Análisis Coculture de interacciones entre proteínas extracelulares que afectan a la secreción de insulina por las células beta del páncreas
15 de junio de 2013
Interacciones proteína transcelular son determinantes importantes de la función de las células beta pancreáticas. Detalladas aquí es un método adaptado de un modelo de co-cultivo de sinaptogénesis-para investigar cómo las proteínas transmembrana específicos influyen en la secreción de insulina. Células HEK293 transfectadas expresan proteínas de interés; células beta no necesitan ser transfectadas o de otro modo perturbado directamente.
El objetivo general de este procedimiento es investigar cómo las interacciones transcelulares que involucran los dominios extracelulares de proteínas transmembrana específicas afectan la función de las células beta y, más específicamente, la secreción de insulina. Esto se logra mediante el primer seccionamiento, una línea celular de mamífero con un plásmido que contiene la proteína de interés en el segundo paso. Una línea celular beta es co-cultivo con las células de mamíferos.
En el paso final, el cocultivo se incuba en medios con diferentes concentraciones de glucosa para permitir la evaluación de la secreción de insulina estimulada por glucosa. En última instancia, los radioinmunoensayos de insulina o Eliza se utilizan para evaluar los niveles de insulina secretados en los medios por las células beta cultivadas. La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como la sobreexpresión de genes y la eliminación, es que evita la perturbación del ARNm y la expresión de proteínas, lo que podría afectar la salud o la función de las células beta de maneras que pueden confundir los análisis de la interacción específica de la proteína.
Comience transfiriendo las celdas HEC 2 93 a una placa de 24 pocillos en 0,5 mililitros de medios HEC 2 93 por pocillo para asegurarse de que las celdas se distribuyan uniformemente por la parte inferior de la placa. Agite la placa a lo largo de un eje a la vez con una velocidad sincrónica con la onda formada en el pozo. Cuando las células HEC 2 93 alcanzan el 100% de fluidez, transfecte los cultivos con 0,8 microgramos del plásmido que codifica para la proteína de interés en dos microlitros de lipo 2000.
De acuerdo con el protocolo lipo, el esquema general del cocultivo que se va a demostrar se representa aquí utilizando un removedor de células no enzimático. Comience este paso recolectando células INS one con una fluidez aproximada del 70 al 80% desde el fondo de un matraz de cultivo T 75. Después de centrifugar las celdas durante tres minutos a 150 Gs a temperatura ambiente, use una pipeta P 1000 para resuspender el pellet en un mililitro de medio INS uno y medio.
A continuación, utilice una pipeta de 10 mililitros para añadir 24 mililitros adicionales de medio mezclado y resus suspender las células, aspirar los medios de los pocillos de la placa de 24 pocillos que contiene las células HEC 2 9 3. A continuación, con una pipeta P 1000, añada suavemente 500 microlitros de la suspensión de una célula INS sobre la capa de células hexagonales a lo largo de los lados del pocillo. Después de cada seis pocillos, use una pipeta de 10 mililitros para volver a suspender las celdas INS uno.
De nuevo para asegurar una suspensión celular homogénea. Ahora incuba las células durante 24 a 48 horas, dependiendo del protocolo experimental. Después de que las células se hayan incubado durante el período experimental deseado, un pocillo a la vez, aspire el medio de cocultivo con una mano e inmediatamente reemplace el medio con 250 microlitros de glucosa de 2,5 milimolares en tampón de bicarbonato Krebs ringer con la otra.
Después de preincubar los cocultivos durante una hora, cambie el tampón KRB de baja glucosa por 250 microlitros de glucosa de 2,5 milimolares o 20 milimolares. Después de otra hora de incubación, transfiera el tampón KRB a tubos de micro fuga y gire el tampón durante cinco minutos a 1500 G y cuatro grados Celsius mientras los tubos están en la centrífuga. Agregue inmediatamente 100 microlitros de tampón de lisis celular rippa con inhibidores de la proteasa a la placa e incube la placa durante 20 minutos a cuatro grados centígrados.
