Name: Detección múltiple de la expresión génica en el cerebro intacto de Drosophila mediante hibridación in situ de fluorescencia iterativa asistida por expansión (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-05-02T13:05:00.000+00:00
Duration: 9 min 5 s
Description: Aprende el protocolo EASI-FISH para visualizar la expresión génica múltiple en cerebro intacto de Drosophila mediante hibridación in situ iterativa asistida por expansión. Este método permite mapear patrones espaciales de ARN con alta resolución.

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Agradecemos a Paul Tillberg por sus consejos sobre la dinámica de la microscopía de expansión, a Christina Christoforou por su ayuda con las disecciones cerebrales y a Geoffrey Meissner por sus comentarios críticos. Además, agradecemos a Tanya Wolff y Gerry Rubin, así como a Geoffrey Meissner y Wyatt Korff, por permitirnos incluir los resultados que se generaron como parte de dos estudios más grandes. Todo el trabajo se realizó en el Campus de Investigación Janelia y contó con el apoyo del Instituto Médico Howard Hughes a través de fondos para los equipos de proyectos MultiFISH y Fly-eFISH, Gerry Rubin y Recursos Técnicos del Proyecto.

Este protocolo se realizó en hembras adultas (5-6 días de edad) de Drosophila melanogaster, pero cualquier sexo o especie de Drosophila es aplicable. Para obtener recetas de anclaje de gel, consulte la Tabla complementaria 1; para la receta en gel, Tabla Suplementaria 2; y para otros reactivos EASI-FISH, Tabla Suplementaria 3. Para obtener una guía diaria de materiales y reactivos, consulte la Tabla complementaria 4. Para el soporte de gel de microscopio de lámina de luz, consulte el Archivo Suplementario 1. La Figura 1A-C muestra una representación esquemática de la incrustación de cerebros en geles antes de la expansión y la hibridación de la sonda (pasos 2.1 a 3.8). La figura 1D es una fotografía de los cerebros incrustados, La figura 1E muestra un soporte de gel para microscopía de lámina de luz, y La figura 1F representa la línea de tiempo de un experimento típico. Los detalles comerciales de los reactivos y el equipo utilizado se enumeran en la Tabla de Materiales.
1. Disección y fijación del cerebro de la mosca
<ol>
	<li>Diseccionar cerebros de moscas o SNC en medio frío S2 (para más detalles de disección, ver reference21)</li>
	<li>Para fijar los cerebros, agregue hasta 20 cerebros o 10 SNC a 2 mL de PFA/PBS frío al 4% e incube durante la noche en un nutator a 4 ° C. 
	PRECAUCIÓN: El PFA es dañino si se ingiere o inhala, irrita la piel y los ojos, y puede ser cancerígeno.</li>
	<li>Enjuague la muestra (1x) con 2 mL de PBT frío (0,5%, ver Tabla Complementaria 4), luego lave la muestra con 2 mL de PBT frío (4x) durante 15 min en un nutator a 4 °C.</li>
	<li>Enjuague la muestra (1x) con 2 mL de EtOH frío al 70%. Almacene los cerebros en 2 mL de EtOH al 70% a 4 °C durante un máximo de 6 meses.</li>
</ol>
2. Montaje de cerebros y adición de ARN y enlazadores de proteínas (Día 1)
NOTA: Use guantes en todo momento y limpie constantemente el equipo y el espacio de trabajo con RNase Away. Se requieren guantes (1) para mantener las RNasas alejadas de las muestras y (2) como protección contra varios reactivos que representan un peligro para la salud.
<ol>
	<li>Prepare las cámaras de gel limpiando un portaobjetos sin carga con un reactivo de descontaminación de RNasa. Retire la película opaca que protege el adhesivo de la junta de silicona, adhiera la junta (con hasta 4 cámaras) al portaobjetos y recubra cada superficie de la cámara con 1 μL de polilisina con una punta de pipeta P20. Secar al aire y repetir el proceso. 
	NOTA: El paso 2.1 se puede realizar el día anterior.</li>
	<li>Transfiera los cerebros a un tubo de PCR de 0,2 ml (hasta 4 cerebros por tubo) y rehidrate durante (2x) 5 min en 150 μL de PBT (0,1%) y (2x) durante 5 min en PBS.</li>
	<li>Para montar los cerebros, agregue 40 μL de PBS por cámara, luego pegue suavemente los cerebros en una fila en el centro de la cámara con pinzas finas, dejando algo de espacio entre los cerebros (ver Figura 1D). Es posible montar hasta 6 cerebros o 2 CNS por cámara.</li>
