Producción De ARN Para El Análisis Transcriptómico De Los Cuerpos Celulares De La Neurona Motora De La Médula Espinal De Ratón Por Microdisección De Captura Láser

El objetivo general de este procedimiento es recuperar ARN de alta calidad de las neuronas motoras de la médula espinal sin contaminación por ARN de células vecinas. Esto se logra primero recuperando, dividiendo e incrustando la médula en un medio de inclusión criogénico y congelándola a menos 160 grados Celsius. El segundo paso consiste en seccionar criogénicamente la médula sobre portaobjetos con membrana PEN a menos 20 grados Celsius.

A continuación, se lavan las laminillas en etanol al 70 % y se tiñen con azul de Azure B en etanol al 70 %. El paso final consiste en la microdisección por captura láser de los cuerpos celulares de las neuronas motoras identificadas, colectándolos en tampón de lisis de tiocianato de guanidinio. Finalmente, se prepara ARN total a partir de los lisados combinados y se analiza para detectar diferencias en la transcripción de ARN general o específico en neuronas de animales mutantes frente a animales de tipo silvestre.

La microdisección por captura láser permite recuperar cuerpos celulares de neuronas motoras a partir de secciones de médula espinal sin contaminación por las células de tipo Escalia y otros tipos celulares más numerosos. Esto ofrece la posibilidad de preparar ARN y comparar la transcripción entre neuronas de un animal enfermo y uno normal. El aspecto más difícil al desarrollar este procedimiento fue encontrar un método de tinción que nos permitiera detectar neuronas motoras en secciones de médula espinal manteniendo altos niveles de integridad del ARN y su capacidad de extracción, tanto antes como durante la captura láser.

Descubrimos que teñir cortes con Azul B y etanol al 70% cumplía estos criterios cuando se combinaba con la recolección directa de los cuerpos celulares diseccionados en tampón de lisis de tiocianato de guanidina, demostrando que el procedimiento es eficaz. Van Padia, una investigadora posdoctoral en nuestro laboratorio, recomienda para obtener los mejores resultados asegurarse de que todo el equipo se limpie con una solución descontaminante de ARNasa, seguida de etanol al 70% libre de ARNasa, tras la eutanasia y la perfusión transcardial. Aísle cuidadosamente la médula espinal. Enjuague el cordón durante 10 segundos en ARNasa.

Agua libre para lavar cualquier resto de sangre y colóquela sobre un portaobjetos libre de RNAsas con mucha suavidad pero rápidamente. A continuación, divida la médula espinal transversalmente usando una cuchilla limpia en nueve a 10 fragmentos. Coloque los fragmentos en un molde criogénico lleno de OCT y alinéelos verticalmente utilizando una aguja limpia.

Coloque el molde en una bandeja poco profunda que contenga butano metílico previamente enfriado con nitrógeno líquido. Para evitar la degradación del ARN, coloque la bandeja en un baño de nitrógeno líquido, con el fin de congelar rápidamente los fragmentos de la médula espinal.

Almacene el bloque embebido en OCT a menos 80 grados Celsius durante hasta seis meses antes del corte. Cuando esté listo para el corte, coloque el bloque embebido en OCT en un criostato enfriado. Produzca cortes de 20 micrómetros, cada uno conteniendo de nueve a 10 secciones transversales de la médula espinal.

Coloque las secciones sobre una membrana libre de RNAsas. Mantenga inicialmente las laminillas de 2 µm a temperatura ambiente para asegurar que las secciones se adhieran. Vuelva a congelar inmediatamente la sección sobre una superficie a menos 20 grados Celsius dentro del criostato.

Mantenga las láminas a menos 80 grados Celsius hasta su uso en un estante limpio. Seis tubos cónicos de 50 mililitros llenos con etanol al 70% libre de RNAsas. La profundidad debe ser suficiente para cubrir todas las secciones de una lámina cuando esta se sumerja.

A continuación, coloque la solución de Azul de Azure al 1 % en el mismo portaobjetos. Para minimizar el tiempo entre el cambio de soluciones durante el lavado o la tinción, mantenga tres o cuatro toallitas de laboratorio frente al portaobjetos para drenar rápidamente el exceso de solución. Cuando esté listo, retire los portaobjetos del congelador a -80 grados Celsius y colóquelos sobre hielo seco; descongele un portaobjetos colocándolo sobre la palma enguantada.

Retire la mayor parte de la humedad y la condensación del portaobjetos limpiándolo con una toallita de laboratorio, teniendo cuidado de no tocar las secciones. Coloque el portaobjetos sobre gel de sílice fresco en una placa de Petri durante 30 a 40 segundos para secarlo completamente. Una vez seco, sumerja el portaobjetos en el primer tubo de etanol al 70 % libre de RNAsas.

