Name: Expresión Ion Channel controlable a través de la transfección transitoria inducible (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min
Description: Aprende a controlar la expresión de canales iónicos mediante transfección transitoria inducible en sistemas heterólogos. Este método optimiza la farmacología de canales iónicos con resultados reproducibles y tiempos reducidos.

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Este trabajo fue apoyado por la Fundación de Ciencias de Israel [Subvenciones 1721/12, 1368/12, 1444/16 y] (AP). AP está afiliada con Brettler Center y David R. Bloom Center, Facultad de Farmacia, Universidad Hebrea de Jerusalén.

1. ligando el gen de interés en el Sitio reprimible de Vector <ol><li> Obtener un vector inducible, como pcDNA5 / FRT / A o pcDNA4 / A. </li><li> Analizar el gen de interés para cualquier sitio de restricción potencialmente susceptibles en el medio del gen que también aparecen en el sitio de clonación múltiple del vector elegido por el software de análisis de ADN silico 4. </li><li> Uso de superposición estándar técnicas de PCR 4, flanquean el gen de interés con dos sitios de reconocimiento de enzimas de restricción seleccionadas (que no se encuentran en el gen de interés), el primero inserta antes del codón de inicio, y el segundo después del codón de parada. </li><li> Digerir tanto el vector e insertar con enzimas de restricción (seleccionados en el paso 1.2) a la temperatura de trabajo enzimas &#39;durante una hora, seguido de la adición de una unidad de fosfatasa de intestino de ternera (CIP) a la reacción vector solamente durante 30 minutos con el fin de evitar la auto ligación. </li><li>Cargar el ADN digerido en un gel de agarosa al 1% y se separan los segmentos escindidos por electroforesis 9. </li><li> El uso de la luz ultravioleta, se cortó con una cuchilla de las piezas de gel que contiene los segmentos deseados de vectores e insertar a ligar. </li><li> Extraer los segmentos de ADN a partir de las piezas de gel de agarosa (utilizando kits comerciales disponibles de extracción de ADN) y medir su concentración final por espectrofotómetro a 260 nm. </li><li> Ligar el gen de interés en el vector seleccionado inducible utilizando la enzima ligasa de T4 a temperatura ambiente durante 20 minutos. Con el fin de aumentar la probabilidad de que el inserto de ligación con el vector, utilizar una proporción de 3: 1 molar de la inserción: vector. Para el control, preparar una reacción de ligación que incluye sólo el vector. </li><li> Para la transformación bacteriana, añadir 10 ng de vector solo y vector + gen en 50 l de E. coli competentes. Incubar el tubo en hielo durante 30 minutos seguido de 45 segundos de incubación a 42 ° C. Inmediatamente coloque de nuevoen hielo durante dos minutos y transferir las bacterias transformadas a 500 l de medio LB. Incubar durante una hora a 37 ° C con agitación a 220 rpm. </li><li> Para la selección de bacterias transformadas con éxito, la placa 100 l de cada reacción (como se describe en 1.9) en una placa de agar LB preparado que contiene el antibiótico apropiado (por ejemplo, 100 g / ml de ampicilina cuando se utiliza pCDNA4 / TR). </li><li> Permitir a crecer durante la noche a 37 ° C. Las placas pueden ser almacenadas a 4 ° C durante hasta dos semanas por firmemente envolviéndolos en película de parafina plástico. </li><li> Levantar colonias individuales usando una punta de 10 l, y permitir a crecer durante la noche en 3 ml de LB + antibiótico medio a 37 ° C con agitación a 220 rpm. Las bacterias con ADN de interés pueden ser congeladas (-20 ° C) para el almacenamiento a corto plazo por centrifugación de la LB y bacterias a 11.000 xg y aspirar el sobrenadante. El almacenamiento a largo plazo requiere la congelación de las bacterias como la madre de glicerol a -80 ° C. </li><li> Extraer el ADN through mini-prep y medir la concentración final por espectrofotómetro a 260 nm 5. </li><li> Confirmar inserción exitosa del gen de interés mediante la secuenciación de la construcción purificada 4. Alternativamente, la digestión de diagnóstico de la construcción por las enzimas de restricción utilizando electroforesis para separar los segmentos de corte y evaluar su presencia y longitud también podría utilizarse para este fin 4. </li></ol> 2. El cultivo de líneas