Name: Diferenciación de cribado de alto contenido y análisis de maduración de cultivos de células precursoras de oligodendrocitos derivados de células madre neurales fetales y adultas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-03-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 36 s
Description: Aprende a diferenciar células precursoras de oligodendrocitos en cultivos mixtos con astrocitos usando técnicas de cribado de alto contenido. Este método permite estudiar mielinización y remielinización en condiciones patológicas.

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Con el apoyo del proyecto MIUR National Technology Clustersproject IRMI (CTN01_00177_888744), y Regione Emilia-Romagna, Mat2Rep, POR-FESR 2014-2020.
Un agradecimiento especial a la Fundación IRET por acoger el trabajo experimental.

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<li>Fernández, M., Baldassarro, V. A., Sivilia, S., Giardino, L., Calzà, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation+severely+alters+thyroid+hormone+signaling+in+the+central+nervous+system+during+experimental+allergic+encephalomyelitis+in+rat%3A+direct+impact+on+OPCs+differentiation+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Inflammation severely alters thyroid hormone signaling in the central nervous system during experimental allergic encephalomyelitis in rat: direct impact on OPCs differentiation failure.</a> Glia. 64, 1573-1589 (2016).</li>
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<li>Baldassarro, V. A., Marchesini, A., Giardino, L., Calzà, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PARP+activity+and+inhibition+in+fetal+and+adult+Oligodendrocyte+Precursor+Cells%3A+effect+on+cell+survival+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">PARP activity and inhibition in fetal and adult Oligodendrocyte Precursor Cells: effect on cell survival and differentiation.</a> Stem Cell Research. 22, 54-60 (2017).</li>
<li>Leong, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligodendrocyte+Progenitor+Cells+%28OPCs%29+from+adult+human+brain+expressed+distinct+microRNAs+compared+to+OPCs+in+development%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Oligodendrocyte Progenitor Cells (OPCs) from adult human brain expressed distinct microRNAs compared to OPCs in development.</a> Neurology. 82, (2014).</li>
<li>Bribián, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+heterogeneity+of+mouse+and+human+brain+OPCs%3A+relevance+for+preclinical+studies+in+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Medicine%22%5BJournal%5D)">Functional heterogeneity of mouse and human brain OPCs: relevance for preclinical studies in multiple sclerosis.</a> Journal of Clinical Medicine. 9, 1681(2020).</li>
<li>Jäkel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+Human+Oligodendrocyte+Heterogeneity+In+Multiple+Sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Altered Human Oligodendrocyte Heterogeneity In Multiple Sclerosis.</a> Nature. 566, 543-547 (2019).</li>
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<li>Baldassarro, V. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+death+in+pure-neuronal+and+neuron-astrocyte+mixed+primary+culture+subjected+to+oxygen-glucose+deprivation%3A+the+contribution+of+poly%28ADP-Ribose%29+polymerases+and+caspases%5BTitle%5D)+AND+%22Microchemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Cell death in pure-neuronal and neuron-astrocyte mixed primary culture subjected to oxygen-glucose deprivation: the contribution of poly(ADP-Ribose) polymerases and caspases.</a> Microchemical Journal. 136, 215-222 (2018).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

La naturaleza compleja de los procesos de mielinización/remielinización y los eventos desmielinizantes hace que el desarrollo de sistemas predictivos in vitro sea extremadamente desafiante. Los sistemas de cribado de fármacos in vitro más utilizados son en su mayoría líneas celulares humanas o cultivos PRIMARIOS PUROS DE OL, con un uso cada vez mayor de cocultivos u sistemas organotípicos más complejos15. Incluso si tales sistemas se combinan con tecnologías de alto contenido, los cultivos OL puro...

