Neonatal electroporación superficie pial
7 de mayo de 2014
La superficie pial es una zona de progenitor único en el sistema nervioso central que está recibiendo cada vez más atención. En esto, detallamos un método para la manipulación genética rápida de esta zona progenitor utilizando un método de electroporación modificado. Este procedimiento se puede utilizar para investigaciones celulares y moleculares de los linajes de células y vías de señalización implicadas en la diferenciación celular y para dilucidar el destino y las propiedades de las células hijas.
El objetivo general de este procedimiento es etiquetar y manipular genéticamente los progenitores neurales de la superficie de la cáscara. Esto se logra insertando primero una pipeta de vidrio llena de solución de ADN plasmático en la región de la superficie de la cáscara. El segundo paso es inyectar el ADN en el espacio meníngeo, superpuesto a la superficie de la cáscara.
A continuación, los electrodos se orientan para suministrar adecuadamente corriente a la superficie de la cáscara. El paso final es que el ADN se electropora en los progenitores de la superficie de la cáscara mediante la aplicación de corriente. En última instancia, este método se puede combinar con otras técnicas para mostrar la historia natural y los determinantes moleculares de la superficie de la cáscara, la proliferación, la migración y/o la diferenciación de los progenitores neuronales.
Las principales ventajas de esta técnica sobre los métodos existentes, como la transducción viral, es que la electroporación es más segura, más flexible y no requiere la creación de partículas o envases de virus. Este método puede responder a preguntas clave en el campo de las células madre neurales y progenitoras, como cuál es la contribución de estos progenitores de la superficie de la cáscara al tejido, la histogénesis y la función del circuito neuronal. Para empezar, utilice un extractor de pipetas para formar pipetas a partir de tubos capilares de vidrio una vez extraídos, corte la punta con unas tijeras afiladas.
A continuación, prepare una solución madre verde rápida al 1% con agua filtrada sin nucleasas. Después de diluir el tampón EDTA de interés de ADN plasmático libre de endotoxinas, combínelo en las proporciones adecuadas con la solución verde rápida al 1%. Con una pipeta estándar, coloque la cantidad deseada de mezcla de plásmidos que se va a inyectar en un trozo de película de cera de parafina como referencia.
A continuación, con un microinyector, inserte con cuidado la pipeta de vidrio ensamblada en el tubo que contiene la mezcla de plásmidos. Evite tocar la punta con los bordes del tubo para evitar que se rompa. Aspire la solución en la pipeta volviendo lentamente a marcar el dial de transferencia.
Una vez que se haya cargado un volumen suficiente, marque hacia adelante hasta que la presión vuelva a la posición neutra de cero. Héctor Pascals. A continuación, coloque la punta junto a la inyección de referencia y utilice el pedal del microinyector para expulsar un volumen.
Ajustar la presión hasta que la cantidad sea igual al volumen de referencia pipeteado previamente. Después de calibrar el volumen de inyección, recupere los animales para la inyección de plásmidos. Una vez que se confirme la profundidad de la anestesia, sostenga al cachorro con el pulgar y el índice de la mano menos dominante.
Use la mano dominante para apuntar a la región deseada, los hemisferios corticales y otras estructuras superficiales, como los colículos superiores, deben ser fácilmente visibles. Una vez que se haya identificado la ubicación correcta, inserte la pipeta más allá de la piel y el cráneo. Teniendo cuidado de evitar las arterias cerebrales.
Para apuntar a la superficie de la cáscara inmediatamente deje de avanzar la pipeta Tan pronto como se haya penetrado el cráneo con la punta de la pipeta en la posición correcta, inyecte la solución plásmida usando el pedal del microinyector Después de la inyección, retire con cuidado la pipeta. Evite que la punta se seque y se obstruya entre inyecciones colocándola en las gotas de prueba ubicadas en la película de parafina. Repita estos pasos hasta que se inyecten todas las crías para aumentar la conductancia y evitar quemaduras en la piel.
