Name: Aislamiento de células endoteliales progenitoras de la sangre de cordón Umbilical humano (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 26 s
Description: Aprende a aislar células endoteliales progenitoras de sangre de cordón umbilical humana mediante medios especializados sin clasificación por aminoácidos. Este método permite obtener células autólogas para ingeniería tisular vascular y biomarcadores cardiovasculares.

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Este material está basado en trabajo apoyado por la National Science Foundation bajo la subvención no. CMMI-1452943 y por el Colegio de honores de la Universidad de Arkansas. También quisiéramos reconocer el Banco de sangre de cordón de Arkansas por facilitarnos con unidades de sangre de cordón.

esta investigación se llevó a cabo con la aprobación de la Universidad de Arkansas Junta de revisión institucional (número 16-04-722). Unidades de sangre de cordón umbilical fueron recolectadas en solución citrato fosfato dextrosa (CPD) en el Banco de sangre de cordón de Arkansas, y unidades que no cumplían con el requisito de almacenamiento fueron donadas para la investigación. Unidades de sangre de cordón fueron por servicio Courier al laboratorio dentro de 24 h de colección en las temperaturas ambiente.
 1. aislamiento de células endoteliales progenitoras de la sangre del cordón <ol><li>preparación de los reactivos.
	<ol><li>EGM preparar añadiendo medio basal endotelial (EBM) al 10% de suero bovino fetal (FBS) suplementado con 20 ng/mL de insulina-like growth factor (IGF), 1 μg/mL de ácido ascórbico, 5 ng/mL recombinante humana factor de crecimiento (rhEGF), 22,5 μg/mL heparina y 0,5 ng/mL factor crecimiento endotelial vascular (VEGF), junto con 10 ng/mL de factor de crecimiento fibroblasto humano recombinante B (rhFGF-B), hidrocortisona μg/mL 0,2 y 2% penicilina-estreptomicina-glutamina. Esterilizar el medio de cultivo utilizando un filtro de vacío de membrana de polyethersulfone (PES) de 0.2 μm.</li>
		<li>Preparar rata I cola solución de colágeno en una concentración de 50 μg/mL 0.02 N acético ácido. Esterilizar esta solución con un filtro de jeringa de 0,2 μm.</li>
		<li>La capa bien 6 placas con 2 mL de preparado rata I cola solución colágeno para cada pozo. Colocarlos en una incubadora mantenida en 5% CO 2 y 37 ° C durante al menos 1 h antes de sembrar.</li>
		<li>Diluir aproximadamente 25 mL de sangre del cordón umbilical con Hanks equilibrada solución de sal (HBSS) a una concentración de 1:1.</li>
		<li>Ensayo de preparar radio-inmuno precipitación (RIPA) el tampón utilizando cloruro de sodio de 150 mM, 1% Tritón X-100, desoxicolato de sodio 0,5%, glicerofosfato-β de 1 mM, 0.1% SDS y 50 mM Tris (pH 8.0).</li>
	</ol></li> <li>Aislamiento de células endoteliales progenitoras.
	<ol><li>Caliente todo preparado reactivos en un baño de agua mantenida a 37 ° C antes de la aislamiento.</li>
		<li>Añadir 20 mL de reactivo medio gradiente de densidad a un tubo de centrífuga de 50 mL.</li>
		<li>Capa cuidadosamente 20 mL de sangre diluida en el tubo de centrífuga que contiene medio de gradiente de densidad sin romper esta capa con el objetivo de la pipeta hacia la pared lateral del tubo de.</li>
		<li>Separar los componentes de la sangre que se basa en sus densidades ( figura 1) por centrifugación a 800 x g durante 30 min a temperatura ambiente, con los frenos del rotor de la centrifugadora de. No molestar las capas diferentes.</li>
		<li>Quitar la capa de plasma por cuidadosamente pipeteo del tubo sin molestar a otra célula de la capa capas hasta que la punta es capaz de llegar a la multinacional (ver figura 1). Descartar el plasma quitado. 
		Nota: Al usar puntas de pipeta para remover el plasma, dejar una pequeña capa de plasma por encima de la capa MNC ( figura 1) para reducir disturbios.</li>
		<li>Recoger la capa anteada que contiene el MNCs utilizando una jeringa equipada a una aguja de calibre 18 y transferirlo a un tubo de centrífuga fresco.</li>
		<li>Añadir un volumen igual de EBM a recogidos MNCs. Centrifugar estos tubos a 500 x g por 10 min a 4 ° C. descarte el sobrenadante. 
		Nota: El precipitado de células aparecerán en rojo debido a la presencia de glóbulos rojos/eritrocitos.</li>
		<li>Añadir 5 mL de solución de cloruro de amonio para lisar los glóbulos rojos. Incubar este tubo en hielo durante 5-10 min., con ocasional agitación. 
		Nota: Debe tener precaución durante este paso para no exceder la duración del tiempo, como puede ser perjudicial para las empresas multinacionales.</li>
		<li>Centrifugar los tubos a 500 x g por 10 min a 4 ° C y descarte el sobrenadante. Si los eritrocitos persisten, repita los pasos 1.2.8 y 1.2.9 hasta que no hay color rojo se observa en el sedimento.</li>
		<li>Resuspender el precipitado en EGM preparado y utilizar el hemocitómetro para contar las MNCs.</li>
		<li>Aspirada la rata cola placa de 6 pozos recubiertas de colágeno (de paso 1.1.3) y lavar los pocillos 3 veces con 1 x solución salina tamponada con fosfato (PBS).</li>