	<li>Retire el PBS y añada inmediatamente 50 μL de tampón MOPS de 20 mM. Incubar durante 30 min a temperatura ambiente (RT).</li>
	<li>Mientras los cerebros se equilibran en el tampón MOPS, descongele las soluciones madre de Melphalan-X y Ac-X y prepare 75 μL de solución de Melphalan-X/Ac-X por cámara (diluya el stock de Melphalan-X 1:1 con el tampón MOPS y agregue Ac-X a 1:100). Vórtice y gire brevemente para recoger la solución; Cronometre la preparación de manera que la solución esté lista al final del tiempo de incubación de 30 minutos, no antes. 
	PRECAUCIÓN: Melphalan-X es dañino si se ingiere o inhala, irrita la piel y los ojos, y puede ser cancerígeno.</li>
	<li>Retire todo el tampón MOPS y agregue 50 μL de solución Melphalan-X/Ac-X.</li>
	<li>Cubra la cámara colocando un cubreobjetos en la parte superior, pero no use el adhesivo de la junta para sellar. Coloque la cámara en una caja humidificada e incube protegida de la luz durante la noche en RT.</li>
</ol>
3. Gelificación y digestión de la proteinasa K (Día 2)
<ol>
	<li>Retire con cuidado el cubreobjetos y Melphalan-X/Ac-X, y lave los cerebros montados (2 veces) durante 2 minutos con 100 μL de PBT (0,1%) y (1 vez) durante 2 minutos con 100 μL de PBS.</li>
	<li>Descongele la solución TREx-1000, 4HT, TEMED y APS y manténgala en hielo. 
	NOTA: TREx-1000 puede precipitar a -20 °C; pozo de vórtice para disolverse completamente después de la descongelación. 
	PRECAUCIÓN: Estos reactivos son dañinos o tóxicos cuando se ingieren o se inhalan, así como irritantes para la piel y los ojos.</li>
	<li>Prepare la solución de gel mezclando TREx-1000 con 4HT, TEMED y APS en una proporción de 94:2:2:2. Vórtice y manténgase en el hielo. Para cada cámara, prepare 150 μL de solución de gel.</li>
	<li>Retire el PBS de la cámara con una punta de pipeta y absorba con cuidado los restos de PBS con una toallita sin pelusa. Para cada cámara, agregue inmediatamente 40 μL de solución de gel encima de los cerebros. Incubar a 4 °C durante 10 min.</li>
	<li>Retirar la solución de gel y añadir 40 μL de solución de gel fresca, incubando a 4 °C durante otros 10 min. 
	NOTA: Recoja la solución de desecho de gel en un tubo de microcentrífuga y polimerice antes de desecharla.</li>
	<li>Retire la solución de gel y retire la película protectora transparente del adhesivo de la superficie de la junta. Agregue 45 μL finales de solución de gel fresco, coloque suavemente un cubreobjetos sobre la cámara y evite atrapar burbujas de aire. Presione el cubreobjetos para sellar la cámara e incubar a 4 °C durante 10 min (para un total de 30 min de equilibrio a 4 °C).</li>
	<li>Polimerizar el gel a 37 °C durante 1,5 h.</li>
	<li>Una vez que los geles se hayan endurecido, déjalos enfriar en el banco durante unos minutos. Retire con cuidado el cubreobjetos y retire la junta de silicona con una hoja de afeitar nueva. A continuación, recorta el gel en un rectángulo y corta la esquina superior derecha para seguir la orientación de la muestra.</li>
	<li>Retire los geles del portaobjetos con un pincel fino humedecido con una pequeña cantidad de ProK Buffer y transfiéralos individualmente a tubos de microcentrífuga de 2 mL.</li>
	<li>Incubar cada gel con 500 μL de tampón ProK y 5 μL de enzima ProK (1:100) a 37 °C durante la noche.</li>
</ol>
4. Digestión del ADN e hibridación de sondas (Día 3)
<ol>
	<li>Lave los geles (3x) durante 10 min con 1 mL de PBS a RT. 
	NOTA: Utilice pipetas de transferencia de punta fina para evitar dañar el gel cuando reemplace las soluciones.</li>
	<li>Incubar geles durante 30 min en 1 mL de tampón DNasa1 a 37 °C.</li>
	<li>Agregue 50 μL de enzima DNasa1 a 450 μL de tampón DNasa. Mezcle suavemente, pero no haga vórtice. Incubar cada gel en 500 μL de DNasa1 durante 2 h 37 °C. Lavar (4x) 15 min con 1 mL de PBS a RT. 
	NOTA: Los geles pueden almacenarse en 5x SSC a 4 °C antes o después de la digestión/lavado de DNasa durante varias semanas.</li>
	<li>Hibridación de descongelación (hyb) y tampón de lavado de la sonda. Incubar los geles en 500 μL de tampón hyb sin sondas durante 30 min a 37 °C. 
	PRECAUCIÓN: El tampón de lavado de hyb y sonda contiene formamida, que se sospecha que causa cáncer.</li>
