.</a> Nat Biotechnol. 24, 167-175 (2006).</li>
<li>Kittler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+interference+rescue+by+bacterial+artificial+chromosome+transgenesis+in+mammalian+tissue+culture+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">RNA interference rescue by bacterial artificial chromosome transgenesis in mammalian tissue culture cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 2396-2401 (2005).</li>
<li>Kittler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+resources+for+endoribonuclease-prepared+short+interfering+RNAs+for+specific+loss-of-function+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Genome-wide resources for endoribonuclease-prepared short interfering RNAs for specific loss-of-function studies.</a> Nat Methods. 4, 337-344 (2007).</li>
</ol>

Autores declaran las relaciones financieras con entidades comerciales que puedan tener un interés en el trabajo presentado.

La interferencia de ARN se ha convertido en una técnica estándar para estudiar la pérdida de la función de los fenotipos. A gran escala colecciones de RNAi mediadores están disponibles a partir de diferentes proveedores y proporcionar un método fácil, rentable y rápida para la silenciación del gen. Esto abrió la puerta para la detección sistemática de agentes clave en muchos procesos biológicos que permite un punto de vista del genoma a gran escala sobre una amplia gama de diferentes especies y tipos de células. Las altas tasas de falsos positivos y falsos negativos es un reto común en las pantallas de RNAi. Para solucionar este problema, han realizado considerables esfuerzos invertidos para mejorar la eficacia y, en particular, provoca la especificidad de la silenciación. Un descubrimiento importante fue que un grupo de diferentes siRNAs dirigidos la misma transcripción mejora en gran medida la especificidad de destino. Debido a que un grupo muy complejo de diferentes siRNAs se produce por la endoribonuclease, esiRNAs son de alta especificidad desencadena objetivo, la reducción de la tasa de falsos positivos en las pantallas de RNAi. esiRNAs también han demostrado para lograr caídas eficaz, reduciendo también la tasa de falsos negativos. Como las pantallas de RNAi son técnicamente exigentes, probablemente seguirá siendo un reto para llevar a cabo de forma rutinaria durante algún tiempo. Sin embargo, como los reactivos y los instrumentos de los laboratorios de obtener una mejor y más compartir su experiencia, el uso de pantallas de RNAi en la biología moderna se considera que aumentará en el futuro.

<table><tbody><tr><td>MISSION esiRNA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>Para obtener información adicional, comuníquese con: rnai@sial.com</td></tr><tr><td>Wellmate</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cinta sellante permeable al aire</td><td>Corning</td><td>Cinta sellante permeable al aire, estéril (Producto #3345)</td><td></td></tr><tr><td>OptiMEM</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;a href=&quot;http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&amp;amp;N4=E7023%7CSIAL&amp;amp;N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&amp;amp;F=SPEC&amp;amp;cm_sp=affiliate-_-Jove-_-12346">Etanol&lt;/a&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td>prueba 200 (absoluto), para biología molecular</td></tr><tr><td>&lt;a href=&quot;http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&amp;amp;N4=P5493%7CSIGMA&amp;amp;N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&amp;amp;F=SPEC&amp;amp;cm_sp=affiliate-_-Jove-_-12347">Solución salina tamponada con fosfato&lt;/a&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5493</td><td>BioReagente, concentrado 10x, adecuado para cultivo celular, para biología molecular</td></tr><tr><td>&lt;a href=&quot;http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&amp;amp;N4=D8417%7CSIGMA&amp;amp;N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&amp;amp;F=SPEC&amp;amp;cm_sp=affiliate-_-Jove-_-12348">Clorhidrato de 4&amp;#8242;,6-diamidino-2-fenilindol&lt;/a&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8417</td><td>Polvo, BioReagente, adecuado para cultivo celular, &amp;gt;98% (HPLC y TLC)</td></tr><tr><td>&lt;a href=&quot;http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&amp;amp;N4=R6513%7CSIGMA&amp;amp;N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&amp;amp;F=SPEC&amp;amp;cm_sp=affiliate-_-Jove-_-12349">Ribonucleasa A de páncreas bovino&lt;/a&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R6513</td><td>Para biología molecular, &amp;#8805;70 unidades Kunitz/mg de proteína, polvo liofilizado</td></tr><tr><td>&lt;a href=&quot;http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&amp;amp;N4=T9285%7CSIGMA&amp;amp;N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&amp;amp;F=SPEC&amp;amp;cm_sp=affiliate-_-Jove-_-12350">Solución tampón Tris-EDTA&lt;/a&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9285</td><td>100 x, para biología molecular</td></tr></tbody></table>