		<li>De semilla de la pelotilla MNC resuspendió en EGM a la placa de colágeno en una concentración de 1 x 10 7 multinacionales en cada pozo. Colocar en el 37 ° C, 5% CO 2 incubadora.</li>
		<li>Después de 24 h, el medio de aspirar y lavar los pozos una vez con EGM. Añadir 3 mL de medio EGM a cada pocillo y colocar en los 37 ° C, 5% CO 2 incubadora.</li>
		<li>Reponer la placa con medio EGM fresco cada día por 7 días. Después de 7 días, cambiar el medio EGM día.</li>
		<li>Utilizando un microscopio de campo brillante, tomar imágenes de la placa de la pozo 6 todos los días para seguir la progresión de las colonias de células endoteliales. Marcar la placa donde las colonias se presentan para hacer un seguimiento de su crecimiento. 
		Nota: Toma generalmente entre 5 y 9 días para las colonias que aparecen en la cultura.</li>
	</ol></li> <li>Expansión de las células progenitoras endoteliales.
	<ol><li>Capa el frasco de cultura T-25 con rata cola colágeno (50 μg/mL) y colóquelo en el 37 ° C, 5% CO 2 incubadora durante al menos 60 min aspirar y lavar el matraz de cultivo celular T-25 tres veces con PBS 1 x antes de la siembra de las células.</li>
		<li>Trypsinize las colonias de células endoteliales cuando llegan a unos 3 mm de tamaño con 150 μL de solución de tripsina-EDTA 0,05% en cada pozo. Coloque la placa de 6 pozos en el 37 ° C, 5% CO 2 incubadora 2-3 min</li>
		<li>Golpee suavemente la placa de 6 pozos para desalojar las células adjuntas. Inmediatamente Añada 2 mL de EGM y recuperar las células en un tubo de centrífuga de 15 mL.</li>
		<li>Contar las células usando un hemocitómetro y calcular la densidad de siembra inicial.</li>
		Tubos de <li>girar la centrífuga de 15 mL a 400 x g por 5 min Resuspender el precipitado de células en el EGM y el matraz T-25 ~ 500.000 células de semilla. Marque este matraz como paso 1 y volver a colocar el frasco T-25 en los 37 ° C, 5% CO 2 incubadora. 
		Nota: Las células se pueden platear en EBM y DMEM al comparar el crecimiento con EGM.</li>
		<li>De otros pasajes, cuando el frasco alcanza el 90% de confluencia, siga pasos 1.3.1 - 1.3.5 y contaminar las células en 10 4 células/cm 2 en frascos de cultivo celular T-75 o T-175. Proceder a la caracterización de las células aisladas (pasos 2 y 3).</li>
	</ol></li></ol> 2. Caracterización de aislados células usando Western Blotting <ol><li>Agregar 50-100 μl de lysis buffer en cada paso cuando siguiendo los pasos de expansión para caracterizar las células aisladas. Recoger las proteínas de la aproximadamente 500.000 o más células.</li>
	<li>Pipetear arriba y abajo con fuerza para romper las células y liberar las proteínas. Recoger y trasladar el buffer a un tubo de microcentrífuga.</li>
	<li>Girar el tubo de microcentrífuga a 500 x g y transferir cuidadosamente el sobrenadante a un tubo nuevo de microcentrífuga. Etiquetar y almacenar los tubos a-80 ° C para almacenamiento a largo plazo.</li>
	<li>Cuantificar la cantidad de proteínas en cada tubo, utilizando ya sea Bradford &#39; s o BCA ensayo 27 , 28 , 29.</li>
	<li>Realizar Western Blot utilizando procedimientos estándar 27 , 28 , 29. Analizar 5 μg de la proteína total de la expresión de CD31, CD34, VEGFR2 y α-SMA. Uso de α-tubulina para normalizar los datos.</li>
</ol> 3. Inmunofluorescencia indirecta <ol><li>someter a ultrasonidos cubreobjetos vidrio 18 mm en etanol al 50% y secar. Deja el cubreobjetos limpios en una placa de 12 pozos durante la noche en la campana de bioseguridad con un UV luz a esterilizarlas.</li>
	<li>Cubrir el cubreobjetos con 50 & #181; g/mL de rata cola colágeno y transferir la placa a 37 ° C, 5% CO 2 incubadora durante al menos 60 min</li>
	<li>Aspire el colágeno y añadir 1 mL de PBS 1 x a la placa de 12 pozos para lavar los cubreobjetos. Aspire el PBS 1 x y repetir dos veces.</li>
	<li>250.000 semillas cultivadas EPCs en cada pozo y lugar nuevamente en el 37 ° C, 5% CO 2 incubadora durante al menos 3 días antes de realizar el immunostaining.</li>
	<li>Lavar la placa 3 veces con PBS 1 x. Añadir 1 mL de metanol helada en cada pocillo e incubar a temperatura ambiente durante 15 minutos reparar las células.</li>
	<li>Realizar immunostaining usando un protocolo estándar 27 , 28 , 29. Uso de los anticuerpos en sus diluciones apropiadas (por ejemplo, CD31 (1:20), CD34 (1:50), α-SMA (1: 100) y VEGFR2 (1:50)).</li>
	<li>Tomar imágenes de los cubreobjetos immunostained con un microscopio de epifluorescencia.</li>
</ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Como se mencionó anteriormente, adherente EPCs poseen una morfología de adoquines. Nuestras multinacionales aisladas progresaban de una colonia de células fusiformes (figura 2A-2D) en las primeras etapas a una colonia de adoquines (figura 2E-2F) durante un período de diez días en la cultura. EPC ha sido etiquetados como diferentemente por diferentes grupos de investigación, es decir, como10finales de la d...

