Name: High Throughput Danio rerio Ensayo gasto energético (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-27T17:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 35 s
Description: Aprende a medir tasas metabólicas en larvas de Danio rerio mediante un ensayo fluorométrico de alto rendimiento con resazurina. Este método permite detectar pequeñas diferencias en el gasto energético para investigaciones sobre obesidad y homeostasis energética.

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Los autores desean agradecer a los Dres. Roger Cone y Chao Zhang por sus contribuciones para validar la aplicación de este ensayo tal como se publicó anteriormente. Este trabajo fue apoyado por NIH 1F32DK082167-01 (BJR).

Nota: Este protocolo sigue las directrices de la Universidad de Arizona Oficina para la Realización responsable de la investigación y ha sido aprobado por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional 1. cría de pez cebra y mantenimiento de embriones <ol><li> Preparar E3 medio embrión 8. Hacer 60x solución madre, disolver 34,8 g de NaCl, 1,6 g de KCl, CaCl 2 5,8 g ● 2H 2 O, y 9,78 g de MgCl 2 ● 6H 2 O en 1,95 L ddiH 2 O. Ajustar el pH a 7,2 con NaOH y HCl Ajustar el volumen a 2 L utilizando ddiH 2 O. </li><li> Para preparar el medio embrión 1x E3, diluir 16,5 ml 60x acciones en 1 L ddiH20. Añadir 100 l 1% de azul de metileno. </li><li> Cría <ol><li> Casa Masculino y Femenino cría de valores (7 - 18 meses de edad) por separado para maximizar la fecundidad. </li><li> Apague las luces 1 - 2 horas antes del día anterior se desean huevos. Configurar el apareamiento (1 macho y 1 - 2 hembras) en la cjaulas Rossing anteriormente descritos 9. Cruce de jaulas permiten los huevos para escapar de la depredación a medida que pasan a través de la base perforada de la inserción tanque en el que se llevan a cabo los peces adultos. </li><li> Opcional:. Para la reproducción programada, (como sería necesario para estudios con morfolino inyección), separar el macho y las hembras por un divisor de plástico transparente, Eliminar a esta por la mañana para dar lugar a la colocación oportuna de los huevos y la fertilización. Para morfolino estudios, realizar cálculos de potencia para evaluar el número de peces embrionaria requerido por tratamiento. Sin una estimación de la magnitud del efecto o variación, un ensayo preliminar se puede ejecutar con un n = 8. </li></ol></li><li> Verter los huevos de la jaula de cruce en una placa de Petri (100 - 150 embriones / 10 cm placa de Petri). Permitir que los huevos se depositan en el fondo del plato y verter fuera del agua. Retire cualquier resto de agua utilizando una punta fina transferencia desechables pipeta. Añadir espalda medio E3 embrión hecho en el paso 1.1. </li><li> Hacer afpipeta desechable pulido cojo para el futuro de huevo y la transferencia de los peces. Con unas tijeras, corte una pipeta de transferencia desechable se graduó en la graduación de 0,25 ml. Para eliminar los bordes ásperos, esmalte de la llama de la punta de corte sobre un mechero Bunsen. </li><li> Mantener peces embrionaria hasta 4 días después de la fertilización (dpf) en 10 cm placas de Petri en medio de embrión de pez cebra E3 28.5 ○ C. Dos veces al día, use una llama pulido graduó pipeta de transferencia desechable para eliminar los huevos no fertilizados o embriones muertos (de apariencia blanca opaca). Una vez que cada día, sustituya medio embrión E3. Vierta medio embrión E3, eliminar el líquido restante utilizando una punta fina transferencia desechables pipeta, y añadir de nuevo precalentado (28.5 ○ C) medio embrión E3. </li></ol> 2. Prepare la solución de ensayo <ol><li> Preparar la solución de ensayo de acuerdo con la Tabla 1. solución de ensayo de filtro estéril utilizando un filtro de 0,22 mM. Antes del ensayo de iniciación, calentar la solución de ensayo estéril en un 28,5 ○ Cbaño de agua. </li></ol><table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> Ingrediente </td><td> % del total </td><td> Volumen (l / 10 ml) </td></tr><tr><td> 60x E3 Embrión Medio </td><td> 1,667 </td><td> 166.7 </td></tr><tr><td> Doble desionizada (ddi) H 2 0 </td><td> 96.233 </td><td> 9623.3 </td></tr><tr><td> Alamar Blue </td><td> 1 </td><td> 100 </td></tr><tr><td> NaOH 400 mM </td><td> 1 </td><td> 100 </td></tr><tr><td> DMSO </td><td> 0.1 </td><td> 10 </td></tr></tbody></table> Tabla 1. Medio de Ensayo 3. Realizar Ensayo <ol><li> Enjuague embriones de pez cebra 3 veces con medio de embrión E3 filtrada estéril. Combine todos los embriones de pez cebra