Generación y cuantificación de 3 dimensiones de las lesiones arteriales en ratones mediante tomografía óptica de proyección

El objetivo general de este procedimiento es demostrar cómo se puede utilizar la tomografía de proyección óptica para la visualización y cuantificación tridimensional de lesiones ateroscleróticas y neointimales en el ratón. Esto se logra generando primero lesiones arteriales en ratones, ya sea quirúrgicamente o alimentando con una dieta alta en colesterol a ratones con predisposición a desarrollar aterosclerosis. El siguiente paso es aislar la arteria diana y escanearla mediante tomografía de proyección óptica.

Los pasos finales son realizar la reconstrucción de la imagen, identificar la lesión y medir el volumen de la lesión. En última instancia, los resultados pueden mostrar reconstrucciones anatómicas de la lesión y cuantificación del volumen de la lesión y el estrechamiento arterial mediante análisis de imágenes. Nuestro grupo está interesado en comprender los mecanismos que subyacen a la formación de lesiones que causan estrechamiento arterial que conduce a complicaciones potencialmente mortales como el ataque cardíaco y el accidente cerebrovascular.

Esta aplicación de la tomografía de proyección óptica fue desarrollada en nuestro grupo por el Dr. Nicholas Kirkby, trabajando con la Dra. Lucy Lowe, y será demostrada por el Dr. Jung Shi Wu, quien es un científico postdoctoral que trabaja en nuestros laboratorios. La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como la histología y la inmunohistoquímica, es que es menos laboriosa y permite el análisis tridimensional en lugar de bidimensional. Esta técnica para inducir lesiones de la arteria femoral es una modificación de las de R y compañía y Sada y compañía.

El protocolo de texto explica cómo inducir lesiones ateroscleróticas mediante la manipulación dietética. Comience con un ratón C 57 negro de seis de 10 a 12 semanas de edad que pesa entre 25 y 30 gramos. Una vez anestesiado, coloque el ratón sobre una almohadilla tibia para mantener su temperatura corporal y proporcionar flúor en un dos a 3% a través de un cono nasal.

Cuando el ratón no responde a un pellizco en el dedo del pie, administre buprenorfina a 0,1 miligramos por kilogramo. A continuación, coloque el ratón boca arriba y afeite la superficie ventral de la extremidad trasera izquierda. A continuación, se hace una incisión para exponer los músculos de la extremidad posterior superior entre la bifurcación de la arteria poplítea y la pared abdominal.

Hacer una disección roma para aislar el nervio femoral de la arteria y la vena femoral durante todo el procedimiento. Mantener los tejidos húmedos con un 1% de peso por volumen licanino. A continuación, coloque ligaduras temporales de seda 6.0 Mers alrededor de la arteria y la vena femoral cerca de la pared abdominal e inmediatamente debajo de la rama con la arteria poplítea.

Estos son para controlar el flujo sanguíneo. A continuación, aislar la arteria poplítea, de dos a cinco milímetros distal a la rama con la arteria femoral, y ligar la arteria poplítea por debajo de la arteria poplítea. Coloca una segunda ligadura.

Ahora, haga una pequeña incisión para la inserción del alambre en la arteria poplítea inmediatamente distal a la rama con la arteria femoral. Aplique presión a la ligadura temporal proximal para evitar el sangrado a través de la incisión y hacia la arteria femoral hacia la pared abdominal. Inserte un cable G de 0,014 pulgadas de aproximadamente uno a 1,5 centímetros.

Déjalo en su lugar durante 30 segundos y luego retíralo. Luego, mediante las ligaduras se liga, la arteria poplítea por encima de la incisión. Tenga cuidado de evitar ocluir la arteria femoral.

Ahora retire las ligaduras temporales. Cerrar la herida con suturas continuas utilizando 5.0 mercal. A continuación, aplique la crema EMLA.

Permita que el animal recupere la conciencia y el movimiento en la jaula de recuperación antes de devolverlo a la jaula de origen. Se espera que la pata muestre cojera durante dos o tres días, pero esto no significa que el ratón deba estar aislado. Para la OPT, el ratón debe ser sacrificado, inducir anestesia terminal con pentobarbital.

A continuación, realizar una fijación de perfusión cardíaca trans con exanguinación. Ahora aísle las arterias femorales o el arco aórtico y sus ramas. Elimine cualquier material perial extraño en el proceso.