Varios investigadores han estudiado las características y el potencial de humano EPCs5,10,11,12,13. EPCs pueden describirse como la circulación de las células que tienen la capacidad de adherirse al tejido endotelial en sitios de hipoxia, isquemia, lesiones o la formación del tumor y contribuir a la formación de nuevas estructuras vasculares4,14. Su participación observado en neovascularización, en forma de vasculogénesis posnatal, ha conducido a una comprensión de la patofisiología de estas células y su uso en aplicaciones terapéuticas4,15, 16. el número de EPC en un individuo se ha demostrado para ser correlacionado con patología cardiovascular9,15,16,17,18,19 ,20. Otros estudios han también diferenciado EPCs en un fenotipo de fibroblasto-como de la válvula y que estas células podrían utilizarse para ingeniería de tejidos corazón válvulas7,21.
Las moléculas de superficie celular particular necesarias aislar a EPCs no han sido claramente identificadas debido a las discrepancias entre las investigaciones4. La adhesión de las empresas multinacionales a una matriz, con la exposición a una variedad de condiciones de cultivo, se ha realizado por varios grupos1,17,22,23, sugiriendo que EPCs putativos puede Mostrar diferentes propiedades fenotípicas. Estas propiedades incluyen la falta de capacidad phagocytotic, formación del tubo en Matrigel y la captación de lipoproteínas de baja densidad Dil-acetilado. El potencial proliferativo y clonogenic alta son dos propiedades con que EPC puede ser jerarquizada5. EPCs pueden también formar en vitro de túbulos cuando morfología de fibroblastos de pulmón fetal humano4. Se conocen estas células expresan marcadores de superficie celular endotelial y compartir algunos de los marcadores hematopoyéticos13,24,25. Los marcadores expresados positivamente que son ampliamente aceptados para EPCs phenotyping son CD31, CD34, receptor del factor de crecimiento endotelial vascular 2 (VEGFR2), von Willebrand Factor (FvW), CD133, c-Kit y vascular endotelial cadherina (VE-cadherina)4 , 18. las células que expresan Co CD90, CD45, CD14, CD115 o actinia alfa-lisa del músculo (α-SMA) no se consideran ser EPC debido a su limitada proliferativa potencial, capacidad de fagocitar bacterias e incapacidad para formar de nuevo humano vasos en vivo4,7. Este artículo describe un protocolo modificado para el aislamiento de las células endoteliales progenitoras de la sangre de cordón umbilical humano sin necesidad de cualquier célula clasificación de protocolos. Para este artículo, utilizamos CD31, CD34 y VEGFR2 como los marcadores positivos, con α-SMA como el indicador negativo.
En este artículo, proponemos un método de aislamiento y cultivo de células endoteliales progenitoras de sangre del cordón umbilical sin clasificar usando la célula especializada medio crecimiento endotelial suplementado con factores de crecimiento (EGM). Este EGM contiene factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) y factor de crecimiento fibroblástico (FGF), que mejoran la supervivencia, proliferación y migración de células endoteliales26. También incluye el ácido ascórbico, que es responsable de mantener la morfología de adoquines de células; insulina-como factor de crecimiento-1 (IGF-1), que proporciona angiogénicos y función migratoria; y heparina, la cual causa mayor estabilidad a largo plazo de factores de crecimiento en el medio26. Otros factores de crecimiento añadidos al medio de cultivo de células endoteliales incluye la suplementación con factor de crecimiento epidérmico (EGF), que ayuda a estimular la proliferación celular y la diferenciación y la hidrocortisona, que sensibiliza las células al EGF26 . Nos muestran que el uso de este medio de crecimiento produce un número mayor de EPCs en comparación con medio basal endotelial (EBM) o modificado Eagle Medium (DMEM de Dulbecco).