Cuando los tubos hayan terminado de girar, retire 200 microlitros del sobrenadante para su posterior análisis mediante radioinmunoensayo de insulina o Eliza. Finalmente, centrifugar lo que ahora es lisado celular durante 15 minutos a 10.000 g y luego extraer 50 microlitros del SNAT para su análisis mediante radioinmunoensayo de insulina o Eliza. Aquí, se muestran los resultados obtenidos del cocultivo de células beta INS one con células HC 2 93 transfectadas para expresar una isoforma de neuro liggen denominada NLX.
La expresión de NLX aumentó la secreción basal y estimuló la secreción de insulina por células I NS cocultivadas con una. El dominio extracelular NX debe estar interactuando con otra proteína o molécula en la superficie de una célula para hacer que las células INS uno secreten más insulina. Los resultados de otros tipos de análisis utilizando el sistema de cocultivo se muestran en los dos gráficos siguientes.
En este primer gráfico se muestra el aumento del contenido de insulina de las células INS one cocultivadas por NLY. Mientras que en este experimento, el ARN se recolectó de la capa celular y se analizó mediante R-T-Q-P-C-R. El cocultivo con NLY aumentó los niveles de insulina y PDX uno.
Después de este procedimiento, se pueden realizar métodos adicionales como la QPCR o la inmunohistoquímica cuantitativa para responder a preguntas adicionales como si las interacciones extracelulares de la proteína transfectada pueden causar cambios en la estructura celular o en la expresión génica.
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Descripción general
Este estudio investiga el papel de las interacciones proteicas transcelulares en la función de las células beta pancreáticas, centrándose especialmente en la secreción de insulina. El método consiste en cultivar conjuntamente células HEK293 transfectadas con células beta para evaluar la influencia de proteínas transmembrana específicas.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Biología celular
- Endocrinología
Antecedentes
- Las interacciones transcelulares son cruciales para la funcionalidad de las células beta.
- La secreción de insulina es un proceso clave influenciado por estas interacciones.
- Los métodos existentes pueden alterar la salud de las células beta, complicando los análisis.
- Este estudio tiene como objetivo proporcionar un enfoque más refinado.
Objetivo del estudio
- Investigar cómo ciertas proteínas transmembrana afectan la secreción de insulina.
- Utilizar un modelo de cultivo celular conjunto para minimizar la perturbación directa de las células beta.
- Evaluar el impacto de las concentraciones de glucosa en la liberación de insulina.
Métodos Utilizados
- Transfectar células HEK293 con plásmidos que contienen proteínas de interés.
- Cocultivar células HEK293 transfectadas con células beta.
- Incubar las cocultivos en medios con concentraciones variables de glucosa.
- Utilizar radioinmunoensayos de insulina o ELISA para medir la secreción de insulina.
Resultados principales
- Demostró la influencia de proteínas transmembrana específicas en la secreción de insulina.
- Mostró que la concentración de glucosa afecta la liberación de insulina en células co-cultivadas.
- Validó la eficacia del método en comparación con técnicas de perturbación tradicionales.
- Proporcionó información sobre los mecanismos de la función de las células beta.
Conclusiones
- El método de cultivo conjunto permite el estudio de las interacciones proteicas sin alterar la salud de las células beta.
- Los conocimientos obtenidos pueden orientar futuras investigaciones sobre la diabetes y la función de las células beta.
- Este enfoque podría conducir a una mejor comprensión de los mecanismos de secreción de insulina.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Comprender las interacciones proteicas transcelulares es fundamental para reducir los riesgos en la validación de dianas en células beta durante el descubrimiento de fármacos para la diabetes. Este método de co-cultivo permite la interrogación mecanicista de los efectos de las proteínas extracelulares sobre la secreción de insulina sin alterar la salud de las células beta, lo que refuerza la confianza predictiva en la selección de dianas. Aborda un desafío clave en la fase de descubrimiento: distinguir la señalización transcelular real de los factores de confusión intracelulares en el análisis de vías.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la evaluación funcional de las interacciones de proteínas transmembrana en la secreción de insulina, manteniendo la integridad de las células beta.