celulares que expresan TetR <ol><li> Obtener una línea de cultivo celular que alberga un plásmido represor Tet incorporado en su ADN genómico. En esto el protocolo será escrito utilizando células 293T de riñón embrionario humano (HEK-293T) que alberga el plásmido pcDNA6 / TR como un ejemplo. </li><li> Sembrar las células en placa de cultivo de tejido de 100 mm con Eagles modificado de medio de Dulbecco (DMEM) suplementado con 10% FBS, 1% de penicilina-estreptomicina, 2 mM L-glutamina, y HEPES 25 mM, pH 7,3 (en el presente documento: DMEM completo) e incubar O / N a 37 y# 176; C y 5% de CO2. Todo el trabajo con células debe realizarse en una campana biológica en condiciones estériles. </li><li> A fin de mantener la expresión de gen represor Tet, aspirar el medio y sustituirlo por DMEM completo complementado con 5 mg / ml de blasticidina. Se incuban las células a 37 ° C y 5% de CO 2. </li><li> Una vez que las células alcanzan el 80 - 90% de confluencia, aspirar el medio y lavar suavemente las células dos veces con DPBS (sin calcio y magnesio) se calentó a 37 ° C. </li><li> Con el fin de levantar suavemente las células sin causar daños mecánicos, Incubar el cultivo en DMEM que contiene 0,05% de tripsina se calentó a 37 ° C durante 1,5 min. </li><li> Bloquear la acción de tripsina con un volumen igual de completo DMEM. pipetear suavemente hacia arriba y hacia abajo con el fin de levantar las células y transferirlas a un tubo estéril. </li><li> Centrifugar las células a 200 xg durante 5 min. </li><li> Aspirar el sobrenadante y reemplazarlo con 1 ml de DMEM completo. Pipetear la solución con las células hacia arriba y abajo hasta que no segrupos de células se pueden ver. Contar y calcular el número de células utilizando un hemocitómetro. </li><li> Semilla de 1 - 2 x 10 6 células en 100 mm placa de cultivo tisular que contiene 12 ml de DMEM completo con 5 mg / ml blasticidina. Dividir las células dos veces a la semana a medida que alcanzan 90% de confluencia. </li></ol> 3. transfección del plásmido de interés en células <ol><li> Utilizando el mismo método de división de celdas como se ha descrito anteriormente, las células de transferencia a los pocillos en una placa de 12 pocillos preparada con 0,9 ml completo DMEM, suficiente para que 50% de confluencia (~ 200.000 células) e incubar durante la noche a 37 ° C en un CO 2 incubadora. </li><li> Preparar una mezcla de transfección con pcDNA4 / A que contiene el gen de interés, un plásmido inerte para llevar la cantidad total de ADN de 1 mg (si es necesario), 3 mu l de reactivo de transfección de lípidos y DMEM para hacer que el volumen final de 100 mL. La cantidad óptima de ADN de plásmido a utilizar varía ampliamente como diferentes proteínas expresan en diferente eficiencia. para elegidosexperimentos rophysiological, incluyen EGFP en el plásmido de expresión de mamífero en el cóctel de transfección con el fin de visualizar las células que se someten a transfección con éxito 4. </li><li> Incubar la mezcla de transfección a temperatura ambiente durante 30 min. </li><li> Transfectar células pipeteando la mezcla de transfección gota a gota sobre las células sembradas en la placa de 12 pocillos y la placa de roca vigorosamente para asegurar una dispersión homogénea de ADN y reactivo de transfección. Las células deben ser ~ 80% de confluencia en el momento de la transfección. </li><li> Se incuban las células transfectadas O / N a 37 ° C y 5% de CO2. </li><li> Confirmar que las células se transfectaron con éxito mediante la observación de la señal de fluorescencia de EGFP bajo la lámpara UV a la mañana siguiente si la realización de la electrofisiología. </li></ol> 4. Las células en placas sobre poli-D-lisina (PDL) Cubreobjetos / Wells <ol><li> Esterilizar 12 mm cubreobjetos por rociar con una solución de etanol isopropílico al 70%. Seco y colocar una sola coverslip en cada pocillo de una placa de 24 pocillos para el registro electrofisiológico. </li><li> Pipetear una solución de 0,1 - solución de 0,2 mg / mL PDL en cada cubreobjetos o bien de una cámara de imágenes de calcio. </li><li> Deje reposar durante 30 minutos a 37 ° C en una incubadora de CO2 al 5%. </li><li> Lavar con agua de calidad para el cultivo de células doblemente destilada (DDW) tres veces, aspirando entre cada lavado. Tras el lavado final, secar