<table><tbody><tr><td><fuerte>A) Para aislamiento y cultivo</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EGM-2 BulletKit</td><td>Lonza</td><td>CC-3162</td><td>Este producto viene con todos los factores de crecimiento necesarios para hacer el Medio de Crecimiento Endotelial Suero</td></tr><tr><td>Bovino Fetal</td><td>Thermofisher Scientific 26140079</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pencillin-Estreptomicina-Glutamina (100x)</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>10378016</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque</td><td>GE Heatlhcare</td><td>17-1440-02</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina equilibrada de Hank</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>14170-112</td><td></td></tr><tr><td>Tecnologías de células madre</td><td>de cloruro de amonio</td><td>7850</td><td></td></tr><tr><td>1x tampón de fosfato solución salina</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>14190250</td><td></td></tr><tr><td>Cola de rata I Colágeno</td><td>Corning</td><td>354236</td><td></td></tr><tr><td>Ácido Acético Glacial</td><td>Amresco</td><td>0714-500ML</td><td></td></tr><tr><td>0.05% Tripsina-EDTA</td><td>Thermofisher Scientific 25300054</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tampón HEPES</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>Medio de águila modificado de Dulbecco</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>10566-016</td><td></td></tr><tr><td><fuerte>B) Anticuerpos y lisados celulares</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD31&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab28364</td><td>dilución 1:250&nbsp; para Western blot</td></tr><tr><td>CD34</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-7045</td><td>1:100 dilución para Western blot</td></tr><tr><td>&alpha;-SMA</td><td>abcam</td><td>ab5694</td><td>dilución 1:100 para Western blot</td></tr><tr><td>&alpha;-tubulina</td><td></td><td>abcam ab7291</td><td>dilución 1:2.500 para Western blot</td></tr><tr><td>VEGFR2</td><td>abcam</td><td>sc504</td><td>dilución 1:100 para Western blot</td></tr><tr><td>Lisado de células endoteliales de vena umbilical humana</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc24709&nbsp;</td><td></td></tr><tr>Lisado <td></td><td></td> de <td>células intersticiales valvular</td><td>Línea celular primaria cultivada en laboratorio propio y lisada con tampón RIPA</td></tr><tr><td><fuerte>C) Western blot e inmunotinción</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10x Tampón Tris/Glicina/SDS</td><td>Biorad</td><td>161-0772</td><td>Utilizado como tampón de ejecución</td></tr><tr><td>10x Tampón Tris/Glycine</td><td>Biorad</td><td>161-0771</td><td>Utilizado como tampón de transferencia</td></tr><tr><td>Membrana de transferencia Immobilon-FL</td><td>Merck Millipore</td><td>IPFL0010</td><td>Se trata de una membrana de transferencia de PVDF que tiene 45 &micro; m tamaño de poro y se menciona en el protocolo como membrana de Western blot</td></tr><tr><td>4x Tampón de muestra Laemmli</td><td>Biorad</td><td>161-0747</td><td></td></tr><tr><td>2-mercaptoetanol</td><td>Biorad</td><td>161-0710</td><td></td></tr><tr><td>10% Criterion TGX gel prefabricado</td><td>Biorad 5671033</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Prolong Gold antidecoloración</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>P36930</td><td>Se utiliza para el montaje de cubreobjetos inmunoteñidos para el almacenamiento a largo plazo</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>VWR Analítico</td><td>BDH1135-4LP</td><td></td></tr></tbody></table>