En el sistema nervioso central (SNC), las células formadoras de mielina (oligodendrocitos, OL) y sus precursores (células precursoras de oligodendrocitos, OPC) son responsables de la mielinización del desarrollo, un proceso que ocurre durante los períodos peri y postnatal, y del recambio y reparación de la mielina (remielinización) en la edad adulta1. Estas células están altamente especializadas, interactuando anatómica y funcionalmente con todos los demás componentes gliales y neuronales, lo que las convierte en una parte fundamental de la estructura y función del SNC.
Los eventos desmielinizantes están implicados en diferentes lesiones y enfermedades delSNC 2,y actúan principalmente sobre OPC y OL mediante mecanismos multifactoriales, tanto durante el desarrollo como en la edad adulta. Los precursores indiferenciados son impulsados por factores diferenciadores, principalmente la hormona tiroidea (TH), en un proceso sincronizado3 que lleva al OPC a reconocer y responder a estímulos específicos que inducen la proliferación, la migración al axón no mielinizado y la diferenciación en OL maduros que a su vez desarrollan la vaina de mielina4. Todos estos procesos están finamente controlados y ocurren en un entorno complejo.
Debido a la naturaleza compleja de los eventos de mielinización, remielinización y desmielinización, existe una gran necesidad de un método in vitro simplificado y confiable para estudiar los mecanismos subyacentes y desarrollar nuevas estrategias terapéuticas, centrándose en el principal actor celular: el OPC5.
Para que un sistema in vitro sea fiable, es necesario tener en cuenta una serie de factores: la complejidad del entorno celular, las diferencias intrínsecas celulares relacionadas con la edad, la diferenciación fisiológica mediada por TH, los mecanismos patológicos y la robustez de los datos6. De hecho, la necesidad insatisfecha en el campo es un modelo que imita la complejidad de la condición in vivo, no lograda con éxito mediante el uso de cultivos OPC puros aislados. Además, los dos componentes principales de los eventos desmielinizantes, la inflamación y la hipoxia/isquemia (HI), involucran directamente a otros componentes celulares que pueden afectar indirectamente la diferenciación fisiológica y la maduración de los OPC, un aspecto que no puede estudiarse en modelos in vitro demasiado simplificados.
Partiendo de un sistema de cultivo altamente predictivo, el desafío posterior y más general es la producción de datos robustos y confiables. En este contexto, el cribado de alto contenido basado en células (HCS) es la técnica más adecuada7,ya que nuestro objetivo es, en primer lugar, analizar todo el cultivo en un flujo de trabajo automático, evitando el sesgo de elegir campos representativos, y en segundo lugar obtener la generación automática y simultánea de datos de alto contenido basados en imágenes8.
Dado que la principal necesidad es lograr el mejor equilibrio entre la simplificación in vitro y la complejidad que imita in vivo, aquí presentamos un método altamente reproducible para la obtención de OPC derivadas de células madre neurales (NSC) aisladas del cerebro anterior fetal y de la zona subventricular adulta (SVZ). Este modelo in vitro abarca todo el proceso de diferenciación de OPC, desde NSC multipotente hasta OL maduro / mielinizante, de una manera fisiológica dependiente de TH. El cultivo resultante es un sistema dinámicamente diferenciador/madurador que da como resultado un cocultivo espontáneo que consiste principalmente en diferenciar OPCs y astrocitos, con un bajo porcentaje de neuronas. Este cultivo primario imita mejor el complejo entorno in vivo, mientras que su derivación de células madre permite realizar manipulaciones simples para obtener el enriquecimiento del linaje celular deseado.
A diferencia de otras estrategias de cribado farmacológico mediante líneas celulares o cultivos puros de OPC primarios, el método aquí descrito permite estudiar el efecto de interferentes patológicos o moléculas terapéuticas en un entorno complejo, sin perder el foco en el tipo celular deseado. El flujo de trabajo de HCS descrito permite un análisis de la viabilidad celular y la especificación del linaje, así como la muerte celular específica del linaje y los parámetros morfológicos.