	<li>Diluir las sondas 1:100 en tampón hyb (10 nM), preparando 300 μL por gel. Incubar los geles con tampón hyb y sondas durante la noche a 37 °C. Mantener el tampón de lavado de la sonda y el PBS a 37 °C.</li>
</ol>
5. Lavados de sonda (Día 4)
<ol>
	<li>Lavar los geles (3x) durante 30 min con 750 μL de tampón de lavado de sonda a 37 °C.</li>
	<li>Lavar los geles (3x) durante 30 min, luego (3x) durante 1 h con 1 mL de PBS a 37 °C.</li>
	<li>Lave los geles en 2 mL de PBS a RT durante la noche o a 4 °C durante el fin de semana.</li>
</ol>
6. Reacción en cadena de hibridación (HCR) con horquillas fluorescentes (Día 5)
NOTA: Para el principio HCR, véase reference22.
<ol>
	<li>Incubar los geles en 500 μL de tampón de amplificación (amp) durante 30 min a RT.</li>
	<li>Caliente las horquillas fluorescentes a 95 °C durante 90 segundos en una máquina de PCR y enfríe rápidamente a 25 °C durante 30 minutos.</li>
	<li>Para cada sonda, diluya los pares de horquillas correspondientes (h1 y h2) 1:50 en tampón amperio, preparando 300 μL por gel y vórtice.</li>
	<li>Incubar los geles con la mezcla de horquilla durante 3 h a RT en la oscuridad.</li>
	<li>Lave los geles (2x) durante 15 min con 750 μL de SSCT 5x y (2x) durante 30 min con 1 mL de SSCT 0.5x a RT.</li>
	<li>Si los cerebros expresan GFP, teñir con 500 μL de anticuerpo anti-GFP-AF488 (1:500) en PBT (0,1%) que contenga 5 mg/mL de BSA ultrapuro e incubar durante la noche (o durante el fin de semana) a 4 °C.</li>
</ol>
7. Montaje de geles e imágenes (Día 6)
<ol>
	<li>Después de la incubación de anticuerpos, enjuague los geles una vez y lave (1 vez) durante 30 min con 1 mL de PBT (0,1%), seguido de (3 veces) durante 30 min con 1 mL de PBS. 
	NOTA: El lavado en PBS resultará en una expansión 2x; para una expansión de 3x, lavar con SSC 0.05x.</li>
	<li>Durante el lavado, cubra la superficie de fijación del gel del soporte de gel para microscopio de lámina ligera dos veces con 1 μL de polilisina, dejando que se seque a 37 °C entre capas. De manera similar, para imágenes confocal, cubra el área de fijación del gel de un plato con fondo de vidrio con aplicaciones repetidas de polilisina.</li>
	<li>Teñir los geles durante 30 min a RT en 1 mL de 5 μg/mL DAPI/PBS o DAPI/0,05x SSC, o alternativamente, teñir durante la noche a 4 °C.</li>
	<li>Para montar el gel en el soporte de gel (microscopio de lámina de luz) o en el plato con fondo de vidrio (microscopio confocal), coloque el gel en un cubreobjetos y seque cuidadosamente los bordes con una toallita sin pelusa. Asegúrese de que el gel esté orientado de manera que el tejido esté lo más cerca posible del objetivo. Con un pincel, coloque suavemente el gel sobre la superficie de polilisina con un solo movimiento. Para la toma de imágenes, bañe el gel en PBS (o 0.05x SSC si se expande a 3x). 
	NOTA: Después de la toma de imágenes, los geles se pueden eliminar suavemente de la superficie de polilisina con un pincel húmedo y transferirse a un tubo de microcentrífuga de 2 mL.</li>
	<li>Para un nuevo sondeo inmediato, proceda al día 7. Para un almacenamiento a largo plazo (de 1 semana a 6 meses), almacene los geles en 1 ml de 5x SSC a 4 °C. Cuando esté listo para usar, lave los geles (3x) durante 10 minutos con 1 mL de PBS antes de continuar. 
	NOTA: El grado de expansión es generalmente consistente en los búferes descritos (~2x en PBS y ~3x en 0.05x SSC). Para comprobar el factor de expansión, mida el tamaño de un cerebro antes y después de la expansión en imágenes tomadas con un microscopio estereoscópico de fluorescencia. Para visualizar el cerebro después de la expansión, tiñe brevemente con DAPI. El factor de expansión aproximado es el tamaño posterior a la expansión dividido por el tamaño previo a la expansión.</li>
</ol>
8. Desmontaje de sondas y horquillas para multiplexación (Día 7)
<ol>
	<li>Incubar los geles durante 30 min en 1 mL de tampón DNasa1 a 37°C.</li>
	<li>Añadir 50 μL de DNasa1 a 450 μL de tampón de DNasa. Mezcle suavemente, pero no haga vórtice. Incubar los geles en 500 μL de DNasa1 durante 2 h a 37 °C.</li>
	<li>Lavar (4 veces) durante 15 minutos con 1 mL de PBS en RT. Los geles ya están listos para la siguiente ronda de hibridación (Día 3, paso 6).</li>
</ol>