misiÓn esirna sobre el cribado del arni en células de mamífero

MISSION esiRNA for RNAi Screening in Mammalian Cells

ARN de interferencia (ARNi) es un mecanismo celular básico para el control de la expresión génica. El ARNi es inducida por el corto ARN de doble cadena también conocido como pequeños RNAs de interferencia (siRNA). El corto ARN de doble cadena se originan a partir de precursores más de doble cadena por la actividad de Dicer, una proteína de la familia de RNasa III de endonucleasas. Los fragmentos resultantes son los componentes del complejo de ARN inducida por silenciar (RISC), dirigiendo a la meta del mRNA afines. RISC corta el ARNm diana lo que se reduce la expresión de la proteína codificada 1,2,3. RNAi se ha convertido en un método experimental poderosa y ampliamente utilizado para la pérdida de los estudios de la función de genes en células de mamíferos que utilizan pequeños RNAs de interferencia. Actualmente hay dos métodos principales se encuentran disponibles para la producción de pequeños RNAs de interferencia. Un método consiste en la síntesis química, mientras que un método alternativo emplea endonucleolytic división del objetivo específico a largo ARN de doble cadena de RNasa III in vitro. Por lo tanto, un grupo diverso de como siRNA oligonucleótidos se produce lo que se conoce también como endoribonuclease preparado siRNA o esiRNA. Una comparación de la eficacia de siRNAs químicamente derivados y esiRNAs muestra que los dos gatillos son potentes en el silenciamiento de genes diana. Las diferencias pueden, sin embargo, se observa al comparar la especificidad. Muchos siRNAs única de síntesis química produce importantes efectos fuera del objetivo, mientras que la mezcla compleja inherente a esiRNAs conduce a una caída más específico 10. En este estudio, se presenta el diseño de bibliotecas a escala del genoma esiRNA MISIÓN y su utilización para la investigación de RNAi ejemplificado por una pantalla de contenido de ADN para la identificación de genes implicados en la progresión del ciclo celular. Mostramos la manera de optimizar el protocolo de transfección y el ensayo para la detección de alto rendimiento. También muestra cómo grandes grupos de datos pueden ser evaluados estadísticamente y los actuales métodos para validar accesos principales. Por último, damos los posibles puntos de partida para nuevas caracterizaciones funcionales de accesos validado.

Aquí se utiliza una biblioteca esiRNA humanos en una pantalla de alto rendimiento de los genes implicados en la división celular. Demostramos cómo configurar y llevar a cabo una esiRNA pantallas, así como la forma de analizar y validar los resultados.

MISIÓN esiRNA sobre el cribado del ARNi en células de mamífero

La interferencia de ARN (ARNi) es un mecanismo celular básico para el control de la expresión génica. La ARNi es inducida por ARN cortos de cadena doble, también conocidos como...