viables desde el embrague en un vaso. Filtro estéril 75 ml medio embrión E3. Usando una punta fina transferencia desechables pipeta, remover la mayor cantidad de medio de embrión E3 a partir de los embriones de pez cebra como sea posible. Añadir volver 20 ml de medio embrión E3 filtrada estéril. Retire y reemplace medio embrión E3 3 veces. </li><li> Placa 1 pescado en cada uno de los 93 pozos de un negro de 96 pocillos se puso del lado clara placa inferior. Transferir el pescado embrionaria a la placa mediante la captura individualmente un embrión dentro de una llama pulida pipeta de transferencia de plástico desechable se graduó (paso 1.5) y expulsar suavemente en el pozo. Traslado medio embrión E3 tomado del vaso que contiene el pescado se enjuaga en los 3 pozos en blanco. Esto asegura que los pozos en blanco han sido expuestas a la misma agua exacta que los pocillos que contienen pescado. Ambos pozos que contienen los peces y los pozos en blanco debe ser de al menos ½ completo (200 l) en la conclusión de este paso. </li><li> Reemplace medio embrión E3 con una solución de ensayo en los 96 pozos, incluyendo pozos en blanco. Este paso se debe realizar 1 columna a la vez para cada una de las 12 columnas en una placa de 96 pocillos. Usando una multa punta desechable transfer pipeta, retire medio de embrión E3 a partir de cada pocillo en una columna de la placa (8 pocillos). Tenga cuidado de no tocar el embrión de pez cebra. Añadir 300 l de solución de ensayo a cada pocillo de la que se elimina el agua. Repita la eliminación de medio de embrión E3 y el reemplazo con una solución de ensayo para todas las 12 columnas de la placa. </li><li> Opcional: Para probar el cambio de tasa metabólica en respuesta a un compuesto, hacer una solución que es 100 veces (100X) la concentración de tratamiento deseado. De nota, asegúrese de que la solución 100x no supere el 10% de DMSO para limitar la concentración final de DMSO a no más de 0,1%. Añadir 3 l de la solución 100x para cada uno de los pozos de tratamiento. NOTA: Realizar cálculos de potencia para evaluar el número de pozos de tratamiento. Sin embargo, sin una estimación de la magnitud de la respuesta o variación, un ensayo preliminar se puede ejecutar en 8 compuesto tratado y 8 pocillos de control tratados con el vehículo que contienen pescado. <ol><li> Añadir 3 l de control del vehículo al control (sin drug tratamiento) pozos que contienen peces. Para asegurar que la respuesta fluorescente compuesto es un resultado de las acciones dentro de los peces, aplicar tratamientos farmacológicos y de vehículos para 3 pozos en blanco en una placa de 96 pocillos. </li></ol></li><li> Leer pescado plato lleno de lector de placas fluorescente con la longitud de onda de excitación a 530 nm y longitud de onda de emisión a 590 nm. </li><li> Coloque la placa en la incubadora humidificado establece en 28,5 ○ C (mantener la placa en la oscuridad durante todo el ensayo para evitar photobleaching de la solución de ensayo). El ensayo se puede ejecutar para las duraciones de tiempo que van desde 1 hr a 24 hr. La duración del ensayo depende del objetivo del estudio. Para probar la respuesta a una corta compuesto no estable actuación corta duración puede ser más adecuado. Sin embargo, para las pruebas compuesto estable o pruebas de efectos genéticos, es preferible para explotar las ventajas asociadas con la señal acumulativa maximizar la duración del ensayo. </li><li> En un punto de tiempo predeterminado (consulte el paso 3.6 para ayudar a determinar el momento)leer la fluorescencia de la placa de peces llenos de nuevo con la misma configuración que el paso 3.5. </li></ol> 4. Evaluar el cambio relativo en la fluorescencia asociada con el tratamiento <ol><li> Calcular cambio en la fluorescencia de cada pocillo restando la fluorescencia en el tiempo 0 de la fluorescencia a la conclusión del estudio. Wells sin peces (espacios) deben tener valores cercanos a 0, muy por debajo de los valores de los pozos que contienen peces. Cambio en la fluorescencia = Fluorescencia en la conclusión - de fluorescencia en el tiempo 0 </li><li> Para determinar el cambio relativo en la fluorescencia, calcular el cambio medio en la fluorescencia de los pocillos de control luego dividen el cambio en la fluorescencia de cada pocillo por la variación media de la fluorescencia de los pocillos de control. Es de destacar que los controles podrían ser tanto los controles del vehículo o controles genéticos. <img alt="Ecuación 1" src="/files/ftp_upload/53297/53297eq1.jpg" /></li></ol>

