Expresión Ion Channel controlable a través de la transfección transitoria inducible

El objetivo general de este procedimiento es proporcionar una forma conveniente de controlar la expresión de canales iónicos en sistemas heterólogos, evitando al mismo tiempo complicaciones prolongadas en el cultivo celular. Proporcionando así una forma de controlar las condiciones entre experimentos y generar resultados más replicables. Este método puede ayudar a facilitar la investigación en el campo de los canales iónicos.

Como la caracterización de las propiedades del canal en la farmacología. Dado que los métodos actuales son complejos o muestran una expresión de proteínas inconsistente. La principal ventaja de esta técnica es que podemos lograr niveles de expresión controlados de una amplia variedad de proteínas adaptadas a experimentos individuales en un tiempo relativamente corto.

Para comenzar este procedimiento, transfiera las celdas TREX 293 a una placa de 12 pocillos preparada con 0,9 mililitros de DMEM completo por pocillo para generar un 50 por ciento de confluencia. E incubar las células durante la noche a 37 grados centígrados en una incubadora de CO2. A continuación, prepare una mezcla de transfección compuesta por DMEM, el gen de interés, que se muestra aquí, TRPV1, un plásmido inerte, y el reactivo de tranfección de lípidos.

Para experimentos electrofisiológicos, incluya EGFP en el plásmido de expresión de mamíferos en el cóctel de transfección para visualizar las células que se someten con éxito a la transfección. Incubar la mezcla de transfección a temperatura ambiente durante 30 minutos. A continuación, transfecte las células pipeteando la mezcla de transfección gota a gota sobre las células plateadas en la placa de 12 pocillos.

Agite la placa vigorosamente para asegurar una dispersión homogénea del ADN y el reactivo de transfección. Después, incubar las células transfectadas durante la noche a 27 grados centígrados. A la mañana siguiente, si realiza electrofisiología, confirme que las células se han transfectado con éxito observando la señal fluorescente de EGFP bajo una lámpara UV.

Si realiza electrofisiología, transfiera las celdas de la placa de 12 pocillos a los cubreobjetos recubiertos de PDL en 500 microlitros de DMEM completo. Si realiza imágenes de calcio, detecte aproximadamente 20.000 células en cámaras de imágenes de calcio recubiertas de PDL. En este procedimiento, prepare una solución madre de doxiciclina a un miligramo por mililitro en agua bidestilada.

Proteja la solución madre de la luz a cuatro grados centígrados durante un máximo de tres semanas. Para el almacenamiento a largo plazo, mantenga la solución madre de doxiciclina a menos 20 grados centígrados. A continuación, prepare la solución fresca de doxiciclina en DMEM completo.

Y calentarlo a 37 grados centígrados. Para registros electrofisiológicos, pipetear 500 microlitros de solución de doxiciclina a dos microgramos por mililitro en cada pocillo para hacer una concentración final de doxiciclina a un microgramo por mililitro. Para obtener imágenes de calcio, agregue 100 microlitros de solución de doxiciclina a tres microgramos por mililitro a cada pocillo para obtener una concentración final de doxiciclina de un microgramo por mililitro.

Incubar la muestra durante el tiempo deseado para la inducción a 37 grados centígrados y cinco por ciento de CO2. Para calibrar la expresión de la proteína a través de imágenes de calcio, prepare la solución de Ringer y caliéntela a 37 grados Celsius. Para ayudar a dispersar los ésteres de AM, los indicadores de iones fluroescentes, como Fura-2 en soluciones aquiosas, preparan una solución de F-127 no iónico en DMSO.

Caliente la solución a 27 grados centígrados hasta que el F-127 no iónico se disuelva. A continuación, almacene la solución no iónica de F-127 a temperatura ambiente y caliéntela de nuevo a 37 grados centígrados antes de usarla. Después de eso, prepare una solución de carga de Fura-2 AM a partir de la solución de Ringer, complementada con dos o tres micromolares de Fura-2 AM, 02 miligramos por mililitro de F-127 no iónico y 10 milimolares de D-glucosa.