aislamiento de células endoteliales progenitoras de la sangre de cordón umbilical humano

Isolation of Endothelial Progenitor Cells from Human Umbilical Cord Blood

La existencia de células progenitoras endoteliales (EPCs) en sangre periférica y su implicación en la vasculogénesis primero fue divulgado por Ashara y colegas1. Más tarde, otros documentaron la existencia de tipos similares de EPCs procedentes de médula ósea2,3. Más recientemente, Yoder y Ingram demostró que EPCs derivan de la sangre del cordón umbilical tenían un potencial proliferativo más alto en comparación con los aislados de adulto periférico sangre4,5,6. Aparte de estar involucrado en la vasculogénesis posnatal, EPCs también han demostrado promesa como fuente de células para crear ingeniería de tejido vascular y del corazón la válvula construcciones7,8. Existen varios protocolos de aislamiento, algunas de las cuales implican la clasificación de la célula de células mononucleares (MNCs) derivadas de las fuentes mencionadas anteriormente con la ayuda de marcadores endoteliales y hematopoyéticas, o cultivo de estas multinacionales especializados crecimiento endotelial medio, o una combinación de estas técnicas9. Aquí, presentamos un protocolo para el aislamiento y cultura de EPCs usando especializado endotelial suplementado con factores de crecimiento, sin el uso de immunosorting, seguido de la caracterización de las células aisladas mediante Western Blot y immunostaining.