- Valor operativo: Evita los artefactos derivados del silenciamiento o sobreexpresión de ARNm/proteínas que dificultan los estudios de validación de dianas.
- Valor estratégico: Facilita la selección basada en hipótesis de interactores extracelulares para reducir los riesgos en las vías de señalización de las células beta.
Desarrollo de ensayos y cribado
- Valor científico: Genera mediciones cuantitativas de la secreción de insulina bajo estimulación controlada de glucosa para la estandarización de ensayos.
- Valor operativo: Utiliza células HEK293 como una plataforma ajustable para la presentación de proteínas extracelulares en ensayos de co-cultivo reproducibles.
- Valor estratégico: Permite la evaluación escalable de proteínas candidatas que influyen en la función de las células beta en un formato fisiológicamente relevante.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Valor científico: Relaciona las interacciones proteicas extracelulares con la maduración funcional de las células beta y la liberación de insulina dependiente de la glucosa.
- Valor operativo: Compatible con células beta disociadas primarias y líneas de células beta para validación cruzada entre modelos.
- Valor estratégico: Proporciona un sistema relevante para enfermedades que permite priorizar dianas con potencial de alineación con biomarcadores traslacionales.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
El método se integra en el continuo de descubrimiento desde la interacción con el blanco hasta la validación funcional, apoyando específicamente la identificación de compuestos activos mediante la reducción del riesgo mecanicista de las vías de las células beta.
- Biología del Descubrimiento: Evalúa cómo dominios extracelulares específicos de proteínas transmembrana modulan la secreción de insulina en células beta dentro de un sistema de co-cultivo controlado.
- Selección: Permite la evaluación estandarizada y reproducible de la secreción de insulina en distintas condiciones de glucosa mediante radioinmunoensayo o ELISA.
- Análisis: Proporciona mediciones cuantitativas de variables dependientes (niveles de insulina) que permiten comparar los efectos de las interacciones proteicas bajo condiciones experimentales definidas.
- Investigación Traducional: Conecta los fenotipos de interacción extracelular con cambios en el contenido de insulina y en la expresión génica (por ejemplo, insulina, ARNm de PDX1) para garantizar continuidad preclínica.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma de co-cultivo reutilizable para investigar múltiples proteínas transmembrana sin necesidad de reformular los procedimientos básicos de manejo de células beta.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Reduce la ambigüedad mecanicista en la señalización de células beta al aislar los efectos transcelulares de las perturbaciones intracelulares.
- Valor operativo: Estandariza el procedimiento de cultivo conjunto con pasos definidos de transfección, incubación y ensayo de secreción para lograr consistencia entre diferentes equipos.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance o interrupción en la validación de dianas al proporcionar datos funcionales de secreción de insulina sin interferencias por artefactos relacionados con la salud de las células beta.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de dianas basada en efectos validados sobre la secreción de insulina estimulada por glucosa.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en la transfección de células de mamífero, técnicas de cultivo conjunto y ensayos de secreción de insulina estimulada por glucosa.
- Depende de controles de eficiencia de transfección y de la formación adecuada de la capa de células HEK293 para una presentación consistente de proteínas.
- Necesita la estandarización de los protocolos de estimulación con glucosa y de los métodos de cuantificación de insulina (radioinmunoensayo o ELISA) entre experimentos.
- Implica consideraciones de adaptación al extenderse a células beta primarias o líneas alternativas de células beta distintas de INS-1.
- Limitado al análisis de interacciones proteicas extracelulares; no puede explorar directamente dominios de señalización intracelular sin métodos complementarios.