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</ol>

No se declaró ningún conflicto de intereses.

El protocolo EASI-FISH descrito para el sistema nervioso intacto de Drosophila permite la detección de docenas de transcripciones en el mismo cerebro o SNC. Es robusto, sencillo y sensible, y se puede combinar con la detección de GFP para identificar subconjuntos de neuronas o glía. Dado que este método es fácil de implementar, debería facilitar la investigación de los laboratorios de Drosophila con interés en mapear y cuantificar la expresión génica en el cerebro intacto de la mosca.
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FISH se utilizó por primera vez en Drosophila hace más de 40 años para mapear genes en cromosomas politeno1,2. Hoy en día, FISH de una sola molécula es el estándar de oro para localizar y cuantificar espacialmente las transcripciones de ARNm en tejido intacto3. Sin embargo, debido a problemas de integridad de la muestra y pérdida de ARN, las técnicas FISH de molécula única de montaje completo en Drosophila se han limitado a solo unos pocos genes que se pueden analizar en la misma muestra4,5,6,7. Si bien el reciente desarrollo de los códigos de barras (por ejemplo8,9,10) aumenta el número de transcripciones que se pueden detectar hasta varios cientos incluso en tejido grueso11,12, el establecimiento de tales protocolos requiere una inversión considerable de recursos, lo que podría ser un obstáculo para la implementación. De hecho, muchas técnicas transcriptómicas espaciales inventivas nunca se extendieron más allá de sus instituciones de origen13. Por lo tanto, un método sencillo y comparativamente barato para detectar la expresión de docenas de genes en el mismo cerebro intacto facilitaría varios objetivos de investigación: validación de la secuencia de ARN y datos de atlas celulares, mapeo de tipos de células moleculares en todo el SNC, cuantificación de las diferencias de desarrollo, sexo o especies específicas en la expresión génica, o medición de los cambios en la expresión génica inducidos por la gran variedad de perturbaciones genéticas o ambientales disponibles en Drosophila. 
La microscopía de expansión es una técnica que permite a los investigadores observar tejidos a mayor resolución expandiéndolos en un hidrogel hinchable14. EASI-FISH combina la microscopía de expansión y el ARN FISH15, que utiliza la reacción en cadena de hibridación (HCR), una técnica no enzimática para detectar la unión de la sonda de oligonucleótidos16. EASI-FISH se desarrolló por primera vez como un enfoque alternativo a FISH de tejido fino para mapear patrones de expresión de docenas de genes en cortes de tejido gruesos (300 μm) de hipotálamo lateral de ratón17. Este método es ideal para su aplicación en cerebros de moscas adultas, dado que este tejido tiene menos de 300 μm de grosor, y recientemente se ha descrito un prototipo de protocolo EASI-FISH para moscas18. Aquí, los cerebros de Drosophila disecados y fijados se incrustan en un hidrogel hinchable, donde el ARNm y las proteínas se anclan covalentemente al polímero de gel con los agentes alquilantes Melfalán-X y Acriloil-X (Ac-X), respectivamente. Después de la digestión de proteínas, que permite la expansión isotrópica del cerebro, las sondas de oligonucleótidos de ADN específicas de genes se hibridan con el ARNm en el tejido para localizar las transcripciones de interés. A continuación, se añaden horquillas de ADN marcadas con fluorescencia en un segundo paso de hibridación. Múltiples moléculas de horquilla se polimerizan en la reacción HCR para formar polímeros de ADN metaestables. Esto conduce a una amplificación de la señal para transcripciones individuales, que pueden detectarse como puntos brillantes mediante microscopía de lámina de luz o confocal.
El anclaje covalente del ARNm y la proteína a la matriz de gel y la digestión proteolítica de las proteínas después de la formación del gel crean un entorno en el que las transcripciones de ARNm son relativamente estables y potencialmente más accesibles para la unión de sondas. La estabilidad del ARNm y el gel permite múltiples rondas de resondeo e imagen, con la extracción de las sondas de ADN y el producto HCR mediante incubación con la enzima DNasa1 entre rondas15,17. Además, la expansión de la muestra reduce la autofluorescencia y la dispersión de la luz por desagrupamiento molecular y aumenta efectivamente la resolución de la imagen14. Por lo tanto, las transcripciones individuales de ARNm se pueden resolver más fácilmente.
GFP sostiene el procedimiento lo suficiente como para seguir siendo detectable por fluorescencia o unión de anticuerpos post-expansión. Por lo tanto, este reportero se puede utilizar para marcar y segmentar los tipos de celdas de interés. Junto con las muchas líneas de controladores GAL4 divididos específicos de neuronas disponibles (por ejemplo, 19,20), esto abre la posibilidad de obtener más información sobre la identidad molecular de un tipo neuronal o identificar subtipos moleculares que no se pueden distinguir fácilmente por su anatomía.
Aquí se describe una versión actualizada del prototipo fly EASI-FISH protocol18 que presenta una excelente retención de ARNm, eliminación de dificultades técnicas y mayor robustez del gel. Las modificaciones incluyen el aumento de la concentración de PFA, la disminución de la temperatura de fijación y la facilitación de la preparación de la muestra mediante el montaje de los cerebros antes de la incubación con Melphalan-X y Ac-X. Este protocolo también incorpora una nueva receta de gel para aumentar la robustez del gel, lo que reduce eficazmente el daño del gel al realizar muchas rondas de FISH e imágenes. Estas modificaciones hacen que el protocolo sea más sencillo de realizar, lo que reduce tanto el tiempo de procesamiento como el uso de reactivos, y mejora la confianza en los resultados consistentes. Es importante destacar que la capacidad de multiplexación se incrementa de tal manera que se pueden investigar docenas de genes en el mismo cerebro durante un período de meses. Esto se ilustra mediante los patrones de expresión de varios genes neuronales en el cerebro adulto de Drosophila en una gama de niveles de expresión.