<table><tbody><tr><td>Placas de 96 pocillos - sin tratar</td><td>Suplemento de NUNC</td><td>267313</td><td></td></tr><tr><td>B27 (100x)</td><td>GIBCO</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF)</td><td>GIBCO</td><td>PHG0024</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>Factor neurotrópico ciliar (CNTF)</td><td>GIBCO</td><td>PHC7015</td><td></td></tr><tr><td>DMEM sin glucosa</td><td>GIBCO</td><td>A14430-01</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 GlutaMAX</td><td>GIBCO</td><td>31331-028</td><td></td></tr><tr><td>DNase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5025-150KU</td><td></td></tr><tr><td>EBSS</td><td>GIBCO</td><td>14155-048</td><td></td></tr><tr><td>Factor de crecimiento epidérmico (EGF)</td><td>GIBCO</td><td>PHG6045</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>GIBCO</td><td>14170-088</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>GIBCO</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>hialuronidasa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3884</td><td></td></tr><tr><td>IFN-&gamma;</td><td>Origene</td><td>TP721239</td><td></td></tr><tr><td>IL-17A</td><td>Origene</td><td>TP723199</td><td></td></tr><tr><td>IL-1 y beta;</td><td>Origene</td><td>TP723210</td><td></td></tr><tr><td>IL-6</td><td>Origene</td><td>TP723240</td><td></td></tr><tr><td>laminina</td><td>GIBCO</td><td>23017-051</td><td></td></tr><tr><td>N-acetil-L-cisteína</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9165</td><td></td></tr><tr><td>N2 suplemento (50x)</td><td>GIBCO</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>Tampón de disociación no enzimática</td><td>GIBCO</td><td>13150-016</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>GIBCO</td><td>70011-036</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina / Estreptomicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>Factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF-AA)</td><td>GIBCO</td><td>PHG0035</td><td></td></tr><tr><td>poli-D,L-ornitina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4957</td><td></td></tr><tr><td>TGF-&beta; 1</td><td>Orígenes</td><td>TP720760</td><td></td></tr><tr><td>TNF-&alpha;</td><td>Origene</td><td>TP723451</td><td></td></tr><tr><td>Triyodotironina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T2752-1G</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1426</td><td></td></tr></tbody></table>

diferenciación de cribado de alto contenido y análisis de maduración de cultivos de células precursoras de oligodendrocitos derivados de células madre neurales fetales y adultas

High-Content Screening Differentiation and Maturation Analysis of Fetal and Adult Neural Stem Cell-Derived Oligodendrocyte Precursor Cell Cultures

El principal obstáculo en el desarrollo de técnicas de cribado farmacológico para evaluar la eficacia de las estrategias terapéuticas en enfermedades complejas es lograr un equilibrio entre la simplificación in vitro y la recreación del complejo entorno in vivo, junto con el objetivo principal, compartido por todas las estrategias de cribado, de obtener datos robustos y fiables, altamente predictivos para la traducción in vivo.
En el campo de las enfermedades desmielinizantes, la mayoría de las estrategias de detección de fármacos se basan en líneas celulares inmortalizadas o cultivos puros de células precursoras de oligodendrocitos primarios (OPC) aisladas de animales recién nacidos, lo que lleva a fuertes sesgos debido a la falta de diferencias relacionadas con la edad y de cualquier condición o complejidad patológica real.
Aquí mostramos la configuración de un sistema in vitro destinado a modelar la diferenciación fisiológica / maduración de las OPC derivadas de células madre neurales (NSC), fácilmente manipulables para imitar las condiciones patológicas típicas de las enfermedades desmielinizantes. Además, el método incluye el aislamiento de cerebros fetales y adultos, dando un sistema que se diferencia dinámicamente de los OPC a los oligodendrocitos maduros (OL) en un cocultivo espontáneo que también incluye astrocitos. Este modelo se asemeja fisiológicamente al proceso de mielinización y reparación de mielina mediado por hormona tiroidea, lo que permite la adición de interferentes patológicos que modelan los mecanismos de la enfermedad. Mostramos cómo imitar los dos componentes principales de las enfermedades desmielinizantes (es decir, hipoxia / isquemia e inflamación), recreando su efecto sobre la mielinización del desarrollo y la reparación de la mielina adulta y teniendo en cuenta todos los componentes celulares del sistema en todo momento, mientras nos centramos en diferenciar los OPC.
Este modelo mixto espontáneo, junto con las tecnologías de cribado de alto contenido basadas en células, permite el desarrollo de un sistema de cribado farmacológico robusto y fiable para estrategias terapéuticas dirigidas a combatir los procesos patológicos implicados en la desmielinización y a inducir la remielinización.

La primera fase del cultivo puede variar en duración, dependiendo de la densidad de siembra y de si las esferas son de origen fetal o adulto. Además, las oligoesferas muestran una población reducida que se duplica en comparación con las neuroesferas(Figura 1B). Además, la producción de esferas a partir de tejido adulto es más lenta y puede tomar de 2 a 3 semanas generar oligoesferas en comparación con las fetales que pueden tardar de 1 a 2 semanas, dependiendo de la densidad de siembra.
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Describimos la producción de cultivos mixtos de astrocitos y células precursoras de oligodendrocitos derivadas de células madre neurales fetales o adultas que se diferencian en oligodendrocitos maduros, y el modelado in vitro de estímulos nocivos. El acoplamiento con una técnica de detección de alto contenido basada en células construye un sistema de detección de drogas confiable y robusto.