A continuación, coloque el tejido en formol tamponado neutro al 10% durante la noche. Al día siguiente, almacene el tejido en etanol al 70% o proceda a incrustar las arterias en aeros filtrados al 1,5% LMP. Baje suavemente el tejido en el aire fundido a unos 40 grados centígrados.

Recorta los aeros para hacer una forma cónica. Ahora deshidrate esta preparación en metanol al 100% durante al menos 12 horas. Una vez deshidratado, limpie los vasos en una mezcla de uno a dos de benzoalcohol y benzobenzoato.

Deje que los recipientes se incuben en esta solución durante 12 a 24 horas. Al día siguiente, cargue la muestra aclarada en el tomógrafo, que debe estar precalibrado. La resolución se establece en 1024.

Por 1024 píxeles. Establezca la ampliación para el área de interés. El eje Z se ajustará automáticamente a la misma resolución.

El tamaño del vóxel será de unas 200 micras. A continuación, utilice el canal de campo claro, coloque la muestra de modo que gire alrededor de su propio eje en el centro del campo de visión. Con el canal de emisión de un filtro GFP, establezca el enfoque y ajuste la exposición para maximizar el rango dinámico de la imagen.

Evite la sobresaturación. Ahora escanee el recipiente en el canal de emisión GFP solo con pasos de 0,9 grados. A continuación, las muestras deben devolverse a metanol al 100% durante al menos 24 horas antes de incrustarlas en cera.

Para el análisis histológico, abra las imágenes adquiridas en un software de reconocimiento o un software similar que utilice un software de visualización de datos. Compruebe la calidad de la reconstrucción de la imagen, mejore la calidad de la imagen, ajuste la intensidad de la imagen y haga que el software compense cualquier desalineación de la muestra con respecto a su eje de rotación ideal. Para cada exploración, defina la región vertical de interés que contiene la lesión.

En cada 50ª línea de escaneo, trace el borde entre el medio y la posición de la lámina elástica interna. A continuación, el software puede interpolar el borde en todos los demás escaneos, comprobar manualmente estas interpolaciones y corregirlas según sea necesario. Ahora produzca un conjunto de imágenes binarias con los píxeles blancos que representan la neoíntima y los píxeles negros que representan el lumen patente.

Esto se logra definiendo los umbrales de intensidad. Una vez logrado esto, el volumen del objeto es el volumen total de la lesión, y el volumen luminal es el volumen total, menos el volumen del objeto. Así, se evalúa la distribución de la lesión y la luz a lo largo de la longitud axial.

Las arterias femorales murinas se extrajeron 28 días después de la lesión inducida por alambre o ligadura. El engrosamiento neointimal fue evidente en las proyecciones de emisión en las diapositivas bidimensionales reconstruidas. Se distinguieron lesiones neointimales concéntricas.

La tomografía de proyección óptica (tomografía de proyección óptica) de todo el arco aórtico de un ratón con deficiencia de APOE identificó las lesiones esperadas en la curvatura menor del arco aórtico, la arteria braquiocefálica y en los orígenes de las arterias carótida izquierda y subclavia. La misma lesión fue segmentada y representada en rojo. Para enfatizar la distribución de las placas cuando se superponen a la imagen original, se pudo distinguir el medio y el lumen en imágenes transversales que muestran que se trataba de lesiones excéntricas.

Aquí, a medida que la exploración se desplaza distalmente a lo largo de estas ramas, las lesiones se reducen gradualmente y desaparecen primero en la arteria subclavia, luego en la carótida y finalmente en la arteria braquiocefálica. Curiosamente, esta lesión en la arteria braquiocefálica pasa al divisor de flujo a medida que este vaso se divide en las arterias carótida derecha y subclavia derecha. Después del procedimiento OPT, se pueden realizar otros métodos como la histología y la inmunohistoquímica para responder preguntas adicionales como ¿cuál es la composición de la lesión?

Entonces, después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los científicos que trabajan en el campo de la investigación vascular investiguen el papel de los receptores endoteliales, las lectinas y las enzimas metabolizadoras de esteroides en el desarrollo de lesiones neointimales y ateroscleróticas. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo obtener y analizar lesiones de las arterias rinas mediante tomografía de proyección óptica.