<table><tbody><tr><td>Tubos de PCR de 0,2 mL&nbsp;</td><td>Científico de EE. UU.&nbsp;</td><td>1402-4700</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga con tapón de rosca de 0,5 mL, Amber</td><td>USA Scientific&nbsp;</td><td>1405-9707</td><td></td></tr><tr><td>0.5M EDTA, PH 8, libre de RNasa</td><td>Invitrogen</td><td>AM9260G</td><td></td></tr><tr><td>10M NaOH</td><td>Sigma</td><td>72068</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS&nbsp;</td><td>Fisher</td><td>BP 3994</td><td></td></tr><tr><td>20x SSC</td><td>ThermoFisher</td><td>AM 9763</td><td></td></tr><tr><td>40% Acrilamida&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>1610140</td><td></td></tr><tr><td>4-Hydroxy-TEMPO (4HT)</td><td>Sigma</td><td>176141</td><td></td></tr><tr><td>5 M NaCl sin RNasa&nbsp;</td><td>Thermofisher</td><td>AM97060G</td><td></td></tr><tr><td>5 ml Pipeta de transferencia- Punta fina</td><td>Global Scientific&nbsp;</td><td>134070-S20</td><td></td></tr><tr><td>Placa inferior de vidrio de 6 pocillos&nbsp;</td><td>Cellvis</td><td>P06-1.5H-N</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrilo, anhidro&nbsp;</td><td>ThermoFisher</td><td>042311-K7</td><td></td></tr><tr><td>Ácido acrílico</td><td>TCI</td><td>A0141</td><td></td></tr><tr><td>Acriloil-X&nbsp;</td><td>ThermoFisher</td><td>A20770</td><td></td></tr><tr><td>Persulfato de amonio (APS)</td>Tampón de amplificación <td>Sigma</td><td>A3678</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Instrumentos moleculares</td><td>https://store.molecularinstruments.com/new-bundle/rna-fish</td><td></td></tr><tr><td>DMSO anhidro</td><td>Invitrogen</td><td>D12345</td><td></td></tr><tr><td>AstA_B2</td><td>Instrumentos moleculares</td><td>PRR477</td><td></td></tr><tr><td>ChAT_B1</td><td>Instrumentos moleculares</td><td>PRG115</td><td></td></tr><tr><td>Crz_B5</td><td>Instrumentos moleculares</td><td>PRR480</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>FIJI</td> Código <td>abierto</td><td>https://imagej.net/software/fiji/</td><td></td></tr> <tr><td>FMRFa_B2</td><td>Molecular Instruments</td><td>PRR487 GAD1_B5</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Molecular Instruments</td><td>RTE581</td><td></td></tr><tr><td>GFP Anticuerpo policlonal, Alexa Fluor 488</td><td>ThermoFisher</td><td>A-21311</td><td></td></tr><tr><td>Tampón de hibridación</td><td>Instrumentos</td> <td>moleculares</td><td></td>https://store.molecularinstruments.com/new-bundle/rna-fish</tr><tr><td>Imaris Stitcher</td><td>Oxford Instruments</td><td>https://imaris.oxinst.com/products/imaris-stitcher</td><td></td></tr><tr><td>Imaris visor</td><td>Oxford Instruments https://imaris.oxinst.com/imaris-viewer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>JF-669, SE&nbsp;</td><td>Tocris</td><td>6420</td><td></td></tr><tr><td>Melphalan</td><td>Caymen