<ol><li>Jao, L. E., Wente, S. R., Chen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+multiplex+biallelic+zebrafish+genome+editing+using+a+CRISPR+nuclease+system%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Efficient multiplex biallelic zebrafish genome editing using a CRISPR nuclease system.</a> PNAS. 110, 13904-13909 (2013).</li>
<li>Kimura, Y., Hisano, Y., Kawahara, A., Higashijima, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+generation+of+knock-in+transgenic+zebrafish+carrying+reporter%2Fdriver+genes+by+CRISPR%2FCas9-mediated+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Efficient generation of knock-in transgenic zebrafish carrying reporter/driver genes by CRISPR/Cas9-mediated genome engineering.</a> Sci. Rep. 4, 6545(2014).</li>
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<li>Flynn, E. J. 3rd, Trent , C. M., Rawls, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ontogeny+and+nutritional+control+of+adipogenesis+in+zebrafish+%28Danio+rerio%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+lipid+res%22%5BJournal%5D)">Ontogeny and nutritional control of adipogenesis in zebrafish (Danio rerio).</a> J. lipid res. 50, 1641-1652 (2009).</li>
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<li>Tingaud-Sequeira, A., Ouadah, N., Babin, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+obesogenic+test%3A+a+tool+for+screening+molecules+that+target+adiposity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+lipid+res%22%5BJournal%5D)">Zebrafish obesogenic test: a tool for screening molecules that target adiposity.</a> J. lipid res. 52, 1765-1772 (2011).</li>
</ol>

Los autores no tienen intereses financieros contrapuestos que divulgar.

La contaminación con bacterias u hongos limitará en gran medida la aplicación de este ensayo. El azul de metileno en el medio embrión E3 limita la posibilidad de contaminación por hongos. A lo largo del embrión criando es fundamental que se tenga cuidado para eliminar embriones muertos dos veces al día. Además, es esencial para enjuagar bien los embriones con medio de embrión E3 estéril en el día de la iniciación del ensayo. Estos 2 pasos limitan el potencial para la contaminación bacteriana de los embriones. La inclusi...