Aislamiento y expansión de las células progenitoras endoteliales: Se proporciona un esquema (figura 1) que representa el protocolo general. Las capas de componentes diferentes de la sangre fueron observadas después de la centrifugación de gradiente de densidad de la sangre de cordón umbilical humano con medio de gradiente de densidad. Sobre siembra multinacionales sobre las placas tratadas con colágeno, el fruto de las colonias primero fue...

El objetivo de este protocolo es aislar las células progenitoras endoteliales de cordón umbilical. Algunas de las aplicaciones incluyen el uso de estas células como un biomarcador para identificar pacientes con riesgo cardiovascular, tratamiento de enfermedades isquémicas, y construye creando ingeniería de tejido vascular y del corazón la válvula.

Aislamiento de células endoteliales progenitoras de la sangre de cordón Umbilical humano

The existence of endothelial progenitor cells (EPCs) in peripheral blood and its involvement in vasculogenesis was first reported by Ashara and ...

El objetivo general de este procedimiento es aislar células progenitoras endoteliales a partir de sangre de cordón umbilical humano. Este método describe el aislamiento de células progenitoras endoteliales de sangre de cordón para su posible uso como células autólogas en la ingeniería de tejidos de injertos vasculares. La principal ventaja de esta técnica es que el procedimiento de aislamiento puede realizarse en medios especializados sin necesidad de ningún tipo de clasificación por anticuerpos.Las células progenitoras endoteliales aisladas pueden utilizarse para estudiar la neovascularización, y algunos informes también han sugerido que estas células pueden emplearse como biomarcadores para identificar pacientes con riesgo de enfermedades cardiovasculares. Antes de comenzar el procedimiento de aislamiento, recubra placas de seis pocillos con dos mililitros de solución recién preparada de colágeno tipo I de cola de rata por pocillo. Incube la placa en un incubador a 37 grados Celsius y 5% CO2 durante al menos una hora.Luego, diluya aproximadamente 25 mililitros de sangre de cordón con HBSS en una concentración uno a uno. A continuación, agregue 20 mililitros de reactivo de medio de gradiente de densidad a un tubo cónico de 50 mililitros, y vierta cuidadosamente 20 mililitros de sangre de cordón diluida por la pared del tubo para formar una capa de sangre sobre el medio. Separe las células mediante centrifugación, seguido de la eliminación cuidadosa de la capa de plasma.Utilizando una jeringa equipada con una aguja de 18 gauge, recolecte la capa lechosa que contiene las células mononucleares en un nuevo tubo de 50 mililitros. Añada un volumen igual de medio basal endotelial a las células. Lave las células mediante centrifugación y lise las células rojas en el sedimento resultante con cinco mililitros de solución de cloruro de amonio en hielo.Después de cinco a 10 minutos con agitación ocasional, recopile las células por centrifugación y resuspenda el sedimento blanco en medio de crecimiento endotelial fresco. Después de contarlas, aspire el colágeno de cada pocillo de la placa de seis pocillos y lave los pocillos tres veces con PBS. Siembre las células mononucleares a una concentración de un por diez a la séptima células por dos mililitros de medio por pocillo.Y devuelva la placa al incubador durante 24 horas. Al día siguiente, enjuague las células una vez con medio fresco de crecimiento endotelial. Luego, reemplace el lavado con tres mililitros de medio fresco de crecimiento endotelial y devuelva las células al incubador de cultivo celular.Utilizando un microscopio de campo brillante, obtenga imágenes diarias de las células para monitorear la progresión de las colonias de células endoteliales, marcando las placas donde surgen las colonias para seguir su crecimiento. Cuando las colonias de células endoteliales alcancen aproximadamente tres milímetros de tamaño, recubra un frasco de cultivo T25 con colágeno fresco de cola de rata tipo I durante al menos una hora en el incubador de cultivo celular. Luego, recolecte