Chemicals</td><td>16665</td><td></td></tr><tr><td>MOPs Buffer</td><td>Fisher</td><td>BP308-100</td><td></td></tr><tr><td>N,N Metileno-Bis-acrilamida&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>1610142</td><td></td></tr><tr><td>N,N,N',N'-tetrametiletilendiamina (TEMED)</td><td>Sigma</td><td>T22500</td><td></td></tr><tr><td>Agua libre de nucleasasa&nbsp;</td><td>Ambion</td><td>AM9932</td><td></td></tr><tr><td>Sondas de oligo&nbsp;</td><td>Instrumentos moleculares</td><td>https://store.molecularinstruments.com/new-bundle/rna-fish</td><td></td></tr><tr><td>paraformaldehído (PFA)</td><td>EMS</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Fisher&nbsp;</td><td></td><td></td>BP24384</tr><tr><td>Photoflo-200&nbsp;</td><td>EMS</td><td>74257</td><td></td></tr><tr><td>Hidrobromuro de poli-L-lisina (polilisina)</td><td>Sigma</td><td>P1524</td><td></td></tr><tr><td>Tampón de lavado de sonda</td><td>Instrumentos moleculares</td><td>https://store.molecularinstruments.com/new-bundle/rna-fish</td><td></td></tr><tr><td>proteinasa K&nbsp;</td><td>NEB</td><td>P8107S</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick Kit de eliminación de nucleótidos</td><td>Qiagen</td><td>28306</td><td></td></tr><tr><td>RNase Away&nbsp;</td><td>ThermoFisher</td><td>7003, reactivo</td><td></td>de descontaminación</tr><tr><td>sin RNasa DNasa1</td><td>Qiagen</td><td>79254</td><td></td></tr><tr><td>S2 Medio</td><td>ThermoFisher</td><td>21720024</td><td></td></tr><tr><td>Juntas de silicona&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>P24743</td><td></td></tr><tr><td>Tdc2_B5</td><td>Molecular Instruments</td><td>RTE880</td><td></td></tr><tr><td>Tk_B5</td><td>Molecular Instruments</td><td>PRR484</td><td></td></tr><tr><td>UltaPure 10% SDS</td><td>Thermofisher</td><td>15553027</td><td></td></tr><tr><td>Ultrapure BSA</td><td>ThermoFisher</td><td>AM2616</td><td></td></tr><tr><td>Horquillas no conjugadas y Alexa conjugadas con flúor</td><td>Instrumentos</td> <td>moleculares</td><td></td>https://store.molecularinstruments.com/new-bundle/rna-fish</tr><tr><td>VAChT_B1</td><td>Molecular Instruments</td><td>RTA904</td><td></td></tr><tr><td>vGLUT_B2</td><td>Molecular Instruments</td><td>RTB212</td><td></td></tr><tr><td>Zeis Z7 Soporte de gel&nbsp;</td><td>Janelia&nbsp;</td><td>Archivos CAD disponibles bajo pedido</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss LSM 980 confocal Microscopio invertido</td><td>Zeiss</td><td>https://www.janelia.org/node/46947/#lsm980</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Z7 Microscopio de lámina ligera</td><td>Zeiss</td><td>https://www.zeiss.com/microscopy/us/products/light-microscopes/light-sheet-microscopes/lightsheet-7.html</td><td></td></tr></tbody></table>