El ratón es actualmente el modelo predominante para la investigación de la obesidad. El intervalo generacional corto y herramientas genéticas disponibles en el ratón han sido sin igual hasta la fecha. Sin embargo, el pez cebra también tiene un intervalo de generación corto (3 - 4 meses) y supera incluso el ratón en la facilidad de manipulación genética 1,2. El pez cebra mantiene cerca del 90% de los genes de mamíferos, mientras que muy por encima del ratón en el número de para su uso en pantallas genéticas y drogas 3 potencial y descendencia. Para aprovechar el potencial del modelo de pez cebra para el estudio de la obesidad, los ensayos deben ser desarrollados para investigar los factores que influyen en la regulación del peso corporal, incluyendo el gasto de energía. Como metabolitos se procesan a través de β-oxidación y el oxígeno ciclo de ácido tricarboxílico se consume NADH y 2 se produce. Por lo tanto, NADH 2 es un indicador directo del flujo de metabolitos a través de las vías metabólicas de oxidación (metabolito). En poikilotherms, H + a través de fugas de la membrana mitocondrial interna, que desacopla la oxidación de NADH 2 la síntesis de ATP, es 4 - 5 veces más baja que en homeotermos 4. En consecuencia, en el pez cebra NADH 2 está muy estrechamente vinculada a la producción de ATP a través de la fosforilación oxidativa. En este documento, se describe un ensayo que mide NADH 2 la producción en larvas de pez cebra como un proxy para el gasto de energía 5. El consumo de oxígeno es el estándar de oro para medir el gasto de energía. Sin embargo, para aprovechar al máximo el alto potencial de rendimiento del pez cebra, los ensayos de gasto de energía deben ser susceptibles de alto rendimiento. Sistemas de consumo de oxígeno que dependen de una cámara cerrada sistema de circulación están limitadas en el rendimiento por el número de cámaras disponibles 6. Abrir aire consumo de O 2 / CO 2 ensayos de producción también se han aplicado en el pez cebra 5,7. Estos al aire libre de 96 pocillos placa basesistemas d son susceptibles de alto rendimiento. Desafortunadamente, el intercambio de gases con el medio ambiente limita la sensibilidad de estos ensayos. Hemos publicado recientemente la aplicación de un ensayo que monitoriza NADH 2 utilizando el indicador redox alamarBlue 5. Este ensayo supera las limitaciones en el rendimiento y la sensibilidad común a los análisis de consumo de oxígeno en el pez cebra. El pez cebra se está convirtiendo en un modelo cada vez más importante para el estudio de toda la homeostasis de la energía del cuerpo. En parte, porque el pez cebra son susceptibles de uso en pantallas adelante genéticos y las pantallas de drogas. Por otra parte, dirigida manipulación genética, incluyendo caída y knock-in, se puede aplicar rápidamente. Hemos demostrado anteriormente que este ensayo se puede combinar con la aplicación del fármaco bañera y desmontables genética o knockout para identificar compuestos y genes que alteran la tasa metabólica 5. Por otra parte, este ensayo está diseñado para explotar las ventajas de alto rendimiento inherentes al pez cebra. </p&gt;

<table><tbody><tr><td>AlamarBlue</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-230-103</td><td>Fabricado por Thermo</td></tr><tr><td>Scientific Pipeta de transferencia desechable de punta fina</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-711-26</td><td>Fabricado por Thermo</td></tr><tr><td>Scientific Fisherbrand Pipeta de transferencia desechable graduada</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-771-9AM</td><td>Fabricada por Thermo Scientific</td></tr><tr><td>Placas de 96 pocillos con fondo transparente de lados negros</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-320-785</td><td>Fabricado por E& K Productos Científicos Inc.</td></tr></tbody></table>

high throughput<em&gt; danio rerio</em&gt; ensayo gasto energético

High Throughput Danio Rerio Energy Expenditure Assay

El pez cebra son un importante organismo modelo con ventajas inherentes que tienen el potencial de hacer que el pez cebra un modelo ampliamente aplicado para el estudio de la homeostasis energética y la obesidad. El pequeño tamaño del pez cebra permite ensayos con embriones que se llevan a cabo en un formato de placa de 96 o 384 pocillos, tecnologías basadas Morfolino y CRISPR promueven facilidad de manipulación genética, y el tratamiento de drogas mediante la aplicación del baño es viable. Por otra parte, el pez cebra son ideales para pantallas adelante genéticos que permitan la novela de descubrimiento de genes. Dada la relativa novedad del pez cebra como modelo para la obesidad, es necesario desarrollar herramientas que explotan plenamente estos beneficios. En este documento, se describe un método para medir el gasto de energía en miles de pez cebra embrionarias simultáneamente. Hemos desarrollado una plataforma de microplacas animal completamente en que utilizamos placas de 96 pocillos para aislar peces individuales y evaluar la producción acumulada NADH 2 mediante el cultivo de células viabilidad re disponible en el mercadoagente alamarBlue. En poiquilotermos la relación entre NADH 2 la producción y el gasto de energía está estrechamente vinculado. Este ensayo gasto de energía crea el potencial para cribar rápidamente manipulaciones farmacológicas o genéticas que alteran directamente el gasto de energía o alteran la respuesta a un fármaco aplicado (por ejemplo, sensibilizadores a la insulina).