A continuación, aspire el medio de las celdas de las cámaras y sustitúyalo por una solución de carga Fura-2 AM. Incubar las células durante 60 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. A continuación, aspire la solución Fura-2 AM.

Y lave las células con Ringer y una solución de D-glucosa de 10 milimolares para eliminar el tinte celular adicional. Deje 200 microlitros de solución de Ringer y 10 milimolares de D-glucosa en cada uno. E incubarlo durante 30 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad.

Después de 30 minutos, coloque la cámara en la platina sobre la pieza de la nariz del microscopio y asegúrela con un soporte. A continuación, calcule y prepare una concentración de trabajo del agonista específico de TRPV1 capsaisina de acuerdo con la concentración final deseada. A continuación, encienda la lámpara, la cámara y el microscopio, y seleccione el filtro Fura-2 para detectar la emisión a una longitud de onda de 510 nanómetros.

Ajuste el aumento deseado y enfoque las celdas en el campo seleccionado manipulando estos parámetros con las perillas del microscopio. En la oscuridad, reste la luz de fondo y establezca el tiempo de exposición. Ajuste el muestreo de imágenes a la velocidad deseada.

A continuación, comience registrando la respuesta de fluorescencia de las células cargadas de Fura-2 excitándolas a longitudes de onda de 340 nanómetros y 380 nanómetros. La relación de 340 a 380 señales es un indicador de la concentración de calcio intracelular y, por lo tanto, también de la actividad de TRPV1. Posteriormente, se añadieron dos micromolares de capsaicina en 200 microlitros de solución de Ringer para crear una concentración de saturación final de un micromolar de capsaicina con el fin de evaluar el nivel de expresión de TRPV1 y analizar la respuesta de TRPV1.

Para determinar el tiempo de inducción ideal para la grabación de un solo canal, primero prepare el baño y las soluciones de pipeta. A continuación, prepare unas pipetas de vidrio, pulidas al fuego con una resistencia de 10 a 12 megaohmios. Realice la pinza de parche de celda completa creando un sello en la membrana de la celda objetivo.

Posteriormente, establezca el potencial de retención en menos 40 milivoltios. Y romper la membrana aplicando presión negativa. A continuación, con el micromanipulador, levante la pipeta con el parche de mebrane para separarla de la célula.

A continuación, coloque el sistema de profusión directamente junto a la pipeta que contiene el parche de membrana. Baje el filtro Bessel y la ganancia de salida a dos a cinco killahurtz y 10 amperios respectivamente. Después de eso, profusa las concentraciones saturantes de agonista en el parche de membrana.

A continuación, analice el número de parches de un solo canal registrados con éxito en comparación con el tiempo de inducción aplicado a las células y ajuste el tiempo de inducción de acuerdo con los resultados deseados. Aquí se muestran las imágenes pseudo coloreadas de las células TREX 293 que expresan transitoriamente RTRPV1, antes y después de la aplicación de capsaicina. Y aquí están los cambios correspondientes de los niveles de calcio intracelular con el tiempo en las células TREX 293 tratadas y transfectadas.

Cada gráfico representa un promedio de 50 celdas. La tasa de éxito del parche de un solo canal en las grabaciones TRPV1 depende del tiempo de inducción. Aquí están las trazas actuales de parches de células TREX 293 que expresan transitoriamente el RTRPV1 después de dos horas y cuatro horas de inducción.

Y este gráfico describe el número de canales en un parche después del tiempo de inducción indicado. Esta técnica, nos puede dar el análisis de una proteína con expresión controlada dentro de las 12 horas posteriores a la transfección si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar estandarizar las concentraciones de transfección y el tiempo de inducción para diferentes proteínas.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo producir un sistema de expresión controlable de una manera eficiente en el tiempo para el ion de su elección.