High Throughput Danio rerio Ensayo gasto energético

El pez cebra es un importante organismo modelo para el estudio de la homeostasis energética. Mediante la utilización de un indicador redox sensible a NADH₂, alamar Blue, hemos desarrollado un ensayo que mide la tasa metabólica de las larvas de pez cebra en un formato de placa de 96 pocillos y se puede aplicar al descubrimiento de fármacos o genes.

El objetivo general de este ensayo fluorométrico de alto rendimiento basado en resazurina es monitorear el efecto de las manipulaciones genéticas o farmacológicas en la producción de NADH2, que es una medida de la tasa metabólica. Este método puede ayudarnos a responder preguntas clave en el campo de la obesidad, como el efecto de un determinado fármaco o gen en la tasa metabólica. Además, este ensayo se puede aplicar para detectar posibles interacciones entre fármacos o entre fármacos y genes en todo un sistema animal.

La principal ventaja de este ensayo, en relación con los ensayos de consumo de oxígeno, es el alto rendimiento y la acumulación de señal a lo largo del tiempo, lo que permite al usuario detectar pequeñas diferencias en la tasa metabólica. Caroline Foy, una estudiante de posgrado en mi laboratorio, demostrará este procedimiento. Después de preparar una solución madre 60X de medio E3 de acuerdo con el protocolo de texto, prepare 1X medio E3 diluyendo 16,5 mililitros de caldo y un litro de agua destilada doble.

A continuación, añade 100 microlitros de azul de metileno al 1%. Para hacer una pipeta desechable de pulido de llama para la transferencia de huevos y pescado, use tijeras para cortar una pipeta de transferencia desechable graduada con una graduación de 0,25 mililitros. Luego, para eliminar los bordes ásperos, use un mechero Bunsen para pulir con llama la punta cortada.

Después de establecer cruces de pez cebra y recolectar huevos, deje que los huevos se asienten en el fondo del plato y vierta el agua. Utilice una pipeta de transferencia desechable de punta fina para eliminar el agua restante. A continuación, vuelva a añadir el medio E3.

Incubar el pez embrionario a 28,5 grados centígrados a cuatro días después de la fertilización, o DPF. Dos veces al día, utilice una pipeta de transferencia desechable graduada pulida con llama para extraer los óvulos no fertilizados o los embriones muertos. Luego, una vez al día, vierta el medio E3.

Utilice una pipeta de transferencia de punta fina para eliminar cualquier medio restante y reemplácela con E3 fresco precalentado a 28,5 grados centígrados. Para realizar el ensayo de gasto energético, prepare la solución del ensayo, siguiendo esta tabla. Utilice un filtro de 0,22 micrómetros para filtrar, esterilizar la solución y calentarla a 28,5 grados centígrados en un baño de agua para el ensayo.

En una placa de Petri, combine todos los embriones viables de pez cebra de la nidada. Después de esterilizar por filtro 75 mililitros de medio E3, utilice una pipeta de transferencia desechable de punta fina para eliminar la mayor cantidad posible de medio E3 de la placa de Petri. Vuelva a añadir 20 mililitros de E3 estéril. A continuación, retire y sustituya el E3 estéril dos veces más.

A continuación, utilizando una pipeta de transferencia desechable de plástico graduado pulido a la llama, transfiera peces embrionarios individuales a los pocillos de una placa de 96 pocillos. Trabajando con una columna de la placa a la vez, retire el medio E3 de los ocho pocillos de la primera columna, teniendo cuidado de no tocar los embriones con la pipeta de transferencia. A continuación, añada 300 microlitros de solución de ensayo a cada pocillo.

Repita con las 12 columnas del plato. Para incluir un tratamiento farmacológico, después de preparar una solución 100X del compuesto deseado, agregue tres microlitros a cada uno de los pocillos de tratamiento. Luego agregue tres microlitros de control de vehículos a los pozos de control de peces.

Para asegurarse de que la respuesta de fluorescencia al compuesto sea el resultado de la actividad dentro de los peces, configure tratamientos con medicamentos y vehículos en tres pocillos en blanco cada uno en una placa de 96 pocillos. Ahora, utilizando un lector de placas de fluorescencia, con longitudes de onda de excitación y emisión de 530 nanómetros y 590 nanómetros respectivamente, lea los pocillos de la placa de pescado. Coloque la placa en una incubadora humidificada a 28,5 grados centígrados.

Dependiendo del ensayo y de la estabilidad del compuesto que se está probando, vuelva a leer la fluorescencia en un momento predeterminado. Para evaluar el cambio relativo en la fluorescencia, calcule el cambio promedio en la fluorescencia para los pocillos de control. Luego divida el cambio en la fluorescencia de cada pocillo por el cambio promedio en la fluorescencia de los pocillos de control.

Este es un ejemplo del uso de dos columnas de una placa de 96 pocillos. Los pozos de la columna A incluyen el pez cebra de control tratado con vehículo, mientras que los pozos de la columna B incluyen el pez cebra tratado con insulina. En la tabla A se muestra la fluorescencia medida en el tiempo cero.

La tabla B contiene la fluorescencia medida 24 horas después. En la tabla C, la fluorescencia en el tiempo cero se ha restado de la fluorescencia a las 24 horas para evaluar el cambio en la fluorescencia. A continuación, calcule el cambio promedio en la fluorescencia en los pozos de control.

La Tabla D es el cambio en la fluorescencia de cada pozo individual, dividido por el cambio promedio en los pozos de control. Aquí se puede ver que el tratamiento con insulina a 10 micromolares provocó un aumento de 2,77 veces en la señal generada por el pez cebra durante 24 horas en un valor de P inferior a 0,0001. Como se ve aquí, la solución del ensayo no cambia el color ni los niveles absolutos de fluorescencia en ausencia de embriones.

Sin embargo, el ensayo es muy sensible a pequeños cambios en la tasa metabólica dentro del pocillo. Esta figura representa las señales generadas por la tilapia embrionaria después de incubar durante 24 horas. Los pozos rosados son indicativos de peces con una alta tasa metabólica.

Los pozos morados contienen peces con tasas metabólicas moderadas, y los pozos azules representan una tasa metabólica baja. Esto también muestra la versatilidad de este ensayo y su aplicación en todas las especies de teleósteos. Debido a que la reducción inducida por NADH2 del azul de alamar no es reversible, la señal se acumula con el tiempo, lo que permite amplificar pequeños cambios.

Aquí se muestra el cambio relativo en la fluorescencia inducida por uno a cinco peces a una, dos y cuatro horas. Con cada aumento en el número de peces, el cambio relativo en la fluorescencia aumenta significativamente con el tiempo, y cuanto mayor es el número de peces, mayor es la magnitud en el cambio de fluorescencia con el tiempo. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en hasta 5.000 peces embrionarios por día.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar tener cuidado para evitar lastimar a los peces embrionarios. Después de realizar este ensayo, se pueden realizar otros procedimientos como la medición del rojo del Nilo de lípidos neutros o la medición de la conducción fágica a través de la ingesta de paramecio marcado con fluorensayo. Esto nos permite comparar la relación entre la tasa metabólica y el metabolismo lipídico, o la tasa metabólica y el impulso fágico.

Tras su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo del metabolismo energético y las enfermedades metabólicas estudiaran el gasto energético en el pez cebra sin limitaciones en el rendimiento. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo usar el reactivo fluorométrico resazurina para medir la producción de NADH2 en el pez cebra.