detección múltiple de la expresión génica en el cerebro intacto de drosophila mediante hibridación in situ de fluorescencia iterativa asistida por expansión

Multiplex Detection of Gene Expression in the Intact Drosophila Brain Using Expansion-Assisted Iterative Fluorescence In Situ Hybridization

Comprender la expresión génica es esencial para descifrar las funciones celulares. Sin embargo, los métodos para analizar la expresión de numerosos genes in situ dentro de un tejido determinado siguen siendo limitados. El protocolo EASI-FISH descrito aquí se ha adaptado para detectar la expresión de docenas de genes en el sistema nervioso central (SNC) de Drosophila adulto intacto utilizando reactivos disponibles en el mercado. Este protocolo incluye una nueva formulación de gel que mejora la robustez del gel, lo que permite múltiples rondas de hibridación y permite la incorporación de múltiples cerebros por gel. Esta mejora aumenta el rendimiento, facilita la comparación óptima de las condiciones experimentales y reduce los costos de los reactivos. Además, mediante el empleo del sistema GAL4-UAS para la codetección de la proteína verde fluorescente (GFP), la expresión génica se puede visualizar en tipos específicos de células neuronales o gliales. En particular, la alta resolución lograda a través de la microscopía de expansión, combinada con la sensibilidad del método, permite la detección de transcripciones de ARN único. Este enfoque integra eficazmente una alta calidad de imagen con un alto rendimiento, lo que lo convierte en una poderosa herramienta para estudiar la expresión génica en todo el cerebro intacto de la mosca.

El rendimiento de este protocolo EASI-FISH modificado se demuestra mediante la detección de la expresión de varios genes diferentes asociados a neurotransmisores y neuropéptidos en todo el cerebro de Drosophila adulta a lo largo de múltiples rondas. Típicamente, los cerebros gelificados y expandidos se hibridaron con dos o tres sondas por ronda, seguido de HCR con pares de horquillas conjugadas con Alexa Fluor (AF) 488 (a menos que se expresara GFP), AF546 y AF647 o Janelia Fluor (JF) 669. La adquisición de imág...

La hibridación in situ iterativa de fluorescencia asistida por expansión (EASI-FISH) es una técnica robusta que combina la microscopía de expansión con la hibridación in situ de fluorescencia (FISH) para detectar la expresión de múltiples genes en tejido grueso. Este protocolo describe los avances recientes en el método y su adaptación para etiquetar el sistema nervioso central intacto de Drosophila.

Detección múltiple de la expresión génica en el cerebro intacto de Drosophila mediante hibridación in situ de fluorescencia iterativa asistida por expansión

Understanding gene expression is essential for deciphering cellular functions. However, methods for analyzing the expression of numerous genes in situ ...

multiplex-detection-gene-expression-intact-drosophila-brain-using

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Doble fluorescencia In situ La hibridación en las secciones del cerebro fresco

Este video muestra la tinción de inmunofluorescencia de un cerebro transgénico de Drosophila para la obtención de imágenes de células gliales de una sola célula. El cerebro expresa proteínas dirigidas a la membrana fusionadas con diferentes combinaciones de epítopos antigénicos bajo el control de un sistema de recombinasa específico de la glía. Los cerebros aislados y fijos se tiñen con anticuerpos primarios específicos para los epítopos antigénicos, seguidos de anticuerpos secundarios...

