Neonatal electroporación superficie pial

El objetivo general de este procedimiento es etiquetar y manipular genéticamente los progenitores neurales de la superficie de la cáscara. Esto se logra insertando primero una pipeta de vidrio llena de solución de ADN plasmático en la región de la superficie de la cáscara. El segundo paso es inyectar el ADN en el espacio meníngeo, superpuesto a la superficie de la cáscara.

A continuación, los electrodos se orientan para suministrar adecuadamente corriente a la superficie de la cáscara. El paso final es que el ADN se electropora en los progenitores de la superficie de la cáscara mediante la aplicación de corriente. En última instancia, este método se puede combinar con otras técnicas para mostrar la historia natural y los determinantes moleculares de la superficie de la cáscara, la proliferación, la migración y/o la diferenciación de los progenitores neuronales.

Las principales ventajas de esta técnica sobre los métodos existentes, como la transducción viral, es que la electroporación es más segura, más flexible y no requiere la creación de partículas o envases de virus. Este método puede responder a preguntas clave en el campo de las células madre neurales y progenitoras, como cuál es la contribución de estos progenitores de la superficie de la cáscara al tejido, la histogénesis y la función del circuito neuronal. Para empezar, utilice un extractor de pipetas para formar pipetas a partir de tubos capilares de vidrio una vez extraídos, corte la punta con unas tijeras afiladas.

A continuación, prepare una solución madre verde rápida al 1% con agua filtrada sin nucleasas. Después de diluir el tampón EDTA de interés de ADN plasmático libre de endotoxinas, combínelo en las proporciones adecuadas con la solución verde rápida al 1%. Con una pipeta estándar, coloque la cantidad deseada de mezcla de plásmidos que se va a inyectar en un trozo de película de cera de parafina como referencia.

A continuación, con un microinyector, inserte con cuidado la pipeta de vidrio ensamblada en el tubo que contiene la mezcla de plásmidos. Evite tocar la punta con los bordes del tubo para evitar que se rompa. Aspire la solución en la pipeta volviendo lentamente a marcar el dial de transferencia.

Una vez que se haya cargado un volumen suficiente, marque hacia adelante hasta que la presión vuelva a la posición neutra de cero. Héctor Pascals. A continuación, coloque la punta junto a la inyección de referencia y utilice el pedal del microinyector para expulsar un volumen.

Ajustar la presión hasta que la cantidad sea igual al volumen de referencia pipeteado previamente. Después de calibrar el volumen de inyección, recupere los animales para la inyección de plásmidos. Una vez que se confirme la profundidad de la anestesia, sostenga al cachorro con el pulgar y el índice de la mano menos dominante.

Use la mano dominante para apuntar a la región deseada, los hemisferios corticales y otras estructuras superficiales, como los colículos superiores, deben ser fácilmente visibles. Una vez que se haya identificado la ubicación correcta, inserte la pipeta más allá de la piel y el cráneo. Teniendo cuidado de evitar las arterias cerebrales.

Para apuntar a la superficie de la cáscara inmediatamente deje de avanzar la pipeta Tan pronto como se haya penetrado el cráneo con la punta de la pipeta en la posición correcta, inyecte la solución plásmida usando el pedal del microinyector Después de la inyección, retire con cuidado la pipeta. Evite que la punta se seque y se obstruya entre inyecciones colocándola en las gotas de prueba ubicadas en la película de parafina. Repita estos pasos hasta que se inyecten todas las crías para aumentar la conductancia y evitar quemaduras en la piel.

Cubra tres pinzas de platino TRO de tres milímetros con gel de electroporación. A continuación, ajuste la configuración electro para las inyecciones en la corteza. Coloque la sonda cargada negativamente sobre el área inyectada y la sonda cargada positivamente alrededor de la región contralateral debajo del ojo.

La orientación del electrodo debe estar en un ángulo de 45 a 60 grados con respecto a la línea media. Use el pedal para disparar la corriente y mantenga las TRO de la pinza en su lugar durante tres a cinco pulsos. Dependiendo de la edad y el peso del cachorro, los pulsos deben dirigirse al ADN en las células subyacentes de la superficie de la cáscara.

El polo negativo se puede barrer sobre el área de inyección. Entre pulsos o se puede emplear un electrodo más grande para aumentar el área eléctrica inmediatamente después de la electroporación, limpie cuidadosamente el gel de las crías y colóquelas bajo una lámpara de calor durante aproximadamente cinco minutos. Los cachorros perderán agudamente su rosado rojizo natural en los minutos posteriores a la electroporación debido a la cianosis.

Observe a las crías para la recuperación del color natural y el inicio del movimiento normal antes de devolverlas a sus jaulas o inyecciones en el colo superior. Localice la región objetivo justo detrás y lateral de Lambda y aproximadamente en la línea media, siguiendo los mismos pasos que se acaban de demostrar. Con inyecciones exitosas, la mezcla de plásmidos llena naturalmente los contornos del colo superior.

Cuando se opera electro después de inyecciones de colos superiores, coloque la sonda cargada negativamente del electrodo sobre el área inyectada y la sonda cargada positivamente alrededor del ojo, el hocico o la barbilla. En este caso, la orientación del electrodo está en un ángulo de 25 a 40 grados con respecto a la línea media. Esta imagen muestra la corteza lateral dorsal después de la electroporación de plásmidos reporteros fluorescentes que expresan trébol marcado con membrana en verde y bfp marcado.

Dos proteínas nucleares se muestran aquí en pseudocolor rojo. Se encuentran dendritas extensas en esta interneurona cortical aproximadamente dos meses después de la electroporación. Las células positivas para EGFP son positivas para BRDU, lo que indica que estaban proliferando durante el procedimiento de electroporación.

Al intentar esta técnica, es importante centrarse en la orientación adecuada de la superficie de la cáscara para evitar la interrupción de la corteza subyacente o la vasculatura.