Cubra tres pinzas de platino TRO de tres milímetros con gel de electroporación. A continuación, ajuste la configuración electro para las inyecciones en la corteza. Coloque la sonda cargada negativamente sobre el área inyectada y la sonda cargada positivamente alrededor de la región contralateral debajo del ojo.
La orientación del electrodo debe estar en un ángulo de 45 a 60 grados con respecto a la línea media. Use el pedal para disparar la corriente y mantenga las TRO de la pinza en su lugar durante tres a cinco pulsos. Dependiendo de la edad y el peso del cachorro, los pulsos deben dirigirse al ADN en las células subyacentes de la superficie de la cáscara.
El polo negativo se puede barrer sobre el área de inyección. Entre pulsos o se puede emplear un electrodo más grande para aumentar el área eléctrica inmediatamente después de la electroporación, limpie cuidadosamente el gel de las crías y colóquelas bajo una lámpara de calor durante aproximadamente cinco minutos. Los cachorros perderán agudamente su rosado rojizo natural en los minutos posteriores a la electroporación debido a la cianosis.
Observe a las crías para la recuperación del color natural y el inicio del movimiento normal antes de devolverlas a sus jaulas o inyecciones en el colo superior. Localice la región objetivo justo detrás y lateral de Lambda y aproximadamente en la línea media, siguiendo los mismos pasos que se acaban de demostrar. Con inyecciones exitosas, la mezcla de plásmidos llena naturalmente los contornos del colo superior.
Cuando se opera electro después de inyecciones de colos superiores, coloque la sonda cargada negativamente del electrodo sobre el área inyectada y la sonda cargada positivamente alrededor del ojo, el hocico o la barbilla. En este caso, la orientación del electrodo está en un ángulo de 25 a 40 grados con respecto a la línea media. Esta imagen muestra la corteza lateral dorsal después de la electroporación de plásmidos reporteros fluorescentes que expresan trébol marcado con membrana en verde y bfp marcado.
Dos proteínas nucleares se muestran aquí en pseudocolor rojo. Se encuentran dendritas extensas en esta interneurona cortical aproximadamente dos meses después de la electroporación. Las células positivas para EGFP son positivas para BRDU, lo que indica que estaban proliferando durante el procedimiento de electroporación.
Al intentar esta técnica, es importante centrarse en la orientación adecuada de la superficie de la cáscara para evitar la interrupción de la corteza subyacente o la vasculatura.
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Resumen
Este artículo presenta un método para la manipulación genética rápida de la zona de progenitores neurales en la superficie pial del sistema nervioso central. La técnica implica la electroforesis para facilitar investigaciones celulares y moleculares de las líneas celulares de progenitores y las vías de diferenciación.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Biología celular
- Manipulación genética
Antecedentes
- La superficie pial actúa como una zona de progenie única en el sistema nervioso central.
- Comprender esta región es fundamental para obtener conocimientos sobre el desarrollo neural.
- Las técnicas de manipulación genética pueden mejorar la investigación en la diferenciación celular.
- La electroporación es un método valioso para introducir ADN en las células.
Objetivo del estudio
- Etiquetar y manipular genéticamente a los progenitores neurales de la superficie pial.
- Investigar las vías de señalización implicadas en la diferenciación celular.
- Elucidar el destino y las propiedades de las células hijas.
Métodos Utilizados
- Inserción de una pipeta de vidrio cargada con solución de ADN plasmídico en la región de la superficie pial.
- Inyección de ADN en el espacio meníngeo que se encuentra por encima de la superficie pial.
- Orientación de los electrodos para aplicar corriente sobre la superficie pial.
- Aplicación de corriente para electroportar el ADN hacia las células progenitoras.
Resultados principales
- El método permite una manipulación genética eficaz de los progenitores neurales.
- Puede combinarse con otras técnicas para estudios integrales.
- Facilita la exploración de la proliferación, migración y diferenciación de los progenitores.
- Mejora la comprensión de los determinantes moleculares en el desarrollo neural.
Conclusiones
- Este método de electropermeabilización es una herramienta prometedora para la investigación en neurociencia.
- Proporciona información sobre la dinámica de las células progenitoras neuronales.