Solución de ensayo no aumenta la fluorescencia en ausencia de peces embrionario (Figura 1). Sin embargo, el ensayo es altamente sensible a pequeños cambios en la tasa metabólica dentro del pozo. Un solo pez dentro de un pozo crea una señal significativamente diferente de los pozos en blanco dentro de 1 h (P &lt;0,0001). La Figura 2 proporciona una representación visual de las señales generadas por los peces embrionario después de 24 h de incubación. Para el propósito de esta imagen se u...

El pez cebra es un importante organismo modelo para el estudio de la homeostasis energética. Mediante la utilización de un indicador redox sensible a NADH2, alamar Blue, hemos desarrollado un ensayo que mide la tasa metabólica de las larvas de pez cebra en un formato de placa de 96 pocillos y se puede aplicar al descubrimiento de fármacos o genes.

High Throughput<em&gt; Danio rerio</em&gt; Ensayo gasto energético

Zebrafish are an important model organism with inherent advantages that have the potential to make zebrafish a widely applied model for the study of ...

El objetivo general de este ensayo fluorométrico de alto rendimiento basado en resazurina es monitorear el efecto de manipulaciones genéticas o farmacológicas sobre la producción de NADH2, que constituye una medida de la tasa metabólica. Este método puede ayudarnos a responder preguntas clave en el campo de la obesidad, como el efecto de un fármaco o gen determinado sobre la tasa metabólica. Además, este ensayo puede aplicarse para detectar posibles interacciones entre fármacos o entre fármacos y genes en un sistema de animal completo.La principal ventaja de este ensayo, en comparación con los ensayos de consumo de oxígeno, es el alto rendimiento y la acumulación de la señal a lo largo del tiempo, lo que permite al usuario detectar pequeñas diferencias en la tasa metabólica. Este procedimiento será demostrado por Caroline Foy, una estudiante de posgrado en mi laboratorio. Después de preparar una solución stock de medio E3 al 60X según el protocolo descrito, prepare medio E3 al 1X diluyendo 16,5 mililitros de la solución stock con un litro de agua doblemente destilada.Luego, agregue 100 microlitros de azul de metileno al 1%. Para preparar una pipeta descartable con punta pulida al fuego para la transferencia de huevos y peces, use tijeras para cortar una pipeta graduada descartable en la graduación de 0,25 mililitros. Luego, para eliminar los bordes ásperos, use un mechero Bunsen para pulir al fuego la punta cortada.Después de establecer los cruces de pez cebra y recoger los huevos, permita que los huevos se asienten en el fondo del recipiente y vierta el agua. Utilice una pipeta desechable de punta fina para eliminar cualquier agua restante. Luego agregue nuevamente el medio E3.Incubar los peces embrionarios a 28,5 grados Celsius hasta cuatro días posteriores a la fertilización, o DPF. Dos veces al día, utilizar una pipeta desechable graduada pulida con llama para retirar los huevos no fertilizados o embriones muertos. Luego, una vez al día, verter el medio E3.Utilice una pipeta de transferencia de punta fina para eliminar cualquier medio restante y sustitúyalo por E3 fresco precalentado a 28,5 grados Celsius. Para realizar el ensayo de gasto energético, prepare la solución de ensayo siguiendo esta tabla. Filtre la solución con un filtro de 0,22 micrómetros para esterilizarla y caliente a 28,5 grados Celsius en un baño de agua para el ensayo.En una placa de Petri, combine todos los embriones viables de pez cebra procedentes de la puesta. Después de esterilizar por filtración 75 mililitros de medio E3, utilice una pipeta desechable de punta fina para eliminar la mayor cantidad posible del medio E3 de la placa de Petri. Añada nuevamente 20 mililitros de medio E3 estéril. A continuación, retire y reemplace el medio E3 estéril dos veces más.A continuación, utilizando una pipeta desechable plástica graduada con punta pulida con llama, transfiera peces embriones individuales a los pocillos de una placa de 96 pocillos. Trabajando con una columna de la placa a la vez, retire el medio E3 de los ocho pocillos de la primera columna, teniendo cuidado de no tocar los embriones con la pipeta de transferencia. Luego, agregue 300 microlitros de solución de ensayo a cada pocillo.Repita con las 12 columnas de la placa. Para incluir un tratamiento farmacológico, después de preparar una solución 100X del compuesto deseado, agregue tres microlitros a cada uno de los pocillos de tratamiento. Luego agregue tres microlitros de control del vehículo a los pocillos