las células con 150 microlitros de tripsina-EDTA al 0,05 % por pocillo en el incubador de cultivo celular durante dos a tres minutos.Golpee suavemente la placa para desprender las células adheridas. Cuando las células comiencen a despegarse, agregue inmediatamente dos mililitros de medio de crecimiento endotelial fresco y reúna las células en un solo tubo cónico de 15 mililitros. Recupere las células por centrifugación y resuspenda el precipitado en medio de crecimiento endotelial fresco.Después de contar, siembre las células en el matraz recubierto con colágeno a una densidad de cinco veces 10 a la quinta células en tres mililitros de medio por matraz, y marque el matraz como paso uno. A continuación, devuelva el matraz al incubador, resembrando las células cada vez que la colonia alcance una confluencia del 90 %. Después de sembrar en las placas tratadas con colágeno, generalmente se observa el primer crecimiento de la colonia entre los días cinco y nueve.Las colonias continúan creciendo y adquieren una morfología celular en forma de huso en las primeras etapas del cultivo, que posteriormente progresa hacia una morfología similar a adoquines. El número total de células recolectadas en cada paso aumenta en correlación directa con el número total de días en cultivo. El análisis por inmunotransferencia revela una expresión temprana de CD31 y CD34 por parte de las células endoteliales cultivadas, la cual parece disminuir con los pasajes subsiguientes.La expresión del receptor del factor de crecimiento endotelial vascular dos, sin embargo, se mantiene con el tiempo, aunque a un nivel ligeramente más bajo que el observado tras el primer pase. Cabe destacar que las células progenitoras endoteliales no son positivas para el marcador de células mesenquimales alfa actina de músculo liso, a diferencia, por ejemplo, de los lisados de células intersticiales valvulares, que pueden incluirse como control positivo. Todo el procedimiento de aislamiento puede completarse en menos de cinco horas, dependiendo de la unidad de sangre de cordón obtenida.Después de aislar y sembrar las células mononucleares en medio de crecimiento endotelial, generalmente transcurren entre cinco y nueve días para que aparezcan las colonias de CEP en el cultivo. El método propuesto de aislamiento utiliza medios especializados para el cultivo de células progenitoras endoteliales y evita el uso de un citómetro de flujo, en lo que respecta al requisito de tener marcadores endoteliales. Este método también proporciona un protocolo eficiente para obtener grandes cantidades de células progenitoras endoteliales en un corto período de tiempo.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aislar células progenitoras endoteliales a partir de unidades de sangre de cordón umbilical humano. No olvide que la sangre de cordón umbilical humano puede ser peligrosa, y se debe seguir la eliminación adecuada de la sangre desechada y los productos de cultivo celular.

isolation-endothelial-progenitor-cells-from-human-umbilical-cord

Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

Este protocolo de vídeo ilustra el aislamiento y cultivo de las células endoteliales de vena umbilical (HUVEC) de cordón umbilical humano. Una vez aisladas estas células se pueden utilizar en los ensayos de la angiogénesis in vitro, como el gel de fibrina Optimizado ensayo de bolas también se demuestra por el laboratorio de Hughes.

El aislamiento de las células endoteliales de vena umbilical (HUVEC)

Este protocolo describe el aislamiento y la posterior expansión de células mesenquimales del estroma y las células endoteliales que forman colonias sin el uso de suero animal para generar pares con fines de trasplante autólogo experimental.

Aislamiento y suero animal expansión libre de cordón umbilical humano derivado de células mesenquimales del estroma (MSC) y endoteliales formadoras de colonias Células Progenitoras (ECFCs)

Las células endoteliales formadoras de colonias (ECFCs) son las células endoteliales circulantes con un robusto potencial de proliferación clonal que deben mostrarse...