La detección de genes asociados al ciclo celular mediante ARNai comienza con la elección de una tecnología de silenciamiento adecuada, como Mission.Easy. Las bibliotecas de ARN de Sigma Aldrich aprovechan la alta eficiencia y especificidad de los siARN preparados con ribonucleasa endógena. Los ARN easy son mezclas complejas de siARN individuales, preparados mediante digestión enzimática de ARN bicatenario largo, complementario al ARN mensajero diana. La agrupación de siARN que dirigen el mismo transcrito aumenta la especificidad y evita la búsqueda laboriosa de siARN individuales eficientes y específicos.Esto hace que el ARN de interferencia sea especialmente adecuado para cribados de pérdida de función a gran y mediana escala. A continuación se muestran los pasos necesarios para realizar un cribado a gran escala del ojo mediante ARN de interferencia, desde el establecimiento de la transfección de alto rendimiento hasta el desarrollo de un ensayo apropiado. Esto se ejemplifica mediante el montaje de un cribado para identificar genes implicados en la progresión del ciclo celular de mamíferos.Primero, mostramos cómo se optimizó la transfección de células hilar, seguida de la evaluación estadística de la calidad del ensayo. Finalmente, se realiza una pantalla a escala del genoma para medir la distribución del ciclo celular tras el agotamiento del gen diana. Los resultados positivos se seleccionan utilizando el estadístico zco y se verifican mediante ARN de interferencia independientes de fácil uso.Además, describimos procedimientos experimentales potenciales que pueden utilizarse para continuar con la cribado de ARN en el ojo. Hola, soy Ty del Instituto Max Plank de Biología Celular Molecular y Genética. Y Tristan.Soy Frank Al, también del Instituto Marx Plunk en Dresde. Hoy les mostraremos un procedimiento para establecer una pantalla de pérdida de función en células de mamífero utilizando ARN fáciles Mission de Sigma Aldridge. Un ensayo para medir la distribución del ciclo celular en una población de células de cultivo tisular se utilizará como ejemplo para demostrar cómo se pueden asociar genes a procesos biológicos mediante el uso de pantallas de ARNi.Así que comencemos. Todo proyecto de cribado por ARNi comienza con la elección de los desencadenantes de silenciamiento; los ARNsi preparados con ribonucleasa endógena, o ARNe fáciles de usar (easy RNAs) abreviados, se generan mediante digestión enzimática limitada de ARN bicatenario largo utilizando RNasas tres. Cada ARNe fácil de usar se verifica por secuenciación para confirmar su identidad y mediante análisis con chip de laboratorio Caliper para comprobar su pureza.La agrupación de siARN individuales que todos dirigen al mismo transcrito aumenta la especificidad, ya que cada irna en el grupo comparte el mismo objetivo principal, mientras que los efectos fuera del objetivo se diluyen. Por lo tanto, los easy RNAs presentan buena eficacia de silenciamiento y alta especificidad del blanco, evitando efectos fuera del objetivo. Escala del genoma easy.Las bibliotecas de ARN son proporcionadas por Sigma Aldrich. En placas de 384 pocillos, con los pocillos periféricos vacíos. Además, ocho posiciones en el centro de la placa se dejan vacías para los controles.Las subbibliotecas de ARN fáciles se proporcionan en placas de 96 pocillos, con todos los pocillos ocupados; aquí, los clientes pueden decidir cómo se organizarán los ARN fáciles en dichas placas. Los ARN fáciles individuales se proporcionan en tubos individuales. La transfección de ARN fácil requiere una optimización según los diferentes reactivos de transfección y líneas celulares.Aquí se cultivan nuestras células siguiendo procedimientos estándar y se utiliza el oligo como reactivo de transfección. Utilice EEG cinco E-Z-R-N-A-A, una proteína motora de cinasa necesaria para el ensamblaje del huso bipolar, como control positivo, y fácil ARN de luciferasa como control negativo. En una placa de 384 pocillos, realice una titulación con diferentes cantidades de ARN fácil, por ejemplo, desde un nanogramo hasta 56 nanogramos con incrementos de cinco nanogramos, y cantidades crecientes de reactivo de transfección desde 0,1 microlitros hasta 0,9 microlitros con incrementos de 0,05 microlitros.Después de mezclar el ARN y el reactivo de transfección, agregue las células e incube durante 48 horas. Cuando haya finalizado el período de incubación, examine las células bajo un microscopio óptico. Cuente las células transfectadas con eeg.Cinco ARN fáciles que muestran una forma redondeada indicativa de mitosis. También cuente el número total de células transfectadas con un control