de control de los peces.Para asegurar que la respuesta de fluorescencia al compuesto sea resultado de la actividad dentro del pez, prepare tratamientos con fármaco y vehículo en tres pocillos vacíos cada uno en una placa de 96 pocillos. Ahora, utilizando un lector de placas de fluorescencia, con longitudes de onda de excitación y emisión de 530 nanómetros y 590 nanómetros respectivamente, lea los pocillos de la placa de peces. Coloque la placa en un incubador humectado a 28,5 grados Celsius.Dependiendo del ensayo y de la estabilidad del compuesto que se está probando, lea nuevamente la fluorescencia en un punto de tiempo predeterminado. Para evaluar el cambio relativo en fluorescencia, calcule el cambio promedio en fluorescencia de los pocillos de control. Luego, divida el cambio en fluorescencia de cada pocillo entre el cambio promedio en fluorescencia de los pocillos de control.A continuación se muestra un ejemplo del uso de dos columnas de una placa de 96 pocillos. Los pocillos de la columna A contienen peces cebra tratados con vehículo como control, mientras que los pocillos de la columna B contienen peces cebra tratados con insulina. En la tabla A, se muestra la fluorescencia medida en el tiempo cero.La tabla B contiene la fluorescencia medida 24 horas después. En la tabla C, se ha restado la fluorescencia en el tiempo cero de la fluorescencia a las 24 horas para evaluar el cambio en la fluorescencia. A continuación, calcule el cambio promedio en la fluorescencia en los pocillos de control.La tabla D muestra el cambio en la fluorescencia de cada pocillo individual, dividido entre el cambio promedio en los pocillos de control. Aquí puede observarse que el tratamiento con insulina a 10 micromolares provocó un aumento de 2,77 veces en la señal generada por los peces cebra durante 24 horas, con un valor P menor a 0,0001. Como se observa aquí, la solución del ensayo no cambia de color ni de niveles absolutos de fluorescencia en ausencia de embriones.Sin embargo, el ensayo es altamente sensible a pequeños cambios en la tasa metabólica dentro del pocillo. Esta figura representa las señales generadas por tilapias embrionarias tras incubar durante 24 horas. Los pocillos rosados indican peces con una tasa metabólica alta.Los pocillos púrpuras contienen peces con tasas metabólicas moderadas, y los pocillos azules representan una tasa metabólica baja. Esto también muestra la versatilidad de este ensayo y su aplicación en diversas especies de teleósteos. Dado que la reducción de alamar blue inducida por NADH2 es irreversible, la señal se acumula con el tiempo, lo que permite amplificar cambios pequeños.Se muestra aquí el cambio relativo en la fluorescencia inducida por uno a cinco peces a una, dos y cuatro horas. Con cada incremento en el número de peces, el cambio relativo en la fluorescencia aumenta significativamente con el tiempo, y cuanto mayor es el número de peces, mayor es la magnitud del cambio en la fluorescencia con el tiempo. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse con hasta 5.000 peces embrionarios por día.Al realizar este procedimiento, es importante recordar tener cuidado para evitar lesionar al pez embrionario. Después de llevar a cabo este ensayo, se pueden realizar otros procedimientos como la medición con rojo Nilo de lípidos neutros, o la medición del impulso fágico mediante la ingesta de paramecios marcados con fluorassay. Esto nos permite comparar la relación entre la tasa metabólica y el metabolismo de lípidos, o entre la tasa metabólica y el impulso fágico.Tras su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo del metabolismo energético y las enfermedades metabólicas estudiaran el gasto energético en el pez cebra sin limitaciones en el rendimiento. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo utilizar el reactivo fluorométrico resazurina para medir la producción de NADH2 en el pez cebra.

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Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Pez cebra representan un modelo vertebrado poderosa que ha sido infrautilizado para estudios metabólicos. Aquí se describe una forma rápida para medir...

Análisis del perfil metabólico de embriones de pez cebra

Se describe un protocolo para la detección in vivo de los efectos de los inhibidores mitocondriales en el organismo modelo Caenorhabditis elegans y para la identificación de compuestos potenciadores potenciales. Este protocolo se puede utilizar para analizar las bibliotecas de fármacos en busca de compuestos que modulen la función mitocondrial.

