Producción De ARN Para El Análisis Transcriptómico De Los Cuerpos Celulares De La Neurona Motora De La Médula Espinal De Ratón Por Microdisección De Captura Láser

El ARN total de alta calidad se ha preparado a partir de cuerpos celulares de neuronas motoras de la médula espinal de ratón mediante microdisección de captura láser después de manchar secciones de la médula espinal con Azure B en etanol al 70%. Suficiente ARN (~ 40-60 ng) se recupera de 3.000-4.000 neuronas motoras para permitir el análisis de ARN aguas abajo por RNA-seq y qRT-PCR.

El objetivo general de este procedimiento es recuperar ARN de alta calidad de las neuronas motoras de la médula espinal sin contaminación por ARN de las células vecinas. Esto se logra primero recuperando, dividiendo e incrustando el cordón en un medio de crioinclusión y congelándolo a menos 160 grados Celsius. El segundo paso es crioseccionar el cable en portaobjetos de membrana de pluma a 20 grados centígrados negativos.

A continuación, los portaobjetos se lavan con etanol al 70% y se tiñen con Azure B con etanol al 70%. El paso final es la microdisección de captura láser de los cuerpos de células de neuronas motoras identificados en tampón de lisis de tiocianato de guina. En última instancia, el ARN total se prepara a partir de los lisados combinados y se prueba para descubrir diferencias en la transcripción general o específica del ARN en las neuronas de los animales mutantes frente a los salvajes.

La microdisección por captura láser permite la recuperación de cuerpos de células de neuronas motoras de secciones de la médula espinal sin contaminación por los más numerosos tipos de células de Scalia y otros tipos. Permitiendo la posibilidad de preparar ARN y comparar la transcripción entre neuronas de un animal enfermo y de uno normal. El aspecto más difícil en el desarrollo de este procedimiento fue encontrar un método de tinción que nos permitiera detectar neuronas motoras en secciones de la médula espinal manteniendo altos niveles de integridad de ARN y capacidad de extracción, tanto antes como durante la captura láser.

Descubrimos que las secciones de tinción en Azure B y 70%etanol cumplieron con estos criterios cuando se combinaron con la recolección de los cuerpos celulares disecados directamente en el tampón de lisis de tiocianato de Guine, lo que demuestra que el procedimiento es in. Van Padia, un postdoctorado en nuestro laboratorio para obtener los mejores resultados. Asegúrese de que todo el equipo se limpie con una solución descontaminante de ARN seguida de etanol al 70% libre de ARN después de la eutanasia y la perfusión transcardíaca Aísle cuidadosamente la médula espinal. Enjuague el cordón durante 10 segundos en ARN.

Agua libre para lavar cualquier residuo de sangre y depositarla en un portaobjetos de vidrio libre de ARN muy suave pero rápidamente. A continuación, divida la médula espinal transversalmente con una cuchilla de afeitar limpia en nueve a 10 piezas. Coloque las piezas en un molde criogénico lleno de OCT y alinéelas verticalmente con una aguja limpia.

Coloque el molde en una bandeja poco profunda que contenga dos metilbutano preenfriados con nitrógeno líquido. Para evitar la degradación del ARN, coloque la bandeja en un baño de nitrógeno líquido. Para congelar rápidamente las piezas de la médula espinal.

Almacene el bloque incrustado OCT a menos 80 grados centígrados durante un máximo de seis meses antes de seccionarlo. Cuando esté listo para la posición de seccionamiento, el bloque incrustado OCT en un criostato refrigerado. Produzca cortes de 20 micras, cada uno con nueve a 10 secciones transversales de la médula espinal.

Coloque las secciones en la membrana de la pluma libre de ARN. Dos portaobjetos de micras mantenidos inicialmente a temperatura ambiente para asegurar que las secciones se adhieran. Bueno, vuelva a congelar inmediatamente la sección en una superficie negativa de 20 grados centígrados dentro del criostato.

Mantenga las correderas a menos 80 grados centígrados hasta que se usen en un rango de rejilla limpio. Seis tubos cónicos de 50 mililitros llenos de ARNs libres de etanol al 70%. La profundidad debe ser suficiente para cubrir todas las secciones de un portaobjetos cuando el portaobjetos está sumergido.

A continuación, coloque la solución 1%Azure B en el mismo rack. Para minimizar el tiempo entre el cambio de soluciones durante el lavado o la tinción, mantenga tres o cuatro toallitas de laboratorio frente a la rejilla para drenar la solución adicional rápidamente. Cuando esté listo, saque los portaobjetos del congelador a menos 80 grados centígrados y colóquelos sobre hielo seco.

Elimine la mayor parte de la humedad y la condensación en el portaobjetos limpiándolo con una toallita de laboratorio, teniendo cuidado de no tocar las secciones. Coloque el portaobjetos sobre un desecante de gel de sílice fresco en una placa de Petri durante 30 a 40 segundos para que se seque por completo. Cuando esté seco, sumerja el portaobjetos en el primer tubo de ARN, etanol libre al 70%.