- Estudios futuros pueden aprovechar esta técnica para comprender mejor el desarrollo del sistema nervioso central.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La interrogación genética de los progenitores de la superficie pial aborda un vacío crítico en la biología del desarrollo del SNC, permitiendo descartar de forma mecanicista hipótesis sobre células madre neurales. Este método apoya la validación de objetivos al proporcionar un enfoque rápido y económico para investigar las contribuciones de los progenitores a la neurogénesis y la gliogénesis. Mejora la confianza predictiva en las fases iniciales del descubrimiento al facilitar el rastreo de linajes y la manipulación funcional sin los retrasos asociados a la producción viral.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite investigar hipótesis terapéuticas sobre los roles de los progenitores en la superficie pial en la histogénesis del tejido y la función del circuito neural.
- Valor operativo: Ofrece una alternativa que ahorra tiempo frente a la transducción viral, evitando los pasos de producción y empaquetamiento del virus.
- Valor estratégico: Facilita la reducción de riesgos biológicos de los blancos progenitores mediante etiquetado y manipulación genéticos directos.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Valor científico: Genera resultados cuantitativamente evaluable, como métricas de proliferación, migración y diferenciación de progenitores.
- Valor operativo: Utiliza parámetros estandarizados de electroporación (por ejemplo, ángulo del electrodo de 45–60°, 3–5 pulsos) para una entrega reproducible entre muestras.
- Valor estratégico: Permite la preparación escalable de sistemas biológicos validados para ensayos posteriores de compuestos o vías metabólicas.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Valor científico: Apoya la modelización de sistemas relevantes para enfermedades mediante el seguimiento del destino de los progenitores en contextos de neurogénesis y gliogénesis perinatales y adultas.
- Valor operativo: Permite combinarse con técnicas complementarias (por ejemplo, marcado con BrdU) para validar los resultados de proliferación y diferenciación.
- Valor estratégico: Mejora la alineación de biomarcadores traslacionales al vincular la manipulación de progenitores con los determinantes moleculares del desarrollo del SNC.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
El método se integra en el continuo de descubrimiento desde la prueba de hipótesis sobre dianas hasta la validación preclínica, permitiendo la refinación iterativa de estrategias terapéuticas basadas en progenitores.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis sobre las contribuciones de los progenitores a la histogénesis y a la función circuital mediante manipulación genética directa.
- Selección: Proporciona sistemas listos para ensayos con lecturas cuantificables sobre la proliferación y migración de progenitores tras la electrotransferencia.
- Análisis: Permite la medición de variables dependientes, como la co-localización de células BrdU+ y la expresión de reporteros fluorescentes, para la comparación entre condiciones.
- Investigación Traducional: Conecta el descubrimiento con la continuidad preclínica mediante la modelización del comportamiento de progenitores en contextos del SNC perinatales y adultos.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma reutilizable para la interrogación genética a través de diferentes etapas del desarrollo y modelos de lesión.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Reduce la ambigüedad mecanicista en hipótesis dirigidas a progenitores mediante acceso genético directo.
- Valor operativo: Ofrece estandarización y flexibilidad en comparación con los métodos virales, sin necesidad de producción de partículas.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance o interrupción al permitir una validación rápida y rentable de objetivos en poblaciones de progenitores del SNC.
- Impacto en la cartera: Facilita la priorización ajustada al riesgo de objetivos progenitores basada en los resultados de manipulación funcional.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en microcirugía y manejo de animales embrionarios y posnatales para una correcta localización con la pipeta.
- Depende de equipos de electroforesis y pinzas de platino recubiertas con gel para la aplicación de corriente.
- Necesita la estandarización del volumen de inyección y la orientación de los electrodos (25–60° respecto a la línea media) entre diferentes usuarios.
- Implica consideraciones de adaptación según la edad, el peso de las crías y las regiones diana (por ejemplo, corteza frente a colículos superiores).
- Está limitado por la necesidad de evitar la alteración vascular y el daño cortical durante la penetración de tejidos superficiales.