Un rastreable<em&gt; En Vivo</em&gt; Ensayo para mitocondrial Moduladores Usando transgénico bioluminiscente<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Se trata de una dieta alta en grasas alimentación protocolo para inducir obesidad en Drosophila, un modelo de mecanismos moleculares fundamentales comprensión implicados en la lipotoxicidad. También proporciona un análisis de alto rendimiento triacylglyceride para medir la acumulación de grasa en Drosophila y potencialmente otros modelos (insectos) en diversas condiciones de dieta, ambientales, genéticas o fisiológicas.

Alimentación dieta alta en grasas y alto rendimiento Triacylglyceride ensayo en Drosophila Melanogaster

Presentamos un protocolo para la medición de consumo de oxígeno y la acidificación extracelular en el cerebro de larvas y adultos de Drosophila melanogaster . Se utiliza un analizador metabólico con un protocolo adaptado y optimizado. Micro-tejido restricciones son un componente fundamental de este protocolo y fueron diseñadas y creadas específicamente para su uso en este análisis.

Análisis metabólico del cerebro adulto y Larval de Drosophila melanogaster

Esta técnica describe la grabación en tiempo real del consumo de oxígeno y los tipos de acidificación extracelular en los tejidos retinianos explanted ratón utilizando un analizador de flujo extracelular.

Medición del metabolismo energético en el tejido retiniano Explanted utilizando el análisis de flujo extracelular

La respiración mitocondrial es crítica para la supervivencia; por lo tanto, la tasa de consumo de oxígeno es un excelente indicador de la salud mitocondrial. En este protocolo, describimos el uso de un respirómetro comercialmente disponible a medida basal y las tasas de consumo de oxígeno máximo en vivo, intacto y libremente móviles elegans de Caenorhabditis.

Medición de las tasas de consumo de oxígeno en intacto Caenorhabditis elegans

Aquí, caracterizamos las respuestas de estrés proteotóxico celular en el nematodo C. elegans midiendo la activación de los reporteros transcripcionales fluorescentes y diciendo sensibilidad al estrés fisiológico.

Mediciones de las respuestas fisiológicas de estrés en C. Elegans

Este estudio presenta protocolos para dos enfoques semiautomatizado de análisis de actividad locomotora en gusanos gas-1(fc21)de la enfermedad de C. elegans complejo I, a saber, ZebraLab (un ensayo de rendimiento medio) y WormScan (un ensayo de alto rendimiento) y proporcionan un análisis comparativo entre una amplia gama de métodos de investigación para cuantificar el comportamiento de los nematodos y la función neuromuscular integrada.

Análisis comparativo de métodos experimentales para cuantificar la actividad animal en modelos de enfermedad mitocondrial de Caenorhabditis elegans

El ensayo de alimentación de microplacas ofrece un método económico y de alto rendimiento para cuantificar el consumo de alimentos líquidos en Drosophila. Un dispositivo impreso en 3D conecta una microplaca de 96 pozos en la que las moscas se alojan a una microplaca de 1536 pozos de la que las moscas consumen una solución de alimentación con un tinte trazador. La disminución del volumen de la solución se mide espectrofotométricamente.

Un ensayo de alimentador de microplacas de alto rendimiento para la cuantificación del consumo en Drosophila

Los microbios intestinales pueden afectar positiva o negativamente la salud de su huésped a través de mecanismos específicos o conservados. Caenorhabditis elegans es una plataforma conveniente para detectar tales microbios. El presente protocolo describe el cribado de alto rendimiento de 48 aislados bacterianos para determinar su impacto en la resistencia al estrés de los nematodos, utilizados como sustitutos de la salud de los gusanos.

Detección de alto rendimiento de aislados microbianos con impacto en la salud de Caenorhabditis elegans

Este protocolo describe un ensayo para cuantificar la tasa de alimentación de Caenorhabditis elegans basado en la medición del aclaramiento de bacterias en cultivo líquido.

Cuantificación de la ingesta de alimentos en Caenorhabditis elegans mediante la medición del aclaramiento bacteriano

Aprende a medir tasas metabólicas en larvas de Danio rerio mediante un ensayo fluorométrico de alto rendimiento con resazurina. Este método permite detectar pequeñas diferencias en el gasto energético para investigaciones sobre obesidad y homeostasis energética.

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