Caracterización fenotípica y funcional de las células endoteliales Formadoras de Colonias derivados de la sangre del cordón umbilical

Este primer artículo se describe un procedimiento para aislar las células endoteliales humanas de las venas umbilicales y, a continuación se muestra cómo utilizar estas células para examinar la transmigración de neutrófilos bajo condiciones de flujo. Mediante el uso de una cámara de flujo de bajo volumen hecha de un polímero con las características ópticas de vidrio, en vivo de células de imagen fluorescente de poblaciones celulares raras también es posible.

Aislamiento de células endoteliales de vena umbilical y su uso en el Estudio de la transmigración de neutrófilos bajo condiciones de flujo

Aquí se describe un protocolo para aislar los subconjuntos de precursor de células B de sangre del cordón umbilical. Una cantidad suficiente y calidad de los ácidos nucleicos se pueden extraer de las células y utilizarse en ensayos subsiguientes utilizando ADN o ARN.

Aislamiento de los precursores de células B subconjuntos de Sangre del Cordón Umbilical

Se desarrolló un método para derivar directamente las células madre neurales humanas a partir de células progenitoras hematopoyéticas enriquecidas a partir de células de sangre periférica.

La inducción directa de las células madre neurales humanas a partir de células de sangre periférica progenitoras hematopoyéticas

Este protocolo permite la generación y caracterización fiables de células endoteliales de crecimiento sanguíneo (BOECs) a partir de un pequeño volumen de sangre periférica adulta. Las BOEC se pueden utilizar como sustituto de las células endoteliales de pacientes con trastornos vasculares y como sustrato para la generación de células madre pluripotentes inducidas.

Generación y Cultura de Sangre Consecuencia endoteliales Las células de la sangre periférica humana

células madre y progenitoras hematopoyéticas (HSPC) se derivan de las células endoteliales especializadas (hemogenic) durante el desarrollo, sin embargo, se sabe poco sobre el proceso por el cual algunas células endoteliales especifican a convertirse en la formación de la sangre. Demostramos un método basado en citometría de flujo permite el aislamiento simultáneo de las células endoteliales y hemogenic HSPC de tejidos embrionarios murinos.

Aislamiento de las células murinas embrionarias Hemogenic endoteliales

células progenitoras endoteliales (CPE) participan de manera crucial en la neovascularización de los tejidos isquémicos. Este método describe el aislamiento de EPCs humanos de sangre periférica, así como la identificación de su potencial migratorio contra muestras de suero de pacientes de cirugía cardíaca.

Aislamiento de células progenitoras endoteliales de voluntarios sanos y su potencial migratorio influenciado por las muestras de suero después de cirugía cardiaca

Aquí, describimos la ex vivo expansión de células madre hematopoyéticas de CD34+ en células de sangre de cordón umbilical trataron con una combinación de un cytokine cóctel y VPA. Este método conduce a un grado significativo de ex vivo expansión de HSCs primitivo ya sea clínica o aplicaciones de laboratorio.

Ex Vivo expansión de células madre hematopoyéticas de cordón Umbilical humano derivadas de sangre CD34+ las células usando el ácido valproico

Aquí, presentamos un protocolo para la caracterización inmunophenotípica y la diferenciación inducida por citoquinas de la sangre de cordón umbilical derivada CD34+ células madre hematopoyéticas y células progenitoras a los cuatro linajes mieloides. Las aplicaciones de este protocolo incluyen investigaciones sobre el efecto de mutaciones de la enfermedad mieloide o moléculas pequeñas en la diferenciación mieloide de las células CD34+.

Diferenciación panmieloide de la sangre de cordón humano derivada CD34+ Células hematopoyéticas del tallo y progenitor

Aprende a aislar células endoteliales progenitoras de sangre de cordón umbilical humana mediante medios especializados sin clasificación por aminoácidos. Este método permite obtener células autólogas para ingeniería tisular vascular y biomarcadores cardiovasculares.

Aislamiento de células endoteliales progenitoras de la sangre de cordón Umbilical humano

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