Diferenciación de cribado de alto contenido y análisis de maduración de cultivos de células precursoras de oligodendrocitos derivados de células madre neurales fetales y adultas

The main hurdle in developing drug screening techniques for assessing the efficacy of therapeutic strategies in complex diseases is striking a balance ...

El protocolo combina el aislamiento específico de la edad de cultivos mixtos espontáneos derivados de células madre neurales que contienen células precursoras de oligodendrocitos diferenciadores y astrocitos, ensayos que imitan condiciones patológicas y lecturas robustas y de alto contenido. Estas características permiten estudiar diferencialmente la mielinización del desarrollo y la remielinización adulta en condiciones fisiológicas y patológicas y en un microambiente que tiene en cuenta la contribución de los astrocitos. Para el aislamiento de células madre neurales de los cerebros anteriores fetales embrionarios del día 13.5 al 14.5, coloque las cabezas de los embriones en una placa de Petri limpia con PBS helado y use fórceps para eliminar la piel del cráneo bajo aumento.Una vez que el cerebro esté visible y despejado de piel, use fórceps para exprimir el cerebro del cráneo y extirpar el cerebelo. Use las pinzas para quitar las meninges y coloque el tejido aislado en el tampón de disociación no enzimática. Cuando se haya aislado todo el tejido cerebral, extraiga de dos a tres muestras en 150 microlitros de tampón de disociación no enzimática por tubo de 1,5 mililitros e incube los tubos durante 15 minutos a 37 grados centígrados con agitación continua.Al final de la incubación, agregue 850 microlitros de medio estándar a cada tubo y pipeta para mezclar hasta que la suspensión esté libre de grumos. Si el tejido no disociado todavía es visible, deje que las muestras descansen durante dos minutos para permitir que los tejidos se asienten en la parte inferior de los tubos. Cuando se completa la disociación, placas de células a una densidad de 10 a 50 células por microlitro en 10 a 30 mililitros de concentración de medio de neuroesfera en un matraz T25 o T45, y coloque el matraz en la incubadora de cultivo celular en posición vertical para evitar la unión celular.de ratones adultos de 2,5 meses de edad, coloque cerebros de cuatro a cinco ratones adultos en un tubo de 50 mililitros de HBSS helado y coloque un cerebro, ventral hacia abajo, en la dirección rostral-caudal en un matraz estéril cubierto de papel de aluminio lleno de menos 20 grados centígrados durante la noche con agua fría. Use una cuchilla de afeitar para quitar los bulbos olfativos y cortar de dos a tres rodajas coronales de un milímetro de grosor desde la corteza hasta el quiasma óptico. Coloque las rodajas sobre la superficie fría en una posición ventro-dorsal e identifique el cuerpo calloso y los dos ventrículos laterales.Usando la ampliación, aísle las paredes de los ventrículos laterales, teniendo cuidado de no incluir trozos del cuerpo calloso, y coloque el tejido aislado en cinco a 10 mililitros de tampón de disociación enzimática durante una incubación de 15 minutos a 37 grados centígrados. Al final de la incubación, pipetee los tejidos al menos 50 veces antes de incubar las muestras a 37 grados centígrados durante 10 minutos adicionales. Al final de la incubación, neutralice la tripsina con cinco mililitros de medio de cultivo estándar y filtre la suspensión de tejido a través de un filtro de 70 micras.Centrifugar la solución filtrada durante cinco minutos a 400 veces g, y volver a suspender el pellet en solución de sacarosa para una segunda centrifugación. Al final de la centrifugación, vuelva a suspender el pellet en la solución de lavado de albúmina sérica bovina para otra centrifugación, luego vuelva a suspender el pellet en el medio de cultivo estándar para contar y colocar las células en un matraz vertical T-25 o T-45. Para la diferenciación primaria de la neuroesfera, agregue factores básicos de fibroblastos y crecimiento endotelial al cultivo de células madre neurales cada dos días.Cuando las neuroesferas alcanzan un diámetro de 100 a 500 micras, pasa las células por disociación mecánica de acuerdo con los protocolos estándar. Para la diferenciación de la oligoesfera, trate las células con factor de crecimiento básico de fibroblastos en el factor AA derivado de plaquetas cada dos días. Cuando las oligoesferas alcanzan un diámetro de 100 a 150 micras, disociar las esferas por disociación mecánica de acuerdo con los protocolos estándar y sembrar la suspensión celular a una densidad de 3000 