bien y dejar reposar a temperatura ambiente. </li><li> Para electrofisiología, llenar cada pocillo que contiene un cubreobjetos recubierto PDL con 500 l DMEM completo se calentó a 37 ° C. </li><li> Realizar el mismo método de dividir las células transfectadas como se describe anteriormente. Después de la resuspensión de las células después del tratamiento con tripsina y de bloqueo, la transferencia de 80 l de células (o aproximadamente 30.000 células) para el centro de cada cubreobjetos recubiertos PDL para la grabación de electrofisiología. Dejar reposar las células durante al menos 1,5 horas o incubar durante la noche a 37 ° C en una incubadora de CO2 al 5%. </li><li> Para la transferencia de calcio de formación de imágenes y la mancha 20 l de células (aproximadamente 20.000 células) para el centro de cada imagen de calcio recubierto PDL también. Dejar reposar las células durante al menos 30 minutos y se añaden 180 l DMEM completo a cada pocillo. </li></ol> 5. La inducción de la expresión génica <ol><li> Preparar una solución de doxiciclina de stock de 1 mg / ml en DDW de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Mantenga solución de reserva protegida de la luz a 4 ° C durante un máximo de 3 semanas. Para el almacenamiento a largo plazo mantener la doxiciclina solución madre a -20 ° C. </li><li> Preparar un nuevo máximo de 2 mg / ml (electrofisiología) o / ml (imágenes de calcio) solución de doxiciclina 3 g en DMEM completo y se caliente a 37 ° C. </li><li> Para registros electrofisiológicos, de pipeta 500 l de 2 mg solución doxiciclina / ml a cada pocillo para hacer una concentración final de 1 mg / ml de doxiciclina. Para imágenes de calcio, añadir 100 l de solución de doxiciclina 3 mg / ml a cada pocillo para hacer una concentración final dela de 1 mg / ml de doxiciclina. Anotar la hora de la inducción. </li><li> Incubar durante la cantidad de tiempo deseado para la inducción a 37 ° C y 5% de CO 2. </li></ol> 6. Calibración de la línea de tiempo de la expresión proteica <ol><li> Calibración de expresión de la proteína a través de imágenes de calcio 5, 10 <ol><li> Preparar la solución de Ringer (NaCl 140 mM, KCl 2,5 mM, 1,8 mM CaCl 2, 2 mM MgSO 4, HEPES 20 mM, pH ajustado a 7,4 con NaOH) y se caliente a 37 ° C. </li><li> Preparar concentraciones saturantes de agonista de canal en solución de Ringer. Debido a que la cantidad de agonista se diluye cuando se añade a las cámaras de formación de imágenes de calcio que contienen las células y la solución extracelular, el doble de la cantidad de la concentración final deseada de agonista. Esto también hace que la cantidad de solución del baño en cada pocillo crítico de controlar. </li><li> Preparar una solución de no iónico F-127 20% W / V en DMSO. Calentar la solución a 40 ° C hasta que no iónico F-127 se disuelve. Almacenar la solución no iónico F-127 a temperatura ambiente y se caliente a 40 ° C antes de su uso. No iónico F-127 se utiliza para ayudar a dispersar (AM) ésteres de acetoximetilo de indicadores de iones fluorescentes tales como Fura-2 en soluciones acuosas. </li><li> Aspirar medio y reemplazarlo con una solución de Fura-2AM de carga (solución de Ringer suplementado con 2 - 3 M Fura-2AM, 0,02 mg / mL no iónico F-127 y 10 mM de D-glucosa). </li><li> Incubar durante 60 min a TA en la oscuridad. </li><li> solución y lavar las células Aspirar Fura-2AM con solución de D-glucosa + 10 mM de Ringer para eliminar el tinte extracelular. Repita este paso dos veces. </li><li> Deje la solución D-glucosa mM + 10 de 200 l Ringer en cada pocillo e incubar durante 30 min a TA en la oscuridad. </li><li> Coloque la cámara en el escenario por encima de la pieza de la nariz microscopio y fijarlo con soporte. </li><li> Encender la lámpara, la cámara y el microscopio y seleccione filtro de Fura-2 para detectar la emisión a 510 nm wavelength. </li><li> Ajustar para obtener la ampliación deseada y centrarse células en el campo seleccionado. </li><li> En la oscuridad, restar la luz de fondo y ajustar el tiempo de exposición. </li><li> Conjunto de muestreo de imagen a la tasa de fluorescencia y grabar la respuesta deseada de Fura-2 células cargadas por excitándolas a 340 y 380 nm longitud de onda. La relación de 340/380 señales es un indicador de la concentración intracelular de Ca2 + y por lo tanto