Sumerja el portaobjetos durante 30 segundos y luego elimine el OCT lavándolo mediante inmersiones hacia arriba y hacia abajo durante 45 segundos a un minuto. A continuación, saque el portaobjetos de la solución y elimine el exceso de líquido sobre toallitas de laboratorio. Repita este proceso sumergiendo el portaobjetos en el segundo tubo de etanol al 70%.

Si el OCT permanece alrededor de las secciones de la médula espinal, repita el lavado en el tercer tubo. Después de eliminar el exceso de líquido, sumerja el portaobjetos en solución de Azul B al 1 % en etanol libre de RNAs al 70 % durante 30 a 45 segundos. Elimine el exceso de Azul B sobre una toallita de laboratorio.

En este momento, la totalidad del portaobjetos estará azul. Sumerja el portaobjetos en el siguiente tubo con etanol al 70 % e introdúzcalo y extráigalo rápidamente tres o cuatro veces para eliminar el colorante en exceso y hacer visible la tinción específica de las neuronas motoras. Si las secciones presentan una tinción muy oscura, repita el paso de descoloración en un tubo nuevo con etanol al 70 %.

Si la tinción parece demasiado clara, regrese el portaobjetos a la solución de Azul de Azure durante otros 32 segundos y repita la descoloración. Si la tinción es satisfactoria, deje que el portaobjetos se seque al aire brevemente y continúe con el siguiente paso. Después de la tinción DES y el secado, la sustancia gris será de color azul claro y las neuronas motoras teñidas de azul intenso serán fácilmente visibles.

Inicie la disección inmediatamente después de encender el microscopio. Descargue el portador de tubos para colocar la tapa de un tubo microfuga de 0,6 milímetros. Para la recolección de la muestra, coloque 30 microlitros de tampón de lisis de guanidina y tiocianato en la tapa y cubra la superficie extendiendo la solución.

Con la punta de una pipeta, alinee la tapa con el orificio y el objetivo. Con el software del microscopio activado, mantenga la tapa en posición cerrada hasta comenzar la captura láser. Coloque la portaobjetos secada al aire boca abajo sobre la platina del microscopio de manera que el lado de la membrana quede hacia abajo y la sección esté alineada con el orificio.

Con el portaobjetos en su lugar, enfoque una sección de la médula espinal con el objetivo de cinco aumentos y luego pase al objetivo de 20 aumentos para la disección. Primero, marque una región ficticia con el lápiz óptico y permita que el láser la corte sin recogerla. Esto relaja la membrana y permite marcar y cortar múltiples regiones sucesivamente.

A continuación, vuelva a enfocar e identifique las neuronas motoras en la región del asta ventral. Estas neuronas son reconocibles por su ubicación, morfología piramidal, gran tamaño y tinción azul oscuro con Azul de Azure B. Utilizando el lápiz óptico, seleccione la herramienta de dibujo y marque a lo largo del borde de las neuronas motoras, trazando un contorno completo. Intente que el contorno esté lo más ajustado posible a la neurona motora para evitar contaminación proveniente de otras células.

Se pueden marcar múltiples células antes del corte, ya que el software recordará las posiciones cuando esté listo para cortar; coloque la tapa debajo de la posición de corte y haga clic en el botón de inicio para iniciar la disección de las neuronas motoras con el láser. Recoja todas las neuronas motoras de todas las secciones de un portaobjetos en la tapa de un tubo microfuga. Una vez completada la recolección, retire el tubo microfuga del portador extrayendo la bandeja y desalojando suavemente el tubo; disuelva completamente las neuronas motoras y el tampón pipeteando la solución hacia arriba y hacia abajo.

Coloque la solución en el cuerpo del tubo mediante centrifugación, congele inmediatamente la muestra en hielo seco y almacénela a menos 80 grados Celsius tras la tinción con Azul B. Las neuronas motoras aparecen como cuerpos celulares grandes y fuertemente teñidos. Se confirman mediante anticuerpos anti CHATT y tinción, y se diferencian fácilmente de las células vecinas más pequeñas. En este ejemplo, los cuerpos celulares de las neuronas motoras han sido delineados con el lápiz óptico y numerados por el software.

Aquí los cuerpos celulares han sido cortados con el láser y depositados en el tubo de recolección con los contornos desactivados. Es evidente el grado de daño causado por el láser en las regiones vecinas. Aquí se muestran resultados típicos de un análisis electroforético de la integridad del ARN de una muestra de aproximadamente 4.000 cuerpos celulares de neuronas motoras de ratón recolectados mediante LMD.

Observe los picos prominentes de ARN ribosómico. Este proceso, desde la tinción del portaobjetos hasta la disección de las neuronas motoras, debe completarse en menos de 30 minutos para todas las secciones de un portaobjetos, con el fin de minimizar la degradación del ARN. Al realizar este procedimiento, es importante recordar trabajar lo más rápidamente posible, tanto en la disección inicial y el incluido de la médula, como en los pasos finales de tinción y microdisección con láser de las neuronas motoras.