negativo. ARN fácil de luciferasa de gran vainilla.La condición óptima de transfección muestra la menor toxicidad para la luciferasa de vainilla y el fenotipo más pronunciado para EEG cinco. Ahora que los parámetros de transfección han sido optimizados, continúe con la configuración y la pantalla primaria. Las estaciones de pipeteo automatizadas, como Matrix Wellm Mate o Tecan Aquarius, utilizadas para preparar las pantallas primarias, deben colocarse bajo una cabina de flujo laminar para evitar contaminación.Todos los componentes utilizados deben desinfectarse antes de su uso, ya sea mediante autoclave si es aplicable o rociándolos con etanol al 75 % antes de la prueba. Estos instrumentos deben optimizarse según los protocolos del fabricante. Optimice la precisión del pipeteo para todos los componentes utilizados en la estación de pipeteo automatizada, ya que los parámetros de pipeteo varían según el tipo de solución, el volumen y el tipo de placa.Esta optimización debe repetirse para cada paso por separado. Además, optimice los protocolos de lavado para excluir la contaminación cruzada de pocillo a pocillo cuando las estaciones de pipeteo automatizadas estén listas. Transfecte las células en formato de 384 pocillos utilizando las condiciones optimizadas determinadas previamente para asegurarse de que no se observen efectos de posición.Utilice ARN fáciles para EEG cinco y luciferasa vainilla con un patrón alternante que cubra toda la placa. Deje todas las pocillos periféricos vacíos, ya que un problema común al usar placas de múltiples pocillos es la evaporación aumentada en los pocillos del borde durante el tiempo de incubación. Esto conduce a condiciones experimentales diferentes en distintos pocillos, lo que a menudo se traduce en efectos de posición en la placa; para minimizar aún más la evaporación, utilice barreras contra la evaporación como la cinta respirable Corning.Asegúrese también de que los incubadores se mantengan a alta humedad. Sin embargo, recuerde que existen posibles fuentes de efectos de posición, como variaciones en el manejo de líquidos o en el sistema de lectura, por ejemplo un lector de placas. Después de la incubación durante 48 horas, fije las células con etanol al 100 % frío durante dos horas y luego rehidrate en PBS durante 15 minutos.Tiña las células fijadas durante 25 minutos en PBS que contenga un microgramo por mililitro de DPI y 100 microgramos por mililitro de ARN. A continuación, lave tres veces con PBS y almacene a cuatro grados Celsius. A continuación, mida la intensidad de la fluorescencia de DPI mediante microscopía.Se utiliza aquí un sistema de escáner Olympus para cada uno. Examinaremos las células y determinaremos la intensidad relativa de DPI. Genere un histograma graficando la intensidad de DPI frente al número de células en función del histograma.Evalúe la distribución del ciclo celular calculando el porcentaje de células con un contenido de ADN de 2N para la fase G1/G0, entre 2N y 4N para la fase S, 4N para la fase G2/M y mayor de 4N para aneuploidía o poliploidía. Con el fin de evaluar la homogeneidad de los resultados a lo largo de la placa, compare la distribución del ciclo celular entre los diferentes pocillos comparando el porcentaje de células en fase G2/M para EEG5 y luciferasa transfectada. Si los resultados difieren significativamente a lo largo de la placa, se requiere una mayor optimización para eliminar los efectos de posición. Una vez satisfecho con la consistencia de los resultados, calcule las diferencias estadísticas entre los controles positivo y negativo.Utilice la ecuación del factor Z mostrada aquí para determinar la significancia estadística de los resultados. SD representa la desviación estándar y AV representa el promedio. Un factor Z entre uno y 0,5 indica una separación estadísticamente significativa entre los controles negativos y el ruido frente a los controles positivos.Si se ha establecido dicha diferencia estadística, se puede proceder a la pantalla primaria. Prepare placas de cultivo celular de 384 pocillos para la transfección de ARN fáciles utilizando aquí las condiciones optimizadas predeterminadas.Quince nanogramos de ARN fácil por pocillo se disuelven en cinco microlitros de tampón TE. Se cargan al menos ocho posiciones de control por placa con controles positivos y negativos adecuados para el proceso biológico. Estudiados aquí, EEG cinco y ranil luciferasa.Los ARN fáciles se utilizan para evitar los efectos de posición. Los pocillos periféricos se cargan solo con cinco microlitros de tampón TE. A continuación, agregue cinco microlitros de opti MEM que contenga 0,2 microlitros de oligo por