Remoje el portaobjetos durante 30 segundos y luego lave el OCT sumergiéndolo hacia arriba y hacia abajo durante 45 segundos a un minuto. A continuación, saque el portaobjetos de la solución y escurra el exceso de líquido en las toallitas de laboratorio. Repita este proceso sumergiendo el portaobjetos en el segundo tubo de etanol al 70%.

Si queda OCT alrededor de las secciones de la médula espinal, repita el lavado en el tercer tubo. Después de drenar el exceso de líquido, sumerja el portaobjetos en una solución de 1%Azure B en 70%RNAs, etanol libre durante 30 a 45 segundos. Escurre el exceso de Azure B en una toallita de laboratorio.

En este punto, toda la diapositiva será azul. Sumerja el portaobjetos en el siguiente tubo de etanol al 70% y sumérjalo rápidamente hacia arriba y hacia abajo, tres o cuatro veces para eliminar el exceso de tinte y hacer visible la tinción específica de la neurona motora. Si las secciones se ven muy oscuras, repita el paso de desmanchado en un tubo nuevo de etanol al 70%.

Si la tinción parece demasiado ligera, devuelva el portaobjetos a la solución Azure B para otro 32 y repita la tinción. Si la tinción es satisfactoria, deje que el portaobjetos se seque al aire brevemente y continúe con el siguiente paso. Después de la tinción y el secado de DES, la materia gris será de color azul claro y las neuronas motoras teñidas de azul profundo serán fácilmente visibles.

Comience la disección inmediatamente después de encender el microscopio. Descargue el soporte del tubo para colocar la tapa de un tubo de micro fuga de 0,6 milímetros. Para la recolección de muestras, coloque 30 microlitros de tampón de lisis de guina y tiocianato en la tapa y cubra la superficie extendiendo la solución.

Con una punta de pipeta, alinee la tapa con el orificio y el objetivo. Con el software del microscopio desgastado, mantenga la tapa en la posición cubierta hasta que comience la captura láser. Coloque el portaobjetos secado al aire boca abajo en la platina del microscopio de modo que el lado de la membrana quede hacia abajo y la sección esté alineada con el orificio.

Con el portaobjetos en su lugar, concéntrese en una sección de la médula espinal con el objetivo de cinco x y luego pase al objetivo de 20 x para la disección. Primero, marque una región ficticia con el lápiz óptico y deje que el láser la corte sin recogerla. Esto relaja la membrana y permite marcar y cortar varias regiones sucesivamente.

A continuación, reenfoque e identifique las neuronas motoras en la región del asta ventral. Estas neuronas son reconocibles por su morfología parmal de ubicación, gran tamaño y tinción azul oscuro con Azure B.Con el bolígrafo claro, seleccione la herramienta de dibujo y marque a lo largo del borde de las neuronas motoras haciendo un contorno completo. Trate de hacer el contorno lo más cerca posible de la neurona motora para evitar la contaminación de otras células.

Se pueden marcar varias celdas antes de cortar, ya que el software recordará las posiciones cuando esté listo para cortar, llevará la tapa debajo de la posición de corte y hará clic en el botón de inicio para iniciar la disección de las neuronas motoras con el láser. Recoja todas las neuronas motoras de todas las secciones en una diapositiva en la tapa de un tubo de microfuga. Una vez completada la recolección, saque el tubo de microfuga del soporte descargando la bandeja y desalojando suavemente el tubo, disuelva completamente las neuronas motoras y el tampón pipeteando la solución hacia arriba y hacia abajo.

Mueva la solución al cuerpo del tubo mediante centrifugación, congele la muestra inmediatamente en hielo seco y guárdela a menos 80 grados Celsius después de teñirla con Azure B. Las neuronas motoras aparecen como grandes cuerpos celulares teñidos oscuramente. Están confirmadas por anticuerpos anti CHATT, tinción y se diferencian fácilmente de las células vecinas más pequeñas. En este ejemplo, los cuerpos de las células de las neuronas motoras se han delineado con el lápiz óptico y se han numerado mediante el software.

Aquí, los cuerpos celulares se han cortado con el láser y se han dejado caer en el tubo de recolección con los contornos apagados. El alcance del daño del láser a las regiones vecinas es evidente. Aquí se muestran los resultados típicos de un análisis electroforético de la integridad del ARN de una muestra de aproximadamente 4.000 cuerpos de células de neuronas motoras de ratón recogidos por LMD.

Nótese los picos prominentes de ARN ribosómico. Este proceso, desde la tinción del portaobjetos hasta la disección de las neuronas motoras, debe completarse en 30 minutos para todas las secciones de un portaobjetos para minimizar la degradación del ARN. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que debe trabajar lo más rápido posible, tanto en la disección inicial y la inclusión del cordón, como en los pasos finales de la tinción y la microdisección con captura láser de las neuronas motoras.