Aislamiento de células endoteliales progenitoras de la sangre de cordón Umbilical humano

El objetivo de este protocolo es aislar las células progenitoras endoteliales de cordón umbilical. Algunas de las aplicaciones incluyen el uso de estas células como un biomarcador para identificar pacientes con riesgo cardiovascular, tratamiento de enfermedades isquémicas, y construye creando ingeniería de tejido vascular y del corazón la válvula.

El objetivo general de este procedimiento es aislar las células progenitoras endoteliales de la sangre del cordón umbilical humano. Este método describe el aislamiento de células progenitoras endoteliales de la sangre del cordón umbilical para su uso potencial como células autólogas para la ingeniería tisular de injertos vasculares. La principal ventaja de esta técnica es que el procedimiento de aislamiento se puede realizar en medios especializados sin necesidad de ninguna clasificación de aminoácidos.

Las células progenitoras endoteliales aisladas se pueden utilizar para estudiar la neovascularización, y los informes también han sugerido que estas células se pueden utilizar como biomarcadores para identificar pacientes con riesgo de enfermedades cardiovasculares. Antes de comenzar el procedimiento de aislamiento, recubra previamente seis placas de pocillos con dos mililitros de cola de rata recién preparada, una solución de colágeno por pocillo. Equilibre la placa en una incubadora a 37 grados centígrados y 5% de CO2 durante al menos una hora.

A continuación, diluya aproximadamente 25 mililitros de sangre de cordón umbilical con HBSS en una concentración de uno a uno. A continuación, agregue 20 mililitros de reactivo de medio de gradiente de densidad a un tubo cónico de 50 mililitros y dispense cuidadosamente 20 mililitros de sangre de cordón umbilical diluida por la pared del tubo para colocar la sangre en capas en el medio. Separe las células por centrifugación, seguida de una eliminación cuidadosa de la capa de plasma.

Con una jeringa equipada con una aguja de calibre 18, recoja la célula mononuclear que contiene la capa leucocitaria en un nuevo tubo de 50 mililitros. Y agregue un volumen igual de medio basal endotelial a las células. Lavar las células por centrifugación y lisar los glóbulos rojos en el paladar resultante con cinco mililitros de solución de cloruro de amonio en hielo.

Después de cinco a 10 minutos con agitación ocasional, recoja las células por centrifugación y vuelva a suspender el pellet blanco en un medio de crecimiento endotelial fresco. Después de contar, aspire el colágeno de cada pocillo de la placa de seis pocillos y lave los pocillos tres veces en PBS. Siembre las células mononucleares a una concentración de una vez 10 a la séptima célula por dos mililitros de medio por pocillo.

Y regrese la placa a la incubadora durante 24 horas. Al día siguiente, enjuague las células una vez con medio de crecimiento endotelial fresco. A continuación, sustituya el lavado por tres mililitros de medio de crecimiento endotelial fresco y devuelva las células a la incubadora de cultivo celular.

Usando un microscopio de campo claro, obtenga imágenes diarias de las células para monitorear la progresión de las colonias de células endoteliales, marcando las placas donde surgen las colonias para rastrear su crecimiento. Cuando las colonias de células endoteliales alcancen un tamaño aproximado de tres milímetros, cubra un matraz de cultivo T25 con colágeno fresco de cola de rata durante al menos una hora en la incubadora de cultivo celular. A continuación, coseche las células con 150 microlitros de tripsina-EDTA al 0,05% por pocillo en la incubadora de cultivos celulares durante dos o tres minutos.

Golpee suavemente la placa para desalojar las células adheridas. Cuando las células comiencen a desprenderse, agregue inmediatamente dos mililitros de medio de crecimiento endotelial fresco y extraiga las células en un solo tubo cónico de 15 mililitros. Recoja las células por centrifugación y vuelva a suspender el pellet en un medio de crecimiento endotelial fresco.

Después de contar, siembre las células en el matraz recubierto de colágeno a una velocidad de cinco veces 10 a la quinta celda en tres mililitros de densidad de medio por matraz, y marque el matraz como paso uno. Luego regrese el matraz a la incubadora, resembrando las celdas cuando la colonia alcance el 90% de confluencia. Después de la siembra en las placas tratadas con colágeno, el primer crecimiento de la colonia se observa típicamente entre los días cinco a nueve.

Las colonias continúan creciendo y adquiriendo una morfología celular en forma de huso en las primeras etapas del cultivo, que luego progresa a una morfología similar a un adoquín. El número total de células recolectadas en cada paso aumenta en correlación directa con el número total de días en cultivo. El análisis de Western blot revela una expresión temprana de CD 31 y CD 34 por las células endoteliales cultivadas, que parece disminuir con el paso posterior.

Sin embargo, la expresión del receptor dos del factor de crecimiento endotelial vascular se mantiene en el tiempo, aunque a un nivel de expresión ligeramente inferior al observado tras el primer paso. Cabe destacar que las células progenitoras endoteliales no son positivas para el marcador de células mesenquimales alfa actina del músculo liso, a diferencia de, por ejemplo, los lisados de células intersticiales valvulares, que pueden incluirse como control positivo. Todo el procedimiento de aislamiento se puede completar en menos de cinco horas, dependiendo de la unidad de sangre de cordón umbilical obtenida.

Después de aislar y sembrar las células mononucleares en un medio de crecimiento endotelial, las colonias de EPC suelen tardar entre cinco y nueve días en aparecer en el cultivo. El método de aislamiento propuesto utiliza medios especializados para el cultivo de las células progenitoras endoteliales, y evita el uso de un citómetro de flujo, en cuanto al requisito de tener marcadores endoteliales. Este método también proporciona un protocolo eficiente para obtener grandes cantidades de células progenitoras endoteliales en un corto período de tiempo.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aislar las células progenitoras endoteliales de las unidades de sangre del cordón umbilical humano. No olvide que la sangre del cordón umbilical humano puede ser peligrosa y se debe seguir la eliminación adecuada de la sangre de desecho y los productos de cultivo celular.