mezcla de pocillo e incube durante 20 minutos a temperatura ambiente.Después de mezclar el ARN con el reactivo de transfección, agregue aquí la suspensión celular. Se añaden 40 microlitros de una suspensión de células he a una concentración de 25 células por microlitro, equivalente a 1000 células por pocillo, e incube durante 72 horas. Después de la incubación de 72 horas.Mida el contenido de ADN en un microscopio automatizado, como el Olympus scanR, tal como se ha mostrado previamente. Repita este procedimiento para todas las placas de la biblioteca para la selección de resultados positivos. Evalúe los valores del contenido de ADN utilizando estadísticas de puntuación Z.Tenga en cuenta que el valor Z no es lo mismo que el factor Z. Proporciona una medida estadística de la significancia del valor de la muestra en comparación con un control negativo o simulado. Se calcula según la ecuación mostrada aquí.Calcule el zco para todas las muestras fáciles de ARN utilizando la señal del control negativo de luciferasa de vainilla como referencia para la selección de resultados positivos. Debe aplicarse un umbral. Por lo general, se utiliza un criterio de significancia para Z mayor que dos o menor que menos dos. Sin embargo, dependiendo del proceso biológico estudiado o del alcance del análisis, pueden aplicarse diferentes umbrales.Se pueden utilizar métodos matemáticos de evaluación más elaborados, como la Q, también para la selección de aciertos. A continuación, los aciertos seleccionados se someten a una pantalla secundaria y a la validación de HIIT. Una pantalla secundaria de los genes HIIT seleccionados sigue a la pantalla primaria para eliminar los falsos positivos debidos a la variación experimental.Primero, verifique los aciertos seleccionados utilizando el mismo procedimiento que en la pantalla primaria, excepto que configure los aciertos con un mayor número de réplicas, entre tres y cinco, para permitir una mejor evaluación estadística. Para los aciertos verificados, utilice el mismo ensayo y lectura que en la pantalla primaria, pero con un ARN de interferencia fácil no solapado secundario o con otro inductor de silenciamiento no solapado, como un siARN sintetizado químicamente. Finalmente, valide los genes seleccionados mediante análisis entre especies.El rescate mediante ARNi es el estándar de oro para la verificación de los fenotipos de ARNi disponibles hasta la fecha. En resumen, un cromosoma artificial bacteriano, abreviado como BAC, que codifica un ortólogo de una especie diferente del gen seleccionado, se transfecta establemente en células. Los constructos BAC preservan al gen en su contexto genómico y permiten una expresión casi fisiológica.El ARNi contra el gen endógeno dejará inalterada la expresión del transgén ortólogo, lo que rescata el fenotipo del ARNi. Finalmente, los candidatos validados se estudian con mayor detalle para derivar eventualmente una comprensión mecanicista. En muchos casos, el ARNi también puede utilizarse en estos ensayos secundarios más elaborados.Por ejemplo, microscopía de lapso de tiempo de fenotipos de ARNi. A continuación se muestra un ejemplo de una pantalla del ciclo celular en la que se midió el contenido de ADN de células R tras el silenciamiento de más de 16.000 genes del genoma humano. Se identificaron 1.351 blancos primarios necesarios para la división celular.En la pantalla secundaria, se verificaron 743 resultados positivos mediante un segundo disparador de ARN independiente y sencillo, utilizando un ensayo secundario. Los silenciamientos que provocaron una detención en G2 se separaron de aquellos que causaron una detención mitótica. Finalmente, se realizó un experimento de rescate del ojo mediado por ARN entre especies para el gen Lin 54, con el fin de validar su función en la división celular adecuada.Experimentos posteriores mostraron que el agotamiento de Lin 54 alteró la expresión de muchos genes del ciclo celular. Acabamos de mostrarle cómo configurar la transfección de alto rendimiento de RNAs Mission Easy y el análisis de la distribución del ciclo celular en la línea celular de cultivo de tejido humano. Al realizar este procedimiento, es importante recordar que las condiciones de transfección y los ensayos deben optimizarse por separado para cualquier sistema celular y cualquier proceso biológico.Se recomienda el uso de sistemas automatizados de manipulación de líquidos, aunque no son indispensables, especialmente para ensayos a pequeña escala. También es viable la manipulación manual. Eso es todo. Gracias por ver este video y buena suerte con sus experimentos.

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