células por centímetro cuadrado en placas recubiertas de laminina de poli-DL-ornitina.Después de tres días, reemplace el sobrenadante de cada cultivo con el mismo volumen de medio de diferenciación de oligodendrocitos. Para realizar una inducción de bloques de diferenciación mediada por la inflamación, después de la disociación de las neuroesferas y durante la producción de oligoesferas, agregue la mezcla de citoquinas de interés al medio de cultivo. Para inducir la muerte celular por privación de oxígeno-glucosa, dos días después de la siembra en las placas de múltiples pocillos, transfiera el sobrenadante de cada cultivo a los pocillos individuales de una placa de múltiples pocillos.Agregue la mitad del volumen del medio OGD a los pozos y transfiera los cultivos a una cámara de hipoxia hermética saturada con 95% de nitrógeno y 5% de dióxido de carbono. Coloque la cámara en la incubadora de cultivo celular. Después de tres horas, reemplace el medio en las cámaras con el medio apartado de la placa de cultivo de múltiples pozos.Después de verificar la calidad de la tinción celular, en el menú Adquisición del software de detección de alto contenido, seleccione Tiempo de exposición fijo y Mini escaneo, y seleccione 10 campos por pozo y dos pozos por condición experimental para permitir que los parámetros de análisis en el subconjunto de campos se establezcan para toda la placa. Siga el flujo de trabajo paso a paso para desarrollar todo el algoritmo. Seleccione Procesar imagen para cada canal y haga clic en Eliminación de fondo para seleccionar el nivel de señal deseado.Para identificar y seleccionar los núcleos por tinción nuclear, haga clic en Identificar objeto primario, ajuste el umbral para identificar núcleos individuales y haga clic en Validar objetos primarios para establecer los umbrales en función de las áreas y la posición del objeto. Haga clic en Identificar puntos para cada canal correspondiente a los marcadores de linaje específicos y establezca el ancho del valor del anillo en tres y la distancia en cero para permitir la identificación de la fluorescencia citoplasmática. Seleccione Niveles de referencia en el flujo de trabajo para crear el análisis y permitir el recuento automático de los núcleos condensados en función del tamaño nuclear y la intensidad de la tinción nuclear y de las células marcadoras positivas específicas en función de la fluorescencia citoplasmática identificada por el anillo y, a continuación, haga clic en Reproducir.Durante la primera fase del cultivo, las células madre neurales mantienen su expresión de nestina. La mayoría de las células también son NG2-positivas. Las células CNPasa positivas correspondientes a la etapa pre-oligodendrocitos son detectables de tres a seis días después de la inducción de diferenciación mediada por T3, mientras que los oligodendrocitos MADUROS MBP positivos aparecen en un porcentaje significativo después de seis a 12 días in vitro.El análisis de cribado de alto contenido permite la detección de células individuales dentro del cultivo a través de la tinción nuclear y el análisis de intensidad de fluorescencia. La composición del cultivo al final de la fase de diferenciación difiere en función de si los cultivos son de origen fetal o adulto, con cultivos fetales más sensibles a la diferenciación mediada por T3, y alcanzando un mayor porcentaje de oligodendrocitos maduros. Tenga en cuenta que cuando las células precursoras de oligodendrocitos derivadas de células madre neurales se siembran a una alta densidad, se agregan y los astrocitos que se replican producen rápidamente una capa celular confluente, lo que impide la observación de la forma característica de la red de araña de los oligodendrocitos maduros.El bloqueo de la diferenciación mediado por la inflamación induce una fuerte disminución de los oligodendrocitos pre y maduros, según lo detectado por la tinción de CNPasa y MBP en cultivos fetales y adultos. También se produce un aumento en el número de células precursoras de oligodendrocitos en cultivos adultos tratados con citoquinas. Mientras que las células precursoras de oligodendrocitos fetales y adultas muestran lo mismo a la exposición inflamatoria a citoquinas, solo los cultivos derivados del feto son sensibles a la toxicidad por privación de oxígeno y glucosa.El método se puede implementar con cualquier tipo de células precursoras de oligodendrocitos, proceso de interferencia de diferenciación y maduración, para probar nuevas estrategias destinadas a combatir enfermedades que afectan la mielinización o la remielinización.

