Análisis Coculture de interacciones entre proteínas extracelulares que afectan a la secreción de insulina por las células beta del páncreas

El objetivo general de este procedimiento es investigar cómo las interacciones transcelulares que involucran los dominios extracelulares de proteínas transmembrana específicas afectan la función de las células beta y, más específicamente, la secreción de insulina. Esto se logra mediante el primer seccionamiento, una línea celular de mamífero con un plásmido que contiene la proteína de interés en el segundo paso. Una línea celular beta es co-cultivo con las células de mamíferos.

En el paso final, el cocultivo se incuba en medios con diferentes concentraciones de glucosa para permitir la evaluación de la secreción de insulina estimulada por glucosa. En última instancia, los radioinmunoensayos de insulina o Eliza se utilizan para evaluar los niveles de insulina secretados en los medios por las células beta cultivadas. La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como la sobreexpresión de genes y la eliminación, es que evita la perturbación del ARNm y la expresión de proteínas, lo que podría afectar la salud o la función de las células beta de maneras que pueden confundir los análisis de la interacción específica de la proteína.

Comience transfiriendo las celdas HEC 2 93 a una placa de 24 pocillos en 0,5 mililitros de medios HEC 2 93 por pocillo para asegurarse de que las celdas se distribuyan uniformemente por la parte inferior de la placa. Agite la placa a lo largo de un eje a la vez con una velocidad sincrónica con la onda formada en el pozo. Cuando las células HEC 2 93 alcanzan el 100% de fluidez, transfecte los cultivos con 0,8 microgramos del plásmido que codifica para la proteína de interés en dos microlitros de lipo 2000.

De acuerdo con el protocolo lipo, el esquema general del cocultivo que se va a demostrar se representa aquí utilizando un removedor de células no enzimático. Comience este paso recolectando células INS one con una fluidez aproximada del 70 al 80% desde el fondo de un matraz de cultivo T 75. Después de centrifugar las celdas durante tres minutos a 150 Gs a temperatura ambiente, use una pipeta P 1000 para resuspender el pellet en un mililitro de medio INS uno y medio.

A continuación, utilice una pipeta de 10 mililitros para añadir 24 mililitros adicionales de medio mezclado y resus suspender las células, aspirar los medios de los pocillos de la placa de 24 pocillos que contiene las células HEC 2 9 3. A continuación, con una pipeta P 1000, añada suavemente 500 microlitros de la suspensión de una célula INS sobre la capa de células hexagonales a lo largo de los lados del pocillo. Después de cada seis pocillos, use una pipeta de 10 mililitros para volver a suspender las celdas INS uno.

De nuevo para asegurar una suspensión celular homogénea. Ahora incuba las células durante 24 a 48 horas, dependiendo del protocolo experimental. Después de que las células se hayan incubado durante el período experimental deseado, un pocillo a la vez, aspire el medio de cocultivo con una mano e inmediatamente reemplace el medio con 250 microlitros de glucosa de 2,5 milimolares en tampón de bicarbonato Krebs ringer con la otra.

Después de preincubar los cocultivos durante una hora, cambie el tampón KRB de baja glucosa por 250 microlitros de glucosa de 2,5 milimolares o 20 milimolares. Después de otra hora de incubación, transfiera el tampón KRB a tubos de micro fuga y gire el tampón durante cinco minutos a 1500 G y cuatro grados Celsius mientras los tubos están en la centrífuga. Agregue inmediatamente 100 microlitros de tampón de lisis celular rippa con inhibidores de la proteasa a la placa e incube la placa durante 20 minutos a cuatro grados centígrados.

Cuando los tubos hayan terminado de girar, retire 200 microlitros del sobrenadante para su posterior análisis mediante radioinmunoensayo de insulina o Eliza. Finalmente, centrifugar lo que ahora es lisado celular durante 15 minutos a 10.000 g y luego extraer 50 microlitros del SNAT para su análisis mediante radioinmunoensayo de insulina o Eliza. Aquí, se muestran los resultados obtenidos del cocultivo de células beta INS one con células HC 2 93 transfectadas para expresar una isoforma de neuro liggen denominada NLX.

La expresión de NLX aumentó la secreción basal y estimuló la secreción de insulina por células I NS cocultivadas con una. El dominio extracelular NX debe estar interactuando con otra proteína o molécula en la superficie de una célula para hacer que las células INS uno secreten más insulina. Los resultados de otros tipos de análisis utilizando el sistema de cocultivo se muestran en los dos gráficos siguientes.

En este primer gráfico se muestra el aumento del contenido de insulina de las células INS one cocultivadas por NLY. Mientras que en este experimento, el ARN se recolectó de la capa celular y se analizó mediante R-T-Q-P-C-R. El cocultivo con NLY aumentó los niveles de insulina y PDX uno.

Después de este procedimiento, se pueden realizar métodos adicionales como la QPCR o la inmunohistoquímica cuantitativa para responder a preguntas adicionales como si las interacciones extracelulares de la proteína transfectada pueden causar cambios en la estructura celular o en la expresión génica.