Tinción de inmunofluorescencia de cerebros de Drosophila para la obtención de imágenes unicelulares de células gliales

Fuente: Jolly, S., et.al. Combinación de hibridación de doble fluorescencia in situ con inmunomarcaje para la detección de la expresión de tres genes en secciones de cerebro de ratón. J. Vis. Exp. (2016). Este video demuestra el uso de la hibridación in situ de doble fluorescencia para visualizar la expresión de dos dianas de ARN en secciones del cerebro de ratón. El protocolo implica la detección secuencial de ARN mediante sondas marcadas con isotiocianato de fluoresceína y digoxigenina,...

 Realización de hibridación in situ de doble fluorescencia para detectar la expresión génica en secciones del cerebro de ratón

Aquí se describe un fluorescente de todo el...

Todo el monte ARN fluorescente<em&gt; In situ</em&gt; La hibridación de<em&gt; Drosophila</em&gt; Los embriones

Se describe un montaje de todo el hibridación in situ procedimiento multi-objetivo cromogénico (MC-DESEO) en embriones de Drosophila intactos permitiendo la detección simultánea y específica de tres patrones de distribución de ARNm diferentes contrastando precipitados de color.

Multi-objetivo Cromogénico Todo el montaje<em&gt; In Situ</em&gt; La hibridación para comparar dominios de expresión génica en<em&gt; Drosophila</em&gt; Los embriones

La localización de la expresión génica a tipos específicos de células puede ser un desafío debido a la falta de anticuerpos específicos. En este trabajo describimos un protocolo para la detección simultánea de la triple expresión génica mediante la combinación de hibridación in situ de ARN de doble fluorescencia con inmunotinción.

La combinación de doble fluorescencia<em&gt; In Situ</em&gt; La hibridación con Immunolabelling para la detección de la expresión de tres genes en las secciones de cerebro de ratón

Células de mostrar diferentes morfologías y establecen una variedad de interacciones con sus vecinos. Este protocolo describe cómo revelar la morfología de las células y para investigar la interacción célula-célula mediante el bien establecido sistema de expresión de Gal4/UAS.

Aplicación de la técnica de FlpOut MultiColor para estudiar morfología unicelular de alta resolución y las interacciones de la célula de Glia en Drosophila

El RNA se describe en situ hibridación protocolo permite la detección de RNA en todo Drosophila embriones o tejidos disecados. Utilizando placas de microtitulación de 96 pocillos y amplificación de la señal tyramide, transcripciones pueden ser detectadas en el rendimiento, sensibilidad y alta resolución y a un costo relativamente bajo.

Alta resolución fluorescente In Situ hibridación en embriones de Drosophila y tejidos utilizando amplificación de la señal de Tyramide

Este protocolo describe los pasos necesarios para realizar la hibridación de hibridación fluorescente fluorescente in situ (HCR-FISH) en los lóbulos ópticos larvales de Drosophila melanogaster . Se detallan procedimientos para el diseño de la sonda, hibridación, amplificación y montaje de tejidos para facilitar la visualización del lóbulo óptico en desarrollo.

Reacción en cadena de hibridación FISH en el lóbulo óptico en desarrollo de Drosophila

Una demostración de la fabricación y el uso de un electrodo de succión extracelular para medir los registros electrofisiológicos de los cables de la columna vertebral de roedores recién...

Médula Espinal Electrofisiología II: Fabricación de electrodos de aspiración extracelular

Aprende el protocolo EASI-FISH para visualizar la expresión génica múltiple en cerebro intacto de Drosophila mediante hibridación in situ iterativa asistida por expansión. Este método permite mapear patrones espaciales de ARN con alta resolución.

Detección múltiple de la expresión génica en el cerebro intacto de Drosophila mediante hibridación in situ de fluorescencia iterativa asistida por expansión (Video) | JoVE Journal

Detección múltiple de la expresión génica en el cerebro intacto de Drosophila mediante hibridación in situ de fluorescencia iterativa asistida por expansión

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