también para la actividad de TRPV1. </li><li> Añadir capsaicina 2 M en solución de 200 l Ringer mediante pipeteo para crear una concentración de saturación final de 1 mM capsaicina con el fin de evaluar el nivel de expresión de TRPV1. </li><li> Analizar la respuesta TRPV1 en función del tiempo de inducción y determinar protocolo para la proteína de interés. </li></ol></li><li> Ajuste de expresión de proteínas en sistemas heterólogos utilizando toda la configuración de la celda de la técnica de patch clamp 4, 11. <ol><li> preparar tque bañar solución de (mM) 140 NaCl, 2,3 KCl, 2 MgSO 4, 5 HEPES, y 5 2- (N-morfolino) etanosulfónico (MES), ajustado a pH 7,4 con NaOH. </li><li> Preparar concentraciones saturantes de agonista de canal en solución extracelular. </li><li> Tire de los electrodos de vidrio con un diámetro interior (ID) de 1,10 mm y extinción de esmalte a una resistencia de 2 - 4 de mO. </li><li> Preparar una solución de la pipeta de (mM) 130 KCl, 4 NaCl, 2 MgSO 4, 0,5 CaCl 2, 1 EGTA y 10 HEPES ajustado a pH 7,2 con KOH. Se filtra la solución de la pipeta antes de su uso. Antes de cada experimento, una sola, pipeta de vidrio pulido al fuego se vuelve a cargar sumergiendo la punta de la pipeta en la solución durante al menos un minuto, y luego se llena usando la punta fundida y se estiró con una jeringa llena con la misma solución de la pipeta. </li><li> Levante suavemente un único cubreobjetos PDL recubierto con las células cultivadas en placas desde el pozo a una placa petri de plástico 35 mm llena con aproximadamente 2 ml solución del baño a temperatura ambiente. Observar bajo un epmicroscopio i-fluorescente. </li><li> Localizar una célula EGFP positivo, como se visualizaron con el microscopio de epifluorescencia, en el cubreobjetos preparado y moverse hacia el centro del campo visualizado. </li><li> Coloque la pipeta llena hasta el soporte de pipeta de la micromanipulador, e inyectar una pequeña cantidad de presión positiva en el sistema para evitar la contaminación de la solución de la pipeta intracelular. Bajarlo hasta justo por encima de la GFP - célula positiva, la comprobación de la resistencia adecuada. </li><li> A medida que la pipeta toque la célula, aplicar una pequeña cantidad de presión negativa con el fin de crear un sello GΩ entre la pipeta de vidrio y la membrana celular. </li><li> Con un corto fuerte pulso de succión,, romper la membrana celular, lo que permite la pipeta entre en contacto con el contenido intracelular de la célula. </li><li> Cambiar el modo de amplificador de células enteras, y baje la ganancia del filtro y la salida de Bessel en 1 - 5 kHz y 0.5α, respectivamente. </li><li> Registrar la respuesta actual a la saturaciónconcentraciones de agonista de canal mediante el uso de rampas de tensión o brecha protocolo libre. </li><li> Debido a la eficiencia de expresión cambian entre diferentes proteínas, repetir las grabaciones utilizando diferentes momentos de la longitud de inducción. </li></ol></li><li> Determinación del tiempo de inducción ideal para las grabaciones de canales individuales 4. <ol><li> Preparar una solución de (mM) 150 Na-gluconato, 15 NaCl, 5 EGTA, y 10 HEPES, ajustado a pH 7,4 con NaOH, como una solución de la pipeta. Para la solución del baño, utilizar la solución de la etapa 6.2.1. </li><li> Repita el procedimiento de células enteras usando ID pipetas de vidrio de 0,86 mm-pulido fuego a una resistencia de 10 - 12 mO y establecer potencial de mantenimiento de -40 mV. </li><li> Crear un sello en la membrana como se describe anteriormente y la ruptura de la membrana. </li><li> Usando el micromanipulador, levante la pipeta con el parche de membrana fuera de la celda. </li><li> Coloque el sistema de perfusión justo al lado de la pipeta que contiene el parche de membrana. </li><li> Baja tque Bessel ganancia del filtro y la salida a 2 - 5 kHz y 10α, respectivamente. </li><li> Perfundir concentraciones saturantes de agonista en el parche de la membrana, la evaluación de si el parche contiene uno o más canales de acuerdo con la respuesta. </li><li> Analizar el número de parches de canal individuales registradas con éxito contra el tiempo de inducción se aplica a las células. Ajustar el tiempo de inducción de acuerdo con los resultados deseados. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