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Neurociencia

Se describe una molécula basada en pequeñas protocolo para la diferenciación de las células madre embrionarias de ratón en células precursoras de oligodendrocitos (OPC). Este protocolo genera Olig2 + NG2 + OPC con alta eficiencia de 30 días de diferenciación. También describe un método para generar "picos" OPC que puede disparar potenciales de acción.

La diferenciación de células madre embrionarias en los precursores de oligodendrocitos

En este artículo se describen los métodos para obtener poblaciones enriquecidas de células precursoras de oligodendrocitos murinas (OPC) en cultivo primario, que se diferencian para producir oligodendrocitos maduros (MCO). Además, este informe se describen las técnicas para producir murino myelinating co-cultivos de siembra de los OPC del ratón sobre un lecho de neuritas de neuronas de ratón ganglio de la raíz dorsal (DRGNs).

Derivación de las Culturas enriquecido oligodendrocitos y neuronas oligodendrocitos / myelinating Co-culturas de Post-natal tejidos murinos

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Progenitor derivado de sistema de cultivo de oligodendrocitos de cerebro fetal humano

Este video muestra un protocolo detallado para aislar las paredes del ventrículo lateral del cerebro de ratón adulto y realizar la disociación enzimática del tejido para obtener células individuales. A continuación, estas células se someten a condiciones de cultivo específicas que potencian selectivamente la proliferación de células madre neurales y promueven su diferenciación en cocultivos de oligodendrocitos y astrocitos.

Obtención de un cultivo mixto de oligodendrocitos y astrocitos a partir de células madre neurales de ratón adulto

Este video demuestra el proceso de generación de células precursoras de oligodendrocitos (OPCs) a partir de células madre embrionarias humanas, seguido de la maduración de OPCs a oligodendrocitos. Este proceso de generación de oligodendrocitos abre numerosas vías para mejorar la investigación y el tratamiento de las enfermedades neurodegenerativas, incluido el Alzheimer.

Diferenciación de células madre embrionarias humanas en oligodendrocitos

Este video demuestra el establecimiento de un cocultivo de neuronas inducidas humanas (iNs) y células precursoras de oligodendrocitos inducidos (iOPCs). Las iNs se mezclan con iOPCs en un co-cultivo y luego se incuban para apoyar la maduración de ambas iNs en neuronas y de iOPCs en oligodendrocitos. Las neuronas forman conexiones sinápticas con otras neuronas y oligodendrocitos, mientras que los oligodendrocitos desarrollan vainas de mielina alrededor de los axones de las neuronas.

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Con la intención de caracterizar los cambios en los miRNAs en células madre neurales humanas diferenciadas (hNSCs) describimos la diferenciación de hNSC en un sistema tridimensional, la evaluación de los cambios en la expresión de microRNA por la matriz de PCR de miRNA, y el análisis computacional para la predicción de objetivos de miRNA y su validación por ensayo de luciferasa dual.

La diferenciación de una línea de células madre neurales humanas en las Tres Culturas de dimensiones, Genes Análisis de microARN y putativo objetivo

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Preparación de la rata progenitoras de oligodendrocitos culturas y cuantificación de Oligodendrogenesis Uso del análisis de fluorescencia de doble infrarrojo

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Aislamiento Inmunomagnética rápida y específica de los oligodendrocitos primarios de ratón

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Las interacciones neurona-glial en la neurodegeneración no se comprenden bien debido a herramientas y métodos inadecuados. Aquí, describimos protocolos optimizados para obtener neuronas inducidas, células precursoras de oligodendrocitos y oligodendrocitos a partir de células madre pluripotentes humanas y proporcionamos ejemplos de los valores de estos métodos para comprender las contribuciones específicas del tipo de célula en la enfermedad de Alzheimer.

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Diferenciación de cribado de alto contenido y análisis de maduración de cultivos de células precursoras de oligodendrocitos derivados de células madre neurales fetales y adultas (Video) | JoVE Journal

Diferenciación de cribado de alto contenido y análisis de maduración de cultivos de células precursoras de oligodendrocitos derivados de células madre neurales fetales y adultas

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