La transfección es un protocolo ampliamente utilizado para la expresión de la proteína y la investigación, con muchas variaciones diferentes para mejorar la consistencia y la estabilidad de expresión. reactivos de transfección transitoria ofrecen un simple, fácil de usar protocolo donde la célula y proteína de interés pueden ser analizados en cuestión de horas hasta toda la noche desde el momento de la transfección. Por desgracia, este enfoque puede ser impredecible cuando el modo de análisis requiere un nivel consisten...

Heteróloga expresa sistemas es una de las técnicas más utilizadas para el estudio de una multitud de funciones celulares 1. Su perfil bajo proteína endógena, los requisitos mínimos de mantenimiento, el crecimiento fiable, y la capacidad de captar y expresar ADN foráneo han hecho líneas celulares tales como embrionarias de riñón humano (HEK293) y de ovario de hámster chino (CHO) casi imprescindible para la investigación biológica 2, 3. Las áreas de investigación incluyen el uso de sistemas heterólogos proteínas de membrana, la señalización intracelular y la actividad enzimática. Después de la transfección de ADN extraño en la célula, muchas formas diferentes de análisis se pueden realizar, incluyendo electrofisiología, imágenes de calcio radiométrico, western blot, etc. 4, 5. Debido a la amplia gama de posibles aplicaciones para los sistemas de expresión heteróloga, muchos diferereactivos y productos nt se han desarrollado para utilizar estas células y sus cualidades 6. Los sistemas de administración de ADN que se integran de forma transitoria o permanente de ADN extraño en células para estudiar la proteína exógena se ha convertido en una de las herramientas más populares y útiles para la investigación biológica. Más específicamente, transitoriamente la transfección de ADN en una célula se utiliza ampliamente como un proceso hacia delante simple, recta que requiere relativamente poco tiempo y materiales. Por otra parte, la tasa de éxito de las células que se someten a transfección es alta 7. Esta técnica es muy fiable cuando se combina con un gen marcador tal como la proteína fluorescente verde (GFP), y se puede utilizar para muchas técnicas diferentes, tales como imágenes de calcio y electrofisiología 5. Lamentablemente, sin embargo, que expresan transitoriamente el ADN en las células huésped viene con algunas de las dificultades principales, no en el menos que el nivel de expresión por célula no es fiable. El número de copias de ADN plásmido tomada up por célula es incontrolable, por lo tanto la expresión entre los experimentos individuales puede variar mucho 2. Este problema se vuelve significativo cuando sea tratando de reproducir las condiciones fisiológicas, o la realización de las técnicas de recolección de datos precisos. Como una solución a las complicaciones mencionadas anteriormente, los protocolos de transfección estables han sido diseñados en el que un gen de interés se puede insertar en el genoma de una célula bajo el estricto control de un promotor inducible, tal como un sistema de expresión represor de la tetraciclina, asegurando una sola de copias del plásmido se integra en el genoma de cada célula y sólo se expresa después de la inducción del mecanismo de la transcripción, por ejemplo, en presencia de doxiciclina. Aunque esto resuelve los obstáculos de los niveles de expresión de proteínas inconsistentes, este método pierde la comodidad de protocolo rápido y relativamente simple de transfecciones transitorias. El establecimiento de una línea celular estable que lleva por lo menos un par de semanas en which hay que calibrar una curva de muerte establecido por antibióticos específicos para mantener la expresión de la proteína y asegurar la integración del vector y hábilmente seleccionar y hacer crecer las colonias de células. En general, esto toma mucho más tiempo y esfuerzo con una menor tasa de éxito 8. A continuación, presentamos un protocolo intermedio que se basa en los puntos fuertes de las dos opciones de transfección populares para proporcionar una manera simple y eficaz para controlar los niveles de expresión en cualquier línea celular inducible. Mientras se mantiene células con un sistema de tet inducible, transitoriamente transfectar nuestro gen de interés, Transient Receptor canal catiónico miembro de la subfamilia V Potencial 1 (TRPV1), se ligó en un vector que se puede combinar de forma homóloga con el sistema de represor. De esta manera, el gen se puede introducir en las células sin empezar a expresar. Sólo con la adición de doxiciclina no el gen comienzan a expresar, lo que nos permite calibrar los niveles de proteína exprEssion según la técnica o niveles observados en condiciones fisiológicas. El protocolo también evita largas complicaciones asociadas con la generación de una línea celular que expresa de forma estable. Comenzamos mostrando los niveles cambiantes de la activación TRPV1 en imágenes de calcio desde un-inducida a través de cuatro horas de la inducción y la forma en que el aumento de los niveles de calcio intracelular se correlaciona. A continuación, duplicar el protocolo en toda la configuración de la celda de la técnica de patch clamp, que muestra la corriente aumenta con el tiempo de inducción en aumento. Por último, se presentan ejemplos de grabaciones de electrofisiología de un solo canal, y demostrar que esta técnica es especialmente útil para la expresión controlada en la búsqueda de la recopilación de datos precisos sobre la base de las unidades individuales de la proteína. A través de nuestro protocolo, ofrecemos una manera conveniente de controlar la expresión de proteínas en sistemas heterólogos, evitando las complicaciones de cultivo de células largas, proporcionando así una manera de controlar las condiciones entre los experimentos y proporcionar movolver a resultados reproducibles.

<table><tbody><tr><td>pcDNA y comercio; 4/TO Vector de expresión de mamíferos</td><td>ThermoScientific Fisher V102020</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pcDNA&trade; 5/TO Vector de expresión de mamíferos</td><td>ThermoScientific Fisher</td><td>V103320</td><td></td></tr><tr><td>PureLink Quick PCR Purification Kit</td><td>Invitrogen K310001</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Swift&trade; &nbsp; Termociclador MaxPro</td><td>Esco&nbsp;</td><td>n.a</td><td></td></tr><tr><td>Enzimas de restricción</td><td>ThermoScientific Fisher</td><td>ER0501</td><td></td></tr><tr><td>Agarosa&nbsp;</td><td>Lonza</td><td>50004</td><td></td></tr><tr><td>PureLink Kit de Extracción Rápida de Gel</td><td>Invitrogen</td><td>K210012</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000c</td><td>ThermoScientific Fisher</td><td>ND-2000C</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase</td><td>ThermoScientific Fisher</td><td>EL0011</td><td></td></tr><tr><td>One Shot&reg; TOP10 Químicamente Competentes E. coli</td><td>ThermoScientific Fisher C404006</td><td>&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Ampicilina (Sodio), Grado USP Oro</td><td>Bio</td><td>A-301-5</td><td></td></tr><tr><td>Triptona para microbiología</td><td>Merck</td><td>6.19305E+13</td><td></td></tr><tr><td>Extracto de levadura</td><td>BD en todo el mundo</td><td>212750</td><td></td></tr><tr><td>SIF6000R agitador incubado</td><td>LAB COMPANION</td><td>45H118</td><td></td></tr><tr><td>NucleoSpin&reg; plásmido</td><td>Macherey Nagel</td><td>740588.25</td><td></td></tr><tr><td>MS 300V Fuente de alimentación</td><td>Major Science</td><td>MP-300V</td><td></td></tr><tr><td>Owl&trade; EasyCast&comercio; B1A Mini sistema de electroforesis en gel</td><td>ThermoScientific Fisher</td><td>B1A</td><td></td></tr><tr><td>T-REx&trade;-293 línea celular</td><td>Invitrogen</td><td>R710-07</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (1x), líquido (glucosa alta)</td><td>Gibco</td><td>41965-039</td><td></td></tr><tr><td>HindIII-HF&reg;</td><td>NEB</td><td>R3104S</td><td></td></tr><tr><td>ApaI</td><td>NEB</td><td>R0114S</td><td></td></tr><tr><td>CutSmart&reg; Tampón</td><td>NEB</td><td>B7204S</td><td></td></tr><tr><td>pcDNA&trade; 6/TR&nbsp; Vector de expresión de mamíferos</td><td>ThermoScientific Fisher</td><td>V102520</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino (FBS), calificado, aprobado por la UE, origen en América del Sur</td><td>Gibco</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>HEPES Solución tampón (1 M)</td><td>Biological Industries</td><td>03-025-1B</td><td></td></tr><tr><td>Solución de penicilina-estreptomicina</td><td>Biological Industries</td><td>03-031-1B</td><td></td></tr><tr><td>L-Alanil-L-Glutamina (estable Glutamina) (200 mM)</td><td>Industrias Biológicas</td><td>03-022-1B</td><td></td></tr><tr><td>Heracell&trade; 150i CO2 Incubadora</td><td>ThermoScientific Fisher 51026406</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MSC-Advantage&trade; Cabina de seguridad biológica de clase II</td><td>ThermoScientific Fisher 51025411</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Clorhidrato de blasticidina S</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>15205-25MG</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Solución salina tamponada con fosfato (DPBS) modificada, sin cloruro de calcio y cloruro de magnesio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0.05%), rojo fenol</td><td>Gibco</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>Hemacitómetro metalizado con regla Neubauer doble</td><td>Hausser Scientific</td><td>31000</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I Medio de suero reducido</td><td>Gibco</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>TransIT&reg;- LT1 Reactivo de transfección</td><td>Mirus</td><td>MIR 2300</td><td></td></tr><tr><td>cubreobjetos de vidrio, #1 espesor, 12 mm de diámetro redondo</td><td>Knittel Glass</td><td>GG-12</td><td></td></tr><tr><td>BioCoat&trade; Poly-D-Lisina (PDL)</td><td>Corning</td><td>354210</td><td></td></tr><tr><td>Agua, Cultivo Celular Grado Industrias</td><td>Biológicas</td><td>03-055-1A</td><td></td></tr><tr><td>Hiclato de doxiciclina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9891-1G</td><td></td></tr><tr><td>Fura-2, AM éster</td><td>Biotio</td><td>BTM-50034</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic&reg; F-127</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2443-250G</td><td></td></tr><tr><td>&micro;-Slide 8 Well</td><td>ibidi</td><td>80826</td><td></td></tr><tr><td>(E)-Capsaicin</td><td>Tocris</td><td>462</td><td></td></tr><tr><td>Olympus IX70 Microscopio de fluorescencia</td><td>Olympus</td><td>n.a</td><td></td></tr><tr><td>Lambda DG-4 Conmutador de longitud de onda</td><td>Sutter Instruments</td><td>n.a</td><td></td></tr><tr><td>EXi Cámara de microscopía de fluorescencia azul</td><td>QImaging</td><td>n.a</td><td></td></tr> Software <tr><td>de imágenes de relación de fluorescencia MetaFluor</td><td>Dispositivos moleculares</td><td>n.a</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de borosilicato de pared delgada</td><td>Sutter Instruments</td><td>B150-110-7.5HP</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de borosilicato de pared estándar</td><td>Sutter Instruments</td><td>B150-86-7.5HP</td><td></td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido anhidro</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>276855</td><td></td></tr><tr><td>P1000 extractor de micropipetas</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-1000</td><td></td></tr><tr><td>MF-900 Microforge</td><td>NARISHIGE</td><td>n.a</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de perfusión ValveBank</td><td>AutoMate Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Digidata&reg; 1440A Sistema de adquisición de datos de bajo ruido</td><td>Molecular Devices</td><td>n.a</td><td></td></tr><tr><td>Axopatch 200B Amplifier</td><td>Molecular Devices</td><td>n.a</td><td></td></tr><tr><td>pCLAMP 10.6 Software</td><td>Molecular Devices</td><td>n.a</td><td></td></tr><tr><td>micromanipulador</td><td>Sutter Instruments</td><td>MP-225</td><td></td></tr></tbody></table>

expresión ion channel controlable a través de la transfección transitoria inducible

Controllable Ion Channel Expression through Inducible Transient Transfection

La transfección, la entrega de ácidos nucleicos extraño en una célula, es una herramienta poderosa en la investigación de proteínas. A través de este método, los canales iónicos pueden ser investigados por medio del análisis electrofisiológico, caracterización bioquímica, los estudios mutacionales, y sus efectos sobre los procesos celulares. Las transfecciones transitorias ofrecen un protocolo simple en el que la proteína se convierte en disponible para el análisis dentro de unas pocas horas a días. Aunque este método presenta un protocolo eficiente relativamente sencillo y el tiempo, uno de los componentes críticos es calibrar la expresión del gen de interés a niveles fisiológicos relevantes o niveles que son adecuados para el análisis. Con este fin, han surgido muchos enfoques diferentes que ofrecen la capacidad de controlar la expresión del gen de interés. Varios protocolos de transfección de células estables proporcionan una manera de introducir de forma permanente un gen de interés en el genoma celular bajo la regulación de una trascripción controlado por tetraciclinala activación cional. Si bien esta técnica produce niveles de expresión fiables, cada gen de interés requiere de algunas semanas de trabajo cualificado incluyendo la calibración de una curva de muerte, selección de colonias de células, y en general más recursos. Aquí se presenta un protocolo que utiliza la transfección transitoria del gen 1 canal catiónico miembro potencial subfamilia V Transient Receptor (TRPV1) en un sistema inducible como un medio eficaz para expresar una proteína de una manera controlada que es esencial en el análisis del canal iónico. Se demuestra que el uso de esta técnica, que son capaces de realizar las imágenes de calcio, células enteras, y el análisis de un solo canal con niveles de los canales controlados requeridos para cada tipo de recolección de datos con una única transfección. En general, esto proporciona una técnica replicable que puede ser usado para estudiar la estructura y la función de los canales iónicos.

Para crear rápidamente un modelo de expresión inducible, hicimos uso de células HEK293 que expresan la proteína represora de tetraciclina (TR) (por ejemplo, T-Rex-293) y los vectores que contienen secuencias de operador de tetraciclina (TetO) entre el promotor CMV y el sitio de clonación múltiple (por ejemplo, pcDNA4 / TO). Cuando se transfectaron en células TREx-293, la expresión del gen de interés en pcDNA4 / TO se reprime, como TR se une a TetO. La adición de doxicic...

El estudio de los canales iónicos a través de un sistema de expresión de forma heteróloga se ha convertido en una técnica básica en la investigación biomédica. En este manuscrito, se presenta un método eficiente de tiempo para conseguir la expresión del canal iónico fuertemente controlada mediante la realización de la transfección transitoria bajo el control de un promotor inducible.

Expresión Ion Channel controlable a través de la transfección transitoria inducible

Transfection, the delivery of foreign nucleic acids into a cell, is a powerful tool in protein research. Through this method, ion channels can be ...

El objetivo general de este procedimiento es proporcionar una forma conveniente de controlar la expresión de canales iónicos en sistemas heterólogos, evitando al mismo tiempo las complicaciones prolongadas del cultivo celular. Esto ofrece una manera de controlar las condiciones entre experimentos y generar resultados más replicables. Este método puede ayudar a facilitar la investigación en el campo de los canales iónicos.Como caracterizar las propiedades del canal en farmacología. Dado que los métodos actuales son complejos o presentan expresión proteica inconsistente. La ventaja principal de esta técnica es que podemos lograr niveles controlados de expresión de una amplia variedad de proteínas adaptadas a experimentos individuales en un tiempo relativamente corto.Para comenzar este procedimiento, transfiera las células TREX 293 a una placa de 12 pocillos preparada con 0,9 mililitros de DMEM completo por pocillo para alcanzar una confluencia del 50 %. Incube las células durante la noche a 37 grados Celsius en un incubador de CO₂. A continuación, prepare una mezcla de transfección compuesta por DMEM, el gen de interés, mostrado aquí como TRPV1, un plásmido inerte y el reactivo lipíd

controllable-ion-channel-expression-through-inducible-transient

Research

Investigación

JoVE Journal

Genetics

Genética

Vamos a demostrar la forma de estudiar el efecto de un único punto de mutación en la función de un canal iónico.

Mutagénesis y análisis funcional de los canales iónicos heteróloga se expresa en células de mamífero

Estrategia de transfección optimizados para la expresión y el registro electrofisiológico de los canales iónicos recombinantes del voltaje en las células HEK-293T

Fuente: Berens, C. et al. Aplicación de un sistema de expresión inducible para estudiar la interferencia de los factores de virulencia bacteriana con la señalización intracelular. J. Vis. Exp. (2015)Este vídeo demuestra el uso de un sistema de expresión inducible para identificar dónde la proteína efectora bacteriana CaeB interrumpe la cascada apoptótica del huésped. Describe los pasos para transfectar células que expresan CaeB con un sistema sensible a la tetraciclina para inducir la expresión...

Transfección de un sistema de expresión génica inducible en células que expresan una proteína efectora bacteriana

Este video describe el método de regulación de la expresión génica en células cultivadas mediante transfección con un plásmido que contiene un gen de interés y un plásmido regulador. La expresión de este plásmido puede ser controlada por tetraciclina o sus análogos sintéticos, lo que convierte a este sistema en un modelo útil para estudiar la expresión génica regulable.

Sistema regulable Tet-off inducible: un método in vitro para modular la expresión génica en células cultivadas mediante el sistema Tetraciclina-Off

El método descrito aquí se utiliza para inducir la cascada de señalización apoptótica en pasos definidos con el fin de diseccionar la actividad de una proteína efectora bacteriana antiapoptótica. Este método también se puede utilizar para la expresión inducible de proteínas proapoptóticas o tóxicas, o para diseccionar la interferencia con otras vías de señalización.

La aplicación de un sistema de expresión inducible para el Estudio de la interferencia de los factores de virulencia bacteriana con Señalización Intracelular

arritmias cardíacas hereditarias son a menudo causados ​​por mutaciones que alteran la entrega superficie de uno o más canales de iones. Aquí, adaptamos citometría de flujo ensayos para proporcionar una cuantificación de la expresión de la proteína total y la superficie celular relativa de los canales iónicos recombinantes expresadas en células TSA-201.

Determinación de la superficie celular y Expresión relativa total de canales de iones recombinante mediante citometría de flujo

Nonlytic sistemas de expresión de células de insectos están infrautilizados para la producción, celular tráfico / localización, y el análisis funcional de proteínas recombinantes. A continuación, describimos métodos para generar vectores de expresión y la expresión de proteína transitoria posterior en líneas celulares de lepidópteros disponibles comercialmente. También se presenta la co-localización de las acuaporinas de Bemisia tabaci con proteínas marcadoras fluorescentes subcelulares.

Expresión transitoria y localización celular de proteínas recombinantes en células cultivadas de insectos

Aquí, presentamos un protocolo para la modulación de la expresión transgénica mediante interruptor gen singular de pEUI(+) tratamiento de tebufenozide.

Un ecdisona basada en Receptor Singular gen interruptor para deliberada expresión del transgén con robustez, reversibilidad y filtración insignificante

Aquí presentamos un protocolo para desarrollar un sistema inducible negativo dominante, en el que cualquier proteína puede ser condicional inactivada por overexpressing reversiblemente una versión mutante dominante negativo de él.

Inhibición de la proteína inducible y Reversible dominante negativo (DN)

Este estudio describe un método para experimentos de alto rendimiento utilizando una matriz de LED impresa en 3D para optimizar la expresión génica inducible por luz en células HEK293T.

Optimización rápida de un sistema inducible por luz para controlar la expresión génica de mamíferos

Aprende a controlar la expresión de canales iónicos mediante transfección transitoria inducible en sistemas heterólogos. Este método optimiza la farmacología de canales iónicos con resultados reproducibles y tiempos reducidos.

Expresión Ion Channel